超级细菌给我们的警示,中儿2010-12

1、专论超级细菌给我们的警示陆权“超级细菌”（Superbug）一个形象地比喻细菌泛耐药的代名词，原本是临床医学和微生物学界关注和研究的项目，近3个月间在全球传媒上被报道得沸沸扬扬，由此产生的各种观点和声音，足以使我国儿科工作者去正视和了解，本文就此谈点自己的看法。1、 事情的由来2010年8月11日柳叶刀感染病学（Lancet Infect Dis）杂志在线发表了Kumarasamy等一篇题名为“在印度、巴基斯坦和英国，一种新的抗生素耐药机制的出现：其分子学、生物学和流行病学的研究”的文章1。文中提到了一种带有新德里金属-内酰胺酶1（New Delhi metallo-lactamase 1，N

2、DM-1）基因的、耐碳青霉素烯类抗生素的革兰阴性肠杆菌科细菌，其潜在性地可能成为全球公共健康问题。该文研究对象的180株菌株分别来自南印度Chennai市（44株），北印度Haryana市（26株）和英国（37株），其中印度两城市菌株为2009年度分离所得，英国菌株为20082009年度，取自英国抗生素耐药监测和参考实验室，原始来源于英国25个实验室，包涵了英格兰、苏格兰和北爱尔兰地区。此外，该研究还包括48株来自印度Mumbai等3所城市的菌株和25株采自巴基斯坦Charsadda等8所城市的菌株。涉及携带NDM-1基因的主要细菌有肺炎克雷伯菌、大肠杆菌、阴沟肠杆菌、变形杆菌、不动杆菌属、弗

3、劳地枸橼酸菌、摩氏摩根菌和普鲁威登菌等。携带NDM-1基因的细菌在体外药敏试验中，对所有内酰胺类及其酶抑制剂复合制剂、单环类抗生素、氨基糖苷类、四环素类、氟喹诺酮类等均高度耐药，尤其对亚胺培南、美洛培南的敏感率仅03%。唯一敏感的抗菌药物是粘菌素（colistin）和替加环素（tigecycline），前者敏感率约89%100%，后者56%67%。虽然携带NDM-1基因的细菌引起全球关注是在2010年，但在2009年Yong等2对携带该基因的1株肺炎克雷伯菌（Kp-05-506）已作了详尽的分子生物学作者单位：200040 上海交通大学附属儿童医院呼吸科（Email：luquan-sh）研究。

4、该菌株来自1位59岁男性印度裔瑞典患者尿液培养中，该患者生活在瑞典，但经常往返印度，患有型糖尿病。2007年12月因臀部巨大脓肿而在印度新德里住院，而后又发生褥疮溃疡。2008年1月8日其回到瑞典，1月9日从尿培养中分离得到Kp-05-506菌株，该菌株对碳青霉烯类等抗菌药物耐药，当时患者并无尿路感染症状，尿菌落计数1000CFU /ml。同时，该患者臀部伤口深处还分离到产超广谱内酰胺酶（ESBL）的大肠杆菌以及对碳青霉烯类抗生素敏感的不动杆菌，并从其外耳道分离到ESBL阳性的大肠杆菌。2008年3月6日该病人出院，2008年4月1日再取尿培养，分离出ESBL阳性的肺炎克雷伯菌，而原先对碳青霉

5、烯类抗菌药物耐药的Kp-05-506菌株再也没有从该患者任何标本中分离出。Kumarasamy等的论文在讨论中提到了中国，认为虽然在中国抗生素耐药已被高度关注3，但bla NDM-1的迅速出现同样应引起中国注意。2010年8月13日，中国中央电视台新闻联播中称“超级细菌正在向全球蔓延”，各种传媒也敏锐地捕捉信息予以报道。同时，卫生部、中华医学会、中国医师协会、中国疾病控制预防中心（CDC）、部分国内专家等均纷纷表述观点和建议对策，“超级细菌”的凸显使医务人员警觉，也使社会公众困惑，难道我们真的面临无所适从的窘地？2008年10月26日中国CDC宣称，我国已检出3株NDM-1阳性的细菌，其中2株

6、为屎肠球菌，由宁夏CDC送检，菌株采自2010年3月该地某县级医院2例低出生体重的新生儿；另1例由中国军事医学科学院实验室所分离的鲍曼不动杆菌，采自2010年6月福建某医院1位83岁的老人。这一报道说明携带NDM-基因的细菌在我国也客观存在，而中国CDC分离的革兰阳性菌屎肠球菌携带该基因乃是全世界首次报告，且发生在新生儿，这在儿科界是一件值得关注的事。2、 NDM-1的分子结构和特性Yong等2对携带NDM-1基因的耐碳青霉烯类抗生素的Kp-05-506菌株作金属酶表型和分子学检测，该菌株对所有内酰胺类抗生素包括亚胺培南、美洛培南、厄他培南均耐药，唯一对粘菌素敏感，表型确认为产金属内酰胺酶（M

7、BL），但PCR扩增分析，该金属酶与已知的作为对照的blaVIM、blaIMP、blaSPM-1、blaSIM-1和blaATM-1型均不同源，属于一种全新的基因型，根据其可能的来源，称之为新德里金属内酰胺酶-1（blaNDM-1）。Kp-05-506菌株的严重泛耐药性通过基因分型和氨基酸测序得以明确有3处耐药相关区域。证据提示该菌存在2种不同的内酰胺类耐药机制：第一种由Amp C酶介导，基于其在体外对EDTA耐药，但对氯唑西林敏感，此耐药基因位于2.1Kb片段中。其携带blaCMY-4基因，呈Amp C表型，其上游为一完整的ISEcP1基因拷贝，可能负责与blaCMY-4的转座和移动，其下游

8、则为blc基因，通常与blaCMY伴存，最早由Kang等所报道4。第二种则为MBL酶介导，因其在体外对氯唑西林和克拉维酸耐药，但对EDTA敏感，其位于4.3Kb片段中。此MBL基因就是全新基因blaNDM-1，呈一嵌合体（chimera）位于肺炎克雷伯菌染色体DNA（Kpc-DNA）与Is26和Tn3转座基因的插入部分之间。Kpc-DNA由外流蛋白基因（efflux pump）、L-乳酸脱氢酶（ldh）标记的基因组成，这两者与已报道的肺炎克雷伯菌株MGH78578的染色体DNA有99.5%同源性（基因库编号CP000647）。该菌株的泛耐药还与其分子结构中含有其他耐药基因有关，已经明确：在其4

9、.8Kb片段中尚含有类整合子（class 1 integron），其包含一套独特的基因，其中有些基因先前在亚洲已有报告，例如紧邻Int1基因的是arr2基因盒，介导对利福平耐药，其先前在中国大陆的铜绿假单胞菌和香港地区的鲍曼不动杆菌中被发现（基因库编号分别是EU886979和AY038837）。另一个ere C基因是全新的红霉素酯化酶基因，其92%核苷酸序列与原先的ere A相同，但其在N末端有额外的10个氨基酸，在整个序列中有31个氨基酸被替换。紧邻ere C基因的是介导对庆大霉素耐药的aad A1基因以及介导对氯霉素耐药的cml A7基因盒，其存在于基因aad A1与qac/sul之间。N

10、DM-1的结构特性：blaNDM-1基因推断有269个氨基酸，分子量约为275KDa，通过凝胶电泳和质谱仪分析提示其可作为一个单体而活化存在，HDM-1具有一个前导多肽，可能的裂解区是在19号位点2个丙氨酸之间，这与已知的VIM MBLs的裂解区十分相似。NDM-1也分享了VIM酶在第34和36位点上的附加环，还在第162至166位点上，具有独一无二的附加序列。从该结构可以看出NDM-1与其他金属酶极少同源性，与之最相近的是VIM-1/VIM-2，两者同源性也仅32.4%。奇妙的是NDM-1在移动的MBLs间尚有一组独一无二的HXHXD图谱：在2个组氨酸之间，插入1个丙氨酸。此外，NDM-1在

11、第222位点上的色氨酸为酪氨酸所替代。blaNDM-1基因理论上的等电点（PI）是6.9。NDM-1的功能特性：通过凝胶电泳分析并与IMP-1、VIM-2比较，动力值（Kinetic Values）显示：NDM-1对大多数头孢菌素有紧密联接，Km值较低，尤其对头孢呋辛、头孢噻肟和头孢噻吩，对青霉素类也有相对较紧密的联接，这与其他金属内酰胺酶不同，例如IMP-1和VIM-2均具有较高的Km值。对于碳青霉烯类抗生素，NDM-1并未像IMP-1或VIM-2如此紧密联接。NDM-1的青霉素类抗生素转化率（Kcat）低于IMP-1和VIM-2，对头孢菌素类抗生素Kcat值与IMP-1更相似，而对碳青霉烯

12、类抗生素的Kcat值则相近于VIM-2。由于NDM-1对大部分头孢菌素和碳青霉烯类抗生素的Km值较低，故Kcat/Km比值就相对较VIM-2高，唯一例外的是头孢他啶，NDM-1对其的Kcat/Km为-0.03，而VIM-2达0.90。总之，NDM-1与IMP-1、VIM-2相比对现有各类抗菌药物包括碳青霉烯类抗生素均有更强的水解能力。NDM-1的质粒分析：携带blaNDM-1质粒的肺炎克雷伯菌Kp-05-506可成功地将该质粒转移到大肠埃希菌J53，转移频率约为10-4-10-5。blaNDM-1质粒大小在Kp-05-506菌株为180Kb，而在大肠埃希菌，NDM-1质粒较小，约为140Kb。

13、不同细菌携带blaNDM-1基因的质粒大小不一，这说明该基因在复制或插入时存在有再排列。质粒携带blaNDM-1同时还携带blaCMY-4和类整合子复合体，造成多重耐药，甚至出现对现存所有抗菌药物均耐药的可怕情景。通过质粒，NDM-1基因可以在不同细菌间转移，这就造成该基因可为临床上多种细菌所携带，造成不可预见性、高度耐药性和治疗困难性的严峻问题。日本新泻大学学者用电子显微镜成功拍摄了携带NDM-1基因的大肠埃希菌图像，这是全球首张所谓“超级细菌”的照片。该菌长约2微米，与普通大肠杆菌相比，超级细菌的鞭毛数多，故更具活动度和灵活性。3、 警示与对策准确地讲，医学上并不存在所谓的“超级细菌”。上

14、述的关于blaNDM-1的结构、功能特性和质粒分析等，可以清楚地看出Yong等是发现了一种全新的金属内酰胺酶，这种酶主要存在革兰阴性肠杆菌，尤其是肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌，此外还可以存在于阴沟肠杆菌、变形杆菌、不动杆菌、铜绿假单胞菌、弗劳地枸橼酸菌等，我国报道尚存在于屎肠球菌之中。blaNDM-1基因可为多种细菌所共有，可以通过质粒在不同细菌间转移，这就构成防治的困难。目前，在印度、巴基斯坦、英国、美国、加拿大、日本、韩国、澳大利亚、比利时、瑞典、荷兰、法国、德国、肯尼亚、中国大陆、中国香港、中国台湾等均已有感染或携带病例的报告，这就提示携带NDM-1基因的泛耐药细菌是一个全球性问题。现在资料

15、揭示肠杆菌科细菌检出NDM-基因的比例为1.2%13%。如果进一步加强监测，尤其是主动监测，或许还会有更多国家发现该基因、还会有更多临床分离的细菌携带该基因。“超级细菌”更确切地应称为泛耐药细菌。事实上，我国在全国耐药监测CHINET报告中，从2007年始已关注泛耐药这一问题5-，所谓泛耐药是指该细菌对头孢菌素类、碳青霉烯类、内酰胺酶抑制剂复合剂型、氨基糖苷类和氟喹诺酮类抗菌药物均耐药，2007年资料中泛耐药菌株在弗劳地枸橼酸菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌和肺炎克雷伯菌中所占的平均比例分别是5.9%、3.2%、2.8%和0.3%，2008年分别是4.1%、2.1%、10.9%和0.6%，200

16、9年则为2.7%、1.7%、17.0%和1.8%。显然，中国泛耐药的鲍曼不动杆菌和肺炎克雷伯菌在明显增多，尤其是前者，这些细菌对碳青霉烯类抗生素均耐药，而耐药机制呈多重而复杂8,9。CHINET资料中，儿童患者泛耐药细菌的比例较低，2007年铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌的泛耐药分别是0.7%和2.2%，而在2008年为0.0%，但资料仅涵盖上海2所专科儿童医院，尚不能反映我国儿童泛耐药菌的全貌。“超级细菌”的出现又一次为我们敲响细菌泛耐药的警钟，切不可松懈和怠慢。从现有资料看，NDM-1细菌主要在医院内，可能通过密切接触而传染，通过手和污染医疗器械或其他物品传播，而非空气传播，通常不会在社区、普

17、通健康人群中传播。NDM-1细菌传播存在有某些高危因素，例如危重病人、ICU病人、长期使用抗菌药物者、气管插管机械通气者、中心静脉留置导管者等。理论上，免疫功能低下者、早产儿、低出生体重儿也可能是易感人群。已知的NDM-1细菌主要引起尿路感染、血流感染、伤口感染、肺部感染和导管相关感染等，但其他部位不等于不会被感染，因为一旦这种细菌进入血流，全身各脏器均有可能被累及。携带NDM-1基因的细菌并非代表其毒力强，也并非代表其所致感染的严重度高，这类感染的临床表现与敏感菌并无差别，差别在于对现有抗菌药物的极高和极广泛的耐药性。因此，临床上发现对一般抗菌药物治疗无效，尤其对亚胺培南、美洛培南等碳青霉烯

18、类抗生素耐药时，要考虑该细菌是产金属内酰胺酶（MBL）的，而NDM-1是一种全新的MBL。一旦怀疑携带NDM-1基因，就可以从实验室中加以确认，这包括表型筛查，表型确认和基因确证。表型筛查推荐使用亚胺培南、美洛培南纸片法（K-B法）或这2种药物的最低抑菌浓度（MIC）测定法：亚胺培南（10g/片），抑菌圈直径22mm。MIC法，美洛培南MIC2mg/L，亚胺培南对大肠克雷伯菌属、沙门菌属和肠杆菌属MIC2mg/L，可初步认定产金属内酰胺酶。表型确认应该使用双纸片协同试验，双纸片是指亚胺培南纸片（10g/片）和EDTA纸片（1500g/片）；也可以用亚胺培南纸片和亚胺培南/EDTA复合纸片去确认

19、。复合纸片比单药纸片抑菌圈直径扩大5mm，或MIC降低8倍，即可判定产金属酶。表型筛查和表型确认实质上是在确认产金属内酰胺酶，而基因确证则必须采用NDM-1基因特异引物作PCR扩增和测序。我国尚无携带NDM-1基因细菌对临床治疗产生直接影响的报告。但我们必须从各个方面作好充分准备，主动细菌耐药监测网的建立和有序扩大，国家层面参考实验室的建立和确认等都是当务之急。耐药监测的抗菌药物应该统一，应包括碳青霉烯类等5大类抗菌药物，而针对携带NDM-1基因的细菌，尚需添加替加环素、多粘菌素和磷霉素等。2010年10月9日卫生部会同总后卫生部和国家中医药管理局共同制订并在网上发布的“产NDM-1泛耐药肠杆

20、菌科细菌感染治疗指南（试行版）”给了我们防治的总原则和方向，根据病情轻重推荐替加环素、多粘菌素、碳青霉烯类、氨基糖苷类、氟喹诺酮类和磷霉素等6类药物，或许这尚需时间和实践去考验。在儿童，这些药物的使用还需注意相应的不良反应和毒副作用，例如多粘菌素的肾毒性、神经毒性，替加环素的肝脏损害，氨基糖苷类的耳、肾毒性以及氟喹诺酮的软骨损伤等。“超级细菌”的出现再次告诫我们必须大力提倡合理使用抗菌药物。2004年卫生部等三部委颁发了抗菌药物临床应用指导原则10，2008年以来卫生部启动了全国基层医疗机构抗菌药物临床合理应用培训的星火计划和萌芽计划。已有专家建议抗菌药物的合理使用应该立法，各类相关指南有不可

21、替代的学术指导意义，但并无约束力。我们还应看到，中国每年生产抗菌药物原料约21万吨，其中有9.7万吨用于畜牧养殖业，主要用作动物饲料添加剂以预防动物传染病和促其生长，这部分占抗菌药物年总产量的46.1%，我国还存在人与动物的同药现象。这就衍生出动物对现用抗菌药物的耐药以及这种耐药在人与动物中传递的严峻问题。欧盟早在2006年1月已全面禁止使用抗菌药物作为饲料生长添加剂，美国FDA也注意到这一问题，并指出“在可食用动物中应用人类的重要抗菌药物有悖于保护公众健康和利益”。或许，在我国要解决这类问题更需要国家层面的立法。“超级细菌”的出现是在人类广泛甚至过度使用抗菌药物背景下必然出现的一种现象，抗菌

22、药物的使用会选择出某些高度耐药的细菌，携带NDM-1基因的革兰阴性肠杆菌也只是其中之一。20世纪5060年代，全球每年约700万人死于感染性疾病，而到了世纪之交的1999年，却上升至2000万，这主要就是耐药菌感染所致。开发新的抗菌药物仅仅是应对策略之一，更重要的是必须减轻抗菌药物的选择性压力，必须合理使用现有的抗菌药物，杜绝滥用，延长现有抗菌药物生命、减缓细菌耐药速度。认识“超级细菌”是防止其在院内传播的第一步，加强医院内感染的防控，加强医院的消毒隔离工作，加强无菌操作规程、强调医护人员的手卫生，加强医院环境的卫生管理，加强对医疗附属用具的清洁消毒和加强对医务人员和公众的健康教育等，这一切都

23、是需要再认识并予以认真实施。对“超级细菌”，我们不必恐慌，但必须正视。人类的历史总是在曲折中前进的，防治泛耐药细菌的感染也一定是这样一种规律，努力探索和攻克耐药菌感染应该是跨国界的全人类的共同责任。参考文献1Kumarasamy KK, Toleman MK, Walsh TR, el at. Emergence of a new antibiotic resistance mechanism inIndia, Pakistan, and the UK: a molecular, biological, and epidemiological study. Lancet Infect Dis,

24、 2010,10（9）: 597602.2Yong D, Toleman MA, Giske CG, et al. Characterization of a new metallo-lactamase gene, blaNDM-1, and a novel erythromycin esterase gene carried on a unique genetic structure in Klebsiella pneumoniae sequence type 14 from India. Antimicrob Agents Chemother, 2009,53（12）:50465054.3Heddini A, Cars O, Qiang S, et al. Antibiotic resistance in Chinaa major future challenge. Lanc