L天冬酰胺酶的生产工艺

1、生工本生工本2009级级4班班刘培培刘培培2009251341820092513418l-天冬酰胺酶的生产工艺天冬酰胺酶的生产工艺logo（一）天冬酰胺酶的化学组成和性质（一）天冬酰胺酶的化学组成和性质 天冬酰胺酶是酰胺基水解酶，是大肠杆菌菌体中提取分离的酶类药物，用于治疗白血病。1922年clementi发现豚鼠血清中存在天冬酰胺酶；1953年kidd发现豚鼠血清中有抑癌作用的物质，其活性成分是蛋白质；1961年broome确定了其有效成分是天冬酰胺酶，后来，mashburn等报告指出从大肠杆菌中分离出天冬酰胺酶，具有同样抗癌活性。 天冬酰胺酶呈白色粉末状，微有湿性，溶于水，不溶于丙酮 三氯

2、甲烷 乙醚和甲醇，水溶液20储存7d，5储存14d均不减少酶的活力。干品50 15min酶活力降低30，60 1h内失活，最适ph8.5，最适温度37。 （二）国内天冬酰胺酶的发展历程（二）国内天冬酰胺酶的发展历程 目前,国内临床上应用的l2asp 主要来源于大肠杆菌,我国天津生化厂于1974 年开始生产e1coli天冬酰胺酶,但由于菌种产酶能力低,提取精制工艺落后,难以与国外产品竞争,再加之其他原因最后停产。为了填补国内空白,1995 年,中国药科大学吴梧桐教授等率先进行了e1coli 天冬酰胺酶ansb基因的克隆和表达研究,并首次在国内成功构建了高效表达l2asp 的基因工程菌pka/ c

3、pu210009 ,工程菌发酵单位比野生株高出100 倍。随后又优化了基因工程菌的培养条件和发酵工艺,确定了重组l2asp 的纯化路线,并对重组产品进行了鉴定。结果表明,基因工程菌生产的产品质量与天然品从基因序列、蛋白质一级结构到蛋白质的物理化学性质等方面均一致,两者具有同质性 。这些研究成果为我国工业化生产优质、低价的注射用e1colil2asp 开辟了新的道路。 （三）抗肿瘤机制 l2asp 抗肿瘤的作用机制在于它能够降低人 体内l2天冬酰胺和l2谷氨酰胺的浓度,这两种氨基胞缺乏天冬酰胺合成酶,不能合成l2天冬酰胺,需酸是合成嘌呤环和嘧啶环的重要组成部分。肿瘤细要摄取外源l2天冬酰胺才能存

4、活。当外源l2天冬酰胺被分解掉时,癌细胞合成核苷酸和蛋白质的能力就会显著降低,因此l2asp 能有效抑制肿瘤细胞的增殖。有研究表明, l2asp 能够选择性抑制体内ra2pamycin2靶标信号传导通路,从而抑制肿瘤的增值 。另有文献报道,l2asp 在体内发挥作用时可能是通过一种功能性的p53 蛋白因子来介导肿瘤细胞的凋亡 。（四）工艺流程 大肠杆菌产生的l2asp 包括l2asp 和l2asp ,其中l2asp 存在于细胞质中,与底物l2天冬酰胺的亲和力很小(km = 1 10 - 3 mol/ l) ,没有抗肿瘤活性;而l2asp 则分泌在细胞周质中,与l2天冬酰胺有很高的亲和力( km

5、 = 1 10 - 5 mol/ l) ,有抗癌活性3 。现今,产生l2asp 的菌种主要包括escherichia coli 、erwinia carotovara、serralia marcescem、pseudomonassp1、wolinella succinogenes 等。 主要采用的提纯方法包括硫酸铵分级沉淀、乙醇分级沉淀、离子交换层析法、超滤、水系二相胶束系统、分批式吸附和直行式解吸附法、渗透休克法以及亲和层析法等816 。采用不同方法最终得到目标产物的酶活力范围为220520157 u/ mg ,总回收率为31 %86 %。天冬酰胺酶工天冬酰胺酶工艺流程图艺流程图 大肠杆菌大

6、肠杆菌 肉汤菌种肉汤菌种 种子种子菌种菌种 发酵液发酵液 菌体菌体 提提取液取液 上清液上清液 沉淀沉淀 洗脱液洗脱液 洗脱液洗脱液 冻干冻干 l-天冬酰胺酶天冬酰胺酶菌种培养肉汤培养基37 48h玉米浆培养基37 4-8h种子培养发酵玉米浆培养基37 6-8h离心提取蔗糖抽提液ph7.5 30 分级沉淀（nh4)2so455饱和度ph7.0分级沉淀（nh4)2so490饱和度离子沉淀deae-纤维素(de52)离子交换cm-纤维素(cm52)工艺过程及要点工艺过程及要点1 菌种培养菌种培养采用大肠杆菌采用大肠杆菌escherichia coli a.s.1.357,培养基加牛培养基加牛肉汁肉

7、汁100ml,蛋白胨蛋白胨1g,氯化钠氯化钠0.5g,琼脂琼脂2-2.5g 37,在在试管中培养试管中培养24h，茄形瓶培养，茄形瓶培养8h，锥形瓶培养，锥形瓶培养16h。2 种子培养种子培养培养基用玉米浆培养基用玉米浆30kg，加水至，加水至300kg，接种量，接种量1%-1。5%，37，通气搅拌培养，通气搅拌培养4-8h.一、总述一、总述3 发酵罐培养发酵罐培养取玉米浆取玉米浆100kg，接种量，接种量8%，37，通气搅拌培，通气搅拌培养养6-8h，离心分离发酵液，得菌体加，离心分离发酵液，得菌体加2倍量丙酮倍量丙酮搅拌，压滤，滤饼过筛，自然风干成菌体干粉。搅拌，压滤，滤饼过筛，自然风干成

8、菌体干粉。4 蔗糖溶液抽提蔗糖溶液抽提将菌体细胞中加入将菌体细胞中加入5倍体积的蔗糖溶液（蔗糖倍体积的蔗糖溶液（蔗糖40%溶菌酶溶菌酶200mg/l,edta10mmol/l,ph7.5),30振振荡荡2h,8000r/min离心，收取上层酶液。离心，收取上层酶液。5 硫酸铵分级沉淀取上述酶液，加入（nh4)2so4至55%饱和度，调ph至7.0，室温搅拌1h，离心除去沉淀，取上清液加入（nh4)2so4到90%饱和度，离心收集沉淀。6 纯化将沉淀用50mmol/l,ph7.0磷酸缓冲液溶解并透析，透析后的酶液，通过预先用10mmol/l，ph7.6磷酸缓冲液平衡的deae-纤维素层析柱（1c

9、m30cm）,用30mmol/l磷酸缓冲液洗脱，流速为40ml/h,收集天冬酰胺酶活性组分，再调整ph4.8,通过预先用50mmol/l,ph4.9的磷酸缓冲液平衡的cm-纤维素层析柱（1cm8cm）,用50mmol/l,ph5.2的磷酸缓冲液洗脱，收集酶活性组分，冷冻干燥，即得l-天冬酰胺酶冻干粉，总收率为31%，比活为220u/mg蛋白。二、工艺流程图二、工艺流程图v （1 1）丝状菌三级丝状菌三级发酵工艺流程发酵工艺流程冷冻管（冷冻管（2525c c，孢子培养，孢子培养，7 7天）天）斜面母瓶（斜面母瓶（2525c c，孢子培养，孢子培养，7 7天）天）大米孢子（大米孢子（2626c c

10、，种子培养，种子培养56h56h）一级种子培养液（一级种子培养液（2727c c，种子培养，种子培养，24h24h）二级种二级种子培养液（子培养液（27262726c,c,发酵发酵,7,7天）天）发酵液。发酵液。（2 2）球状菌二级球状菌二级发酵工艺流程发酵工艺流程冷冻管（冷冻管（2525c c，孢子培养，孢子培养，6868天）天）亲米（亲米（2525c c，孢，孢子培养，子培养，810810天）天）生产米（生产米（2828c c，孢子培养，孢子培养，5660h5660h）种子培养液（种子培养液（2625-242625-24c c，发酵，发酵，7 7天）天）发酵液。发酵液。三、青霉素发酵过程三

11、、青霉素发酵过程v 青霉素发酵时，青霉素生产菌在青霉素发酵时，青霉素生产菌在合适的培养基、合适的培养基、phph、温度和通、温度和通气搅拌气搅拌等发酵条件下进行生长并合成青霉素。等发酵条件下进行生长并合成青霉素。v 发酵开始前，有关设备和培养基（主要是碳源、氮源、前体和发酵开始前，有关设备和培养基（主要是碳源、氮源、前体和无机盐等）必须先经过无机盐等）必须先经过灭菌灭菌，后接入种子。，后接入种子。v 在整个过程中，需要不断在整个过程中，需要不断通气和搅拌通气和搅拌，维持一定的罐温和罐压，维持一定的罐温和罐压，在发酵过程中往往要加入在发酵过程中往往要加入泡沫剂泡沫剂，假如酸碱控制发酵液的，假如酸

12、碱控制发酵液的phph，还需要间歇或连续的加入葡萄糖及铵盐等化合物以补充还需要间歇或连续的加入葡萄糖及铵盐等化合物以补充碳源及碳源及氮源氮源，或补进其他料液和前体等以促进青霉素的生产。，或补进其他料液和前体等以促进青霉素的生产。青霉素发酵过程中的代谢变化分为青霉素发酵过程中的代谢变化分为菌体生长、青霉素合成和菌体自溶菌体生长、青霉素合成和菌体自溶三个阶段。三个阶段。v菌体生长阶段菌体生长阶段：发酵培养基接种后生产菌在合适的环境：发酵培养基接种后生产菌在合适的环境中经过短时间的适应，即开始发育、生长和繁殖，直至中经过短时间的适应，即开始发育、生长和繁殖，直至达到菌体的临界浓度。达到菌体的临界浓度。 v青霉素合成阶段青霉素合成阶段：这个阶段主要合成青霉素，青霉素的：这个阶段主要合成青霉素，青霉素的生产速率达到最大，并一直维持到青霉素合成能力衰退生产速率达