消化性溃疡幽门螺杆菌感染与Toll样受体4基因多态性的相关性研究

1、消化性溃疡幽门螺杆菌感染与Toll样受体4基因多态性的相关性研究【关键词】 消化性 溃疡幽门螺杆菌感染 Toll样受体HP感染是引起人类慢性胃炎、消化性溃疡及胃癌等疾病的病因之一，但研究发现在HP感染者中仅有极少数会发生上述疾病。HP 致病机制与细菌数量、毒力以及环境因素、宿主易感性、胃肠黏膜内环境等有关。人类TLR4通过识别病原相关分子构型(PAMPs),激活先天性免疫应答机制，同时还诱导共刺激分子CD80的表达，为获得性免疫的启动提供活化信号，因此在免疫系统中有着十分重要的作用1。TLR4作为细菌脂多糖(LPS)的受体, 将LPS传导通路的信号迅速传至核内, 通过激活核因子-kB(NF-k

2、B), 刺激NO分泌, 消灭病原；还可促进炎性细胞因子表达与释放, 激活特异性免疫反应2。本研究通过探讨TLR4基因突变与HP感染相关性消化性溃疡的关系, 旨在为阐明HP 感染相关性消化性溃疡的遗传易感性和先天性免疫机制提供依据。1 临床资料1.1 一般资料于2006年7月至2007年6月间，在温州医学院附属第二医院消化内科，依据悉尼分类标准3收集消化性溃疡患者120例(胃溃疡51例、十二指肠球部溃疡69例)。其中男72例, 女48例；平均年龄52.2岁。正常体检者204例作为对照组, 男104例, 女100例；平均年龄39.2岁。1.2 方法(1)取外周静脉血5ml， EDTA抗凝，蛋白酶K

3、/酚/氯仿法提取基因组DNA。(2)PCR扩增目的基因，根据文献设计引物4如下。PCR反应体系25l，每侧引物各10pmol，dNTPs(10mmol/L)0.5l，DNA聚合酶1U,DNA模板1l(约40-100ng)。反应条件：94预变性3min，接着38个循环，94变性45s，51复性45s，72延伸45s，72终末循环5min，最后于4终止反应。PCR产物片段长度139bp或131bp，用2%琼脂糖凝胶电泳及紫外分析仪鉴定。(3)TLR4 Asp299Gly基因多态性分析：限制性内切酶消化PCR产物 酶切反应体系20l，含10l PCR()的产物，用BsaBI 内切酶0.5l(10U/

4、l)，于55消化酶切4h；取10l PCR() 的产物，用BstXI内切酶0.5l，于65消化酶切4h后 80灭活20min；酶切产物用8%的非变形聚丙烯酰胺凝胶电泳(100V,1.5h)分离，1硝酸银染色分析基因型；基因测序：部分PCR()及PCR() 产物经纯化后由上海生工生物工程服务有限公司进行DNA测序，测序样品作为阳性对照；消化性溃疡患者均采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定HP-IgG。同时采用胃窦黏膜组织快速尿素酶试验(pH值指示剂法), 检测HP感染。诊断HP感染参照安徽桐城会议通过的共识意见5, 2项均阳性诊断HP感染。正常体检者采用14C-尿素呼气试验, 检测HP感染，检

5、测前所有研究对象均未行抗HP治疗。1.3 统计学处理SPSS 11.5软件处理试验数据，采用2检验分析病例组和对照组Asp299Gly基因型频率及等位基因分布的差异，以及分析TLR4基因Asp299Gly基因型与HP感染相关性消化性溃疡之间的关系。P<0.05有显著性差异。2 结果浙江汉族人群中，TLR4基因Asp299Gly等位基因位点均为野生型A, 未见突变型G; A等位基因频率及AA基因型频率均为100%。消化性溃疡组及正常对照组TLR4基因Asp299Gly基因型频率，等位基因频率及携带者频率分布无显著性差异。TLR4基因Asp299Gly多态性与HP感染关系，消化性溃疡患者中H

6、P感染率为94.7%, 正常对照为60.1%; 两组中TLR4基因Asp299Gly基因型频率, 等位基因频率及携带者频率分布无差异,所有研究个体均为AA纯合子。参照文献结果6，将汉族人群TLR4基因Asp299Gly多态性与外国人群比较，发现TLR4基因Asp299Gly等位基因频率及基因型频率存在种族差异。汉族人和日本人该等位基因均为野生型A，未发现突变型G；与荷兰高加索人相比，等位基因频率及基因型频率具有显著性差异。AA基因型频率在中国浙江汉族人群(2=33.064，P=0.000，OR=1.183，95%CI:1.0801.296)及日本人群(2=42.682，P=0.0001，OR=

7、1.183，95%CI:1.1091.262)中显著高于荷兰人群；而荷兰人群等位基因A的频率明显高于中国人群(2=37.403，P=0.000，OR=1.098，95%CI:1.0471.151)及日本人群(2=42.597，P=0.000，OR=1.125，95%CI:1.0771.175)。由此可见中国及日本人群与荷兰高加索人TLR4基因Asp299Gly位点多态性分布存在显著性差异。3 讨论TLR是人类在进化过程中所保留的参与先天性抗感染的受体蛋白家族，具有高度保守性。TLR不仅通过识别病原微生物的PAMP, 激活先天性免疫反应, 还诱导共刺激分子CD80的表达，为获得性免疫的启动提供必

8、要的活化信号，因此在免疫系统中有着十分重要的作用。TLR超家族已发现有10个家族成员，其中TLR4、TLR2与宿主的免疫功能有着密切联系，可识别不同的病原分子。TLR4主要作为革兰阴性菌LPS的特异性受体，在LPS诱导的信号传导中起着重要作用，TLR2则主要作为革兰阳性菌的肽聚糖、酵母菌的甘露聚糖及某些特定的LPS的受体。TLR4接触不同的抗原分子后，通过协同分子CD14、LPS结合蛋白、MD2的共同作用，经由MyD88、TIRAP/MAL等信号传导途径，将LPS传导通路的信号迅速传至核内，激活NF-B通道，刺激NO分泌，消灭病原菌；此外，激活相关细胞因子的表达，释放炎症细胞因子，激活特异性免

9、疫反应，因而在机体的先天性免疫中起到十分重要的作用。Arbour等用单链构象多态性分析法(PCR-SSCP)和基因测序的方法发现了TLR4基因的非同义的单核甘酸多态性Asp299Gly和Thr399Ile，除体外转染研究证实Asp299Gly多态性与LPS的反应减低有关外，Asp299Gly和Thr399Ile等位基因杂合子和纯合子个体与野生型基因型的个体相比，吸入性LPS的气道反应明显减低。小鼠C3H/HeJ和C57BL/10ScCr株对LPS高度抵抗，缺乏先天性免疫的生物作用，易受感染,是由于小鼠TLR4基因突变导致对LPS无反应，或LPS信号传导异常所致。野生型TLR4的表达增强可使LP

10、S的信号增强。研究发现TLR4基因的突变可改变肠黏膜先天性免疫细胞和肠上皮TLR4分子结构，使机体的免疫系统失去正常处理肠腔内的大量细菌和LPS等病原分子的能力，进而使肠黏膜在长期的刺激下产生感染、炎症、过敏、易激乃至癌变。流行病学调查结果显示：人群中HP感染率与其社会经济地位关系密切， 发达国家成人HP感染率<40%,而我国人群感染率为20%80%，明显高于经济发达国家。本研究中, 正常浙江汉族人群HP感染率是60.1%, 与以上的研究结果一致。同时已有大量研究资料显示: HP感染率高的地区和国家人群的胃炎和消化性溃疡的发病率也较高，如经济落后国家同发达的欧美国家比较, HP感染相关性

11、胃炎和消化性溃疡的发病率也高。 通过对浙江汉族人群HP感染的检测, 发现消化性溃疡患者组HP感染率显著高于对照组(P0.000, OR=12.512,95%CI:5.25529.792)。本研究采用PCR限制性片段长度多态性分析的方法, 对120例消化性溃疡患者及204例正常对照者TLR4基因sp299Gly基因型及等位基因分布进行检测, 发现所有样本均为野生型基因型, 提示在中国浙江汉族人群中罕见TLR4基因Asp299Gly突变基因型。树突状细胞(DC)是重要的抗原提呈细胞，在机体免疫应答过程中起着至关重要的作用。目前研究发现胃黏膜上皮DC能穿过胃上皮细胞间的紧密连接, 到达胃黏液层与HP

12、接触7, HP能够特异性地定植于胃黏膜的黏液层下的上皮细胞表面；另发现在活体内胃上皮细胞可以表达TLR8。国外Bauditz 等对HP感染相关性胃炎进行研究, 发现LPS引起胃黏膜单核细胞分泌大量IL-12, 在胃粘膜上皮细胞表达的TLRs与HP的LPS相互作用后, 通过TLR4/CD14途径激活单核巨噬细胞分泌细胞因子, 如TNF-, IL-1, IL-6, IL-8等, 引起胃黏膜的炎症。Su 等10发现与临床相关的型HP和型HP感染能激活TLR4基因的表达, Kawahara 等11发现型HP的脂质A可以激活TLR4途径。本研究将汉族消化性溃疡患者按HP感染分类后, 未发现TLR4基因A

13、sp299Gly突变基因型, 与正常对照组相比无显著性差异，提示TLR4基因Asp299Gly多态性与汉族HP感染相关性消化性溃疡的发生无相关性。本研究将中国浙江汉族人群与其他人种的TLR4基因的Asp299Gly多态性分布进行分析比较，发现不同人群中TLR4基因Asp299Gly等位基因频率及基因型频率的分布存在显著性差异。其中中国汉族人与日本人的Asp299Gly等位基因频率及基因型频率分布无明显差异性, 即在所检测的样本中均未发现TLR4基因Asp299Gly的突变基因型, 与荷兰高加索人群突变频率存在明显差异，提示由于欧亚人种在TLR4基因Asp299Gly等位基因及基因型频率分布的不

14、同,导致种族差异和遗传背景的不同, 从而影响TLR4基因多态性在消化性溃疡等疾病的遗传机制中的作用。另外由于CD14是TLR4信号传导途径中重要的协同分子，CD14基因多态性在不同人种之间的分布差异也可能影响TLR4在HP的 LPS抗原呈递和胞内信号传导过程中所发挥的作用。【参考文献】 1 Akira S,Takeda K,Kaisho T.Toll-like receptors:critical proteins linking innate and acquired immunity.Nat.Immunol，2001，2:675680. 2 Chow JC, Young DW, Golen

15、bock DT, et al. Toll-like receptor-4 mediates lipopolysaccharide-induced signal transduction. J Biol Chem，1999，274:1068910692.3 Dixon MF, Genta RM, Yardley JH, et al. Classification and grading of gastritis.The updated Sydney System. International Workshop on the Histopathology of Gastritis, Houston

16、 1994. Am J Surg Pathol，1996，20: 11611181.4 Okayama N, Fujimura K, Suehiro Y, et al. Simple genotype analysisof the Asp299Gly polymorphism of the Toll-like receptor-4 gene that is associatedwith lipopolysaccharide hyporesponsiveness. J Clin Lab Anal，2012，16: 5658.5 Consensus on the management of Hel

17、icobacter Pylori infection: Tongcheng, AnhuiProvince, 2003. Chin J Dig Dis，2004，5: 186188.6 蒋益,闵小彦,张定亮.Toll样受体4基因Asp299Gly多态性与溃疡性结肠炎及大肠腺癌.中华内科杂志,2010,7(45):34.7 Scheinecker C, McHugh R, Shevach EM, et al. Constitutive presentation ofa natural tissue autoantigen exclusively by dendritic cells in the

18、draininglymphnode. J Exp Med，2012， 196: 10791090.8 Schmausser B, Andrulis M, Endrich S, et al. Expression and subcellular distribution of toll-like receptors TLR4, TLR5 and TLR9 on the gastric epithelium in Helicobacter Pylori infection. Clin Exp Immunol,2004， 136: 521526.9 Bauditz J, Ortner M, Bierbaum M, et al. Production of IL-12 in gastritis relates to infection with Helicobacter Pylori. Clin Exp mmunol,1999,117:316323.10 Su B, Ceponis PJ, Lebel S, et al. Helicobacter Pylori activatesTo