大肠杆菌感受态细胞的制备和转化

1、 sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳（page）测定蛋白质分子量测定蛋白质分子量 分分子子生生物物学学2008实实验验一一. . 实验目的实验目的学习学习sds-pagesds-page测定蛋白质分子量测定蛋白质分子量的原理。的原理。掌握垂直板电泳的操作方法。掌握垂直板电泳的操作方法。运用运用sds-pagesds-page测定蛋白质分子量测定蛋白质分子量及染色鉴定。及染色鉴定。分分子子生生物物学学2008实实验验 二二 . .实验原理实验原理带电质点在电场中向带有异相电荷的电极移动，这种现带电质点在电场中向带有异相电荷的电极移动，这种现象称为电泳象称为电泳。电泳分类：移动界面电泳、

2、区带电泳、稳态电泳。电泳分类：移动界面电泳、区带电泳、稳态电泳。区带电泳是在半固相或胶状介质上加一个点或一薄层样区带电泳是在半固相或胶状介质上加一个点或一薄层样品溶液，然后加电场，分子在支持介质上或支持介质中品溶液，然后加电场，分子在支持介质上或支持介质中迁移。支持介质的作用主要是为了防止机械干扰和由于迁移。支持介质的作用主要是为了防止机械干扰和由于温度变化以及大分子溶液的高密度而产生的对流。温度变化以及大分子溶液的高密度而产生的对流。区带电泳使用不同的支持介质，早期有滤纸、玻璃珠、区带电泳使用不同的支持介质，早期有滤纸、玻璃珠、淀粉粒、纤维素粉、海砂、海绵、聚氯乙烯树脂；以后淀粉粒、纤维素粉

3、、海砂、海绵、聚氯乙烯树脂；以后有淀粉凝胶、琼脂凝胶、醋酸纤维素膜，现在则多用聚有淀粉凝胶、琼脂凝胶、醋酸纤维素膜，现在则多用聚丙烯酰胺（丙烯酰胺（pagepage）和琼脂糖凝胶。）和琼脂糖凝胶。分分子子生生物物学学2008实实验验pagepage根据其有无浓缩效应，分为连续系统根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类，连续系统电泳体系和不连续系统两大类，连续系统电泳体系中缓冲液中缓冲液phph值及凝胶浓度相同，带电颗粒值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。不连续系统中由于缓冲液离子成分，不连续系统中由于缓冲液离子成分，

4、phph，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。清晰度及分辨率均较前者佳。分分子子生生物物学学2008实实验验sds-sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进引进sdssds（十二烷基磺酸钠），（十二烷基磺酸钠）， sdssds能断裂分子内和分能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使子间氢键，破坏蛋白质的二级

5、和三级结构，强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的还原剂的sdssds溶液中，与溶液中，与sdssds分子按比例结合，形成带分子按比例结合，形成带负电荷的负电荷的sds-sds-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的的sdssds，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于白质分子之间天然的电荷差异，由于

6、sdssds与蛋白质的结合与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。当分子量在移速度取决于分子大小。当分子量在15kd15kd到到200kd200kd之间之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：式：logmw=k-bxlogmw=k-bx，式中：，式中：mwmw为分子量，为分子量，x x为迁移率，为迁移率，k k、b b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条

7、标准曲线，未知蛋白质在对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。线上求得分子量。分分子子生生物物学学2008实实验验 sdssds电泳的成功关键之一是电泳过程中，特别电泳的成功关键之一是电泳过程中，特别是样品制备过程中蛋白质与是样品制备过程中蛋白质与sdssds的结合程度。的结合程度。影响它们结合的因素主要有三个：影响它们结合的因素主要有三个：1)1)溶液中溶液中sdssds单体的浓度，当单体浓度大于单体的浓度，当单体浓度大于1mmol/l1mmol/l时大多数蛋白质与时

8、大多数蛋白质与sdssds结合的重量比结合的重量比为为1:1.41:1.4，如果单休浓度降到，如果单休浓度降到0.5 mmol0.5 mmol/l/l以下以下时，两者的结合比仅为时，两者的结合比仅为1: 0.41: 0.4这样就不能消除蛋这样就不能消除蛋白质原有的电荷差别，为保证蛋白质与白质原有的电荷差别，为保证蛋白质与sdssds的的充分结合，它们的重量比应该为充分结合，它们的重量比应该为1:41:4或或1:31:32)2)样品缓冲液的离子强度。样品缓冲液的离子强度。sdssds电泳的样品缓冲电泳的样品缓冲液离子强度较低，通常是液离子强度较低，通常是1010100mmol/l100mmol/

9、l3)3)二硫键是否完全被还原二硫键是否完全被还原分分子子生生物物学学2008实实验验采用采用sds-sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测蛋白质分子量时，只有完聚丙烯酰胺凝胶电泳法测蛋白质分子量时，只有完全打开二硫键，全打开二硫键， 蛋白质分子才能被解聚，蛋白质分子才能被解聚，sdssds才能定量地结合才能定量地结合到亚基上而给出相对迁移率和分子量对数的线性关系。因此在到亚基上而给出相对迁移率和分子量对数的线性关系。因此在用用sdssds处理样品同时往往用巯基乙醇处理，巯基乙醇是一种强处理样品同时往往用巯基乙醇处理，巯基乙醇是一种强还原剂，它使被还原的二硫键不易再氧化，从而使很多不溶性还原剂，它使被

10、还原的二硫键不易再氧化，从而使很多不溶性蛋白质溶解而与蛋白质溶解而与sdssds定量结合。定量结合。有许多蛋白质是由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链（如胰有许多蛋白质是由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链（如胰凝乳蛋白酶）组成的，它们在凝乳蛋白酶）组成的，它们在sdssds和巯基乙醇作用下，解离成和巯基乙醇作用下，解离成亚基或单条肽链，因此这一类蛋白质，测定时只是它们的亚基亚基或单条肽链，因此这一类蛋白质，测定时只是它们的亚基或单条肽链的或单条肽链的mwmw。已发现有些蛋白质不能用已发现有些蛋白质不能用sds-pagesds-page测定分子量。如电荷异常测定分子量。如电荷异常或构象异常的蛋白质

11、，带有较大辅基的蛋白质（某些糖蛋白）或构象异常的蛋白质，带有较大辅基的蛋白质（某些糖蛋白）以及一些结构蛋白，如胶原蛋白等。以及一些结构蛋白，如胶原蛋白等。一般至少采用两种方法测定未知样品的分子量，互相验证。一般至少采用两种方法测定未知样品的分子量，互相验证。分分子子生生物物学学2008实实验验三三. . 实验试剂和器材实验试剂和器材 1.材料：材料： 低分子量标准蛋白试剂盒低分子量标准蛋白试剂盒: 低分子量标准蛋白：低分子量标准蛋白： 兔磷酸化酶兔磷酸化酶b mw=97,400 牛血清白蛋白牛血清白蛋白 mw=66,200 兔肌动蛋白兔肌动蛋白 mw=43,000 牛碳酸酐酶牛碳酸酐酶 mw=

12、31,000 胰蛋白酶抑制剂胰蛋白酶抑制剂 mw=20,100 鸡蛋清溶菌酶鸡蛋清溶菌酶 mw=14,400 根据说明书处理标准蛋白根据说明书处理标准蛋白 样品：称样品：称3mg样品，加样品，加2 ml蒸馏水溶解。蒸馏水溶解。分分子子生生物物学学2008实实验验2.实验试剂实验试剂 (1) 30%丙烯酰胺（丙烯酰胺（acr）：称）：称acr30g，甲叉双丙烯酰胺，甲叉双丙烯酰胺 （bis）0.8g，加蒸馏水至，加蒸馏水至100ml，过滤后置棕色瓶中，过滤后置棕色瓶中， 4贮存可用贮存可用1-2月。月。（2）10%sds（十二烷基磺酸钠）（十二烷基磺酸钠）（3）1.5mol/l ph8.8 tr

13、is-hcl缓冲液：称取缓冲液：称取tris18.2g， 加入加入50ml水，用水，用1mol/l盐酸调盐酸调ph8.8， 最后用蒸馏最后用蒸馏 水定容至水定容至100ml。（4）1.0mol/lph6.8tris-hcl缓冲液：称取缓冲液：称取tris12.1g，加，加 入入50ml水，用水，用1mol/l盐酸调盐酸调ph6.8， 最后用蒸馏水最后用蒸馏水 定容至定容至100ml。（5）0.05mol/lph8.0tris-hcl缓冲液：称取缓冲液：称取tris0.6g，加，加 入入50ml水，用水，用1mol/l盐酸调盐酸调ph8.0，最后用蒸馏水定，最后用蒸馏水定 容至容至100ml。分

14、分子子生生物物学学2008实实验验（7）10%过硫酸铵过硫酸铵(ap)（8）temed（四甲基乙二胺）（四甲基乙二胺）（9）样品溶解液：）样品溶解液：sds（100mg）+巯基乙醇（巯基乙醇（0.1ml）+ 溴酚蓝（溴酚蓝（2mg）+甘油（甘油（2g） +0.05mol/l ph8.0tris- hcl（2ml），最后定容至），最后定容至10ml。（10）固定液：取）固定液：取50%甲醇甲醇454ml，冰乙酸，冰乙酸46ml混匀。混匀。（11）染色液：称取考马斯亮蓝）染色液：称取考马斯亮蓝r250 0.125g，加上述固定液，加上述固定液 250ml， 过滤后备用。过滤后备用。（12）脱色液：

15、冰乙酸）脱色液：冰乙酸75ml，甲醇，甲醇50ml，加蒸馏水定容至，加蒸馏水定容至1000ml。（13）电极缓冲液（内含）电极缓冲液（内含0.1%sds，0.05mol/ltris- 0.384mol/l甘甘氨酸缓冲液氨酸缓冲液ph8.3）：称）：称tris6.0g，甘，甘 氨酸氨酸28.8g，加入，加入sds1g，加，加蒸馏水使其溶解后定容至蒸馏水使其溶解后定容至1000ml。分分子子生生物物学学2008实实验验3. 实验器材实验器材垂直板电泳装置垂直板电泳装置直流稳压电源直流稳压电源移液管移液管滤纸滤纸 微量注射器微量注射器大培养皿大培养皿分分子子生生物物学学2008实实验验各部分凝胶配制

16、各部分凝胶配制分分子子生生物物学学2008实实验验四四. . 实验过程实验过程 1.1.将玻璃板用蒸馏水洗净晾干将玻璃板用蒸馏水洗净晾干, , 准备准备2 2个干净的个干净的锥形瓶锥形瓶. .2.2.把玻璃板在灌胶支架上固定好把玻璃板在灌胶支架上固定好. .固定玻璃板时，两边用力一定要均匀，防止夹固定玻璃板时，两边用力一定要均匀，防止夹坏玻璃板坏玻璃板. .3.3.按比例配好分离胶按比例配好分离胶, ,用移液管快速加入用移液管快速加入, ,大约大约5 5厘米左右厘米左右, ,之后加少许蒸馏水之后加少许蒸馏水, ,静置静置4040分钟分钟. .凝胶配制过程要迅速凝胶配制过程要迅速, , 催化剂催

17、化剂temedtemed要在注胶要在注胶前再加入前再加入, ,否则凝结无法注胶否则凝结无法注胶. .注胶过程最好一次注胶过程最好一次性完成性完成, ,避免产生气泡避免产生气泡. .分分子子生生物物学学2008实实验验 水封的目的是为了使分离胶上延平直，并隔绝水封的目的是为了使分离胶上延平直，并隔绝空气空气 凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面界面. .4.4.倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干, ,按比例配好按比例配好浓缩胶浓缩胶, ,连续平稳加入浓缩胶至离边缘连续平稳加入浓缩胶至离边缘5mm5mm处处, ,迅速迅速插入

18、样梳插入样梳, ,静置静置4040分钟分钟. . 样梳需一次平稳插入样梳需一次平稳插入, ,梳口处不得有气泡梳口处不得有气泡, ,梳底梳底需水平需水平. .分分子子生生物物学学2008实实验验5.5. 在上槽内加入缓冲液后在上槽内加入缓冲液后, ,拔出样梳拔出样梳。 要使锯齿孔内的气泡全部排出要使锯齿孔内的气泡全部排出, ,否则会影响加样效果否则会影响加样效果. .6 6、加样加样（1）取取10l标准蛋白溶解液于标准蛋白溶解液于ep管内，再加入管内，再加入10l 2倍样品缓冲液，上样量为倍样品缓冲液，上样量为10l。 （2）取取10l样品溶液，再加入样品溶液，再加入10l 2倍样品缓冲液，上样

19、倍样品缓冲液，上样量分别为量分别为5l和和3l。7.7.用微量注射器距槽底三分之一处进样用微量注射器距槽底三分之一处进样, ,加样前加样前, ,样品在样品在 沸水中加热沸水中加热3 3分钟，去掉亚稳态聚合。分钟，去掉亚稳态聚合。 注射器不可过低注射器不可过低, ,以防刺破胶体以防刺破胶体, ,也不可过高也不可过高, ,在样下在样下 沉时会发生扩散沉时会发生扩散. . 为避免边缘效应为避免边缘效应, ,最好选用中部的孔注样最好选用中部的孔注样. .分分子子生生物物学学2008实实验验8.8.电泳槽中加入缓冲液电泳槽中加入缓冲液，接通电源，进行电泳接通电源，进行电泳，开始电流恒，开始电流恒定在定在

20、10ma，当进入分离胶后改为，当进入分离胶后改为20ma，溴酚蓝距凝胶边缘，溴酚蓝距凝胶边缘约约5mm时，停止电泳。时，停止电泳。 9.9.凝胶板剥离凝胶板剥离与与染色染色：电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶板：电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶板做好标记后放在大培养皿内，加入染色液，染色做好标记后放在大培养皿内，加入染色液，染色1小时左右。小时左右。10.10.脱色：染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱脱色：染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白质区带清晰。色，直到蛋白质区带清晰。 剥胶时要小心剥胶时要小心, ,保持胶完好无损保持胶完好无损, ,染色要充分染色要充分.11.

21、11.实验结果分析实验结果分析。分分子子生生物物学学2008实实验验五五. .分析计算分析计算绘制标准曲线：绘制标准曲线： 按下式计算相对迁移率：按下式计算相对迁移率： 以每个蛋白标准的分子量对数对它的以每个蛋白标准的分子量对数对它的相对迁移率作图得标准曲线，量出未相对迁移率作图得标准曲线，量出未知蛋白的迁移率即可测出其分于量，知蛋白的迁移率即可测出其分于量，这样的标难曲线只对同一块凝胶上的这样的标难曲线只对同一块凝胶上的样品的分子量测定才具有可靠性。样品的分子量测定才具有可靠性。= 蛋白样品距加样端迁移距离（cm）溴酚蓝区带中心距加样端距离（cm） 相对迁移率分分子子生生物物学学2008实实

22、验验六六. .思考题思考题在不连续体系在不连续体系sds-pagesds-page中中, ,当分离胶加完当分离胶加完后后, ,需在其上加一层水需在其上加一层水, ,为什么为什么? ?样品溶解液中各种试剂的作用是什么样品溶解液中各种试剂的作用是什么? ?在不连续体系在不连续体系sds-pagesds-page中中, ,分离胶与浓缩分离胶与浓缩胶中均含有胶中均含有temedtemed和和ap,ap,试述其作用试述其作用? ?分分子子生生物物学学2008实实验验注意事项注意事项丙烯酰胺具有中等毒性。常人每天允许的丙烯酰胺具有中等毒性。常人每天允许的最大暴露量不超过最大暴露量不超过0.5g/kg，皮肤接触可，皮肤接触可致中毒，症状为红斑、脱皮、眩晕、动作致中毒，症状为红斑、脱皮、眩晕、动作机能失调、四肢无力等。机能失调、四肢无力等。丙烯酰胺是神经毒剂，可以透过皮肤丙烯酰胺是神经毒剂，可以透过皮肤不要接触皮肤，戴手套、口罩操作不要接触皮肤，戴手套、口罩操作分分子子生生物物学学2008实实验验没有聚合的丙烯酰胺不要倾倒到水源附近没有聚合的丙烯酰胺不要倾倒到水源附近一定要催化充分，使之完全聚合一定要催化充分，使之完全聚合集