实验四 从猪肝中分离提取DNA及RNA 10-5-15

1、 实验四实验四 从猪肝中分离提取从猪肝中分离提取 DNA和和RNA学习、掌握分离制备学习、掌握分离制备DNADNA和和RNARNA的原理及基本方法。的原理及基本方法。一一 实验目的实验目的：二 实验原理： 利用利用DNADNA和和RNARNA的溶解特性不同而使二者分开。的溶解特性不同而使二者分开。 DNADNA在生物体内是与蛋白质形成复合物的形式存在在生物体内是与蛋白质形成复合物的形式存在的，因此提取出脱氧核糖核蛋白复合物（的，因此提取出脱氧核糖核蛋白复合物（DNPDNP）后，必）后，必须将蛋白质除去。动物和植物组织的须将蛋白质除去。动物和植物组织的DNPDNP可溶于水或浓可溶于水或浓盐溶液盐

2、溶液, ,但在稀盐溶液中溶解度很低但在稀盐溶液中溶解度很低, ,而而RNPRNP则溶于稀盐则溶于稀盐溶液中溶液中. .由此将由此将DNPDNP与与RNPRNP分开。分开。二二 实验原理实验原理： 去蛋白方法有很多种，本实验采用去蛋白方法有很多种，本实验采用异戊醇异戊醇- -氯仿氯仿混合液以及酚作为蛋白变性剂混合液以及酚作为蛋白变性剂去除去除DNPDNP与与RNPRNP中的蛋中的蛋白，最终达到分离出白，最终达到分离出DNADNA与与RNARNA的目的。的目的。实验安排：实验安排：本次实验每个实验台分为本次实验每个实验台分为A A、B B两组两组 A A组组-提取提取 RNARNA B B组组-提

3、取提取 DNADNA药品的配制：药品的配制：1 10.1mol/L NaCl - 0.05mol/L, pH7.0 0.1mol/L NaCl - 0.05mol/L, pH7.0 柠檬酸钠缓冲液柠檬酸钠缓冲液 1000ml1000ml 柠檬酸钠柠檬酸钠 29.412g29.412g NaCl 11.7g NaCl 11.7g 加蒸馏水至加蒸馏水至 2000 ml2000 ml 2.2. 10 % NaCl 800 ml10 % NaCl 800 ml NaCl 80g + 800 ml NaCl 80g + 800 ml 蒸馏水蒸馏水实验材料：实验材料： 猪肝猪肝3.3. 氯仿氯仿异戊醇混合

4、液（异戊醇混合液（9:19:1） 500 ml500 ml 450ml 450ml 氯仿氯仿+50ml +50ml 异戊醇异戊醇4.4. 95% 95% 乙醇（实验前放入冰箱）乙醇（实验前放入冰箱）o冷蒸馏水（实验前放入冰箱）冷蒸馏水（实验前放入冰箱）oSSCSSC溶液溶液 100ml100mlo （0.15M NaCl0.15M NaCl含含0.015M0.015M柠檬酸三钠）柠檬酸三钠）药品的配制：药品的配制：药品的配制药品的配制：7.7. SDS SDS溶液溶液 5g SDS5g SDS溶于溶于45%45%乙醇中配成乙醇中配成100ml100ml溶液溶液8.8. 水饱和酚水饱和酚 新鲜重

5、蒸酚用水饱和新鲜重蒸酚用水饱和9.9. 2% 2%醋酸钾醋酸钾-95%-95%乙醇溶液乙醇溶液 2g2g醋酸钾溶于醋酸钾溶于95%95%乙醇中配成乙醇中配成100ml100ml溶液溶液猪肝猪肝 加缓冲液加缓冲液绞碎、离心绞碎、离心上清上清沉淀沉淀A组从中提取RNAB组从中提取DNARNPRNP解聚解聚酚去蛋白酚去蛋白沉淀沉淀RNARNA检测检测析出析出DNPDNP析出析出DNADNA沉淀沉淀DNADNA检测检测实验流程：三三. .操操 作作 步步 骤骤 加缓冲液、绞碎、离心加缓冲液、绞碎、离心 称取新鲜（或冷冻）猪肝称取新鲜（或冷冻）猪肝50g50g放入组织捣碎机中（先剪成放入组织捣碎机中（先

6、剪成cmcm小块），加入小块），加入100ml 100ml 0.1mol/LNaCl,0.05mol/L, pH7.0 0.1mol/LNaCl,0.05mol/L, pH7.0 柠檬酸钠缓冲液，捣碎柠檬酸钠缓冲液，捣碎3min3min，组织糜于，组织糜于40004000r/minr/min离心离心10min10min，将上清液与沉淀分开，保留上清液，将沉淀倒入烧，将上清液与沉淀分开，保留上清液，将沉淀倒入烧杯中，用上述缓冲液洗涤杯中，用上述缓冲液洗涤2 2次，每次次，每次50ml50ml，如前离心，如前离心 。合合并上清液。并上清液。 A A组取上清提组取上清提 RNA RNA ；B B组取

7、沉淀提组取沉淀提 DNADNA A A组：组：RNARNA的提取的提取 1.1. RNARNA- -核蛋白的解聚核蛋白的解聚 在上清液中加入在上清液中加入5% SDS5% SDS溶液，使溶液，使SDSSDS的最终浓度的最终浓度为为0.5%0.5%左右左右, ,室温下摇匀室温下摇匀. .注意计算加入注意计算加入SDSSDS的量的的量的多少。多少。 水饱和酚在水饱和酚在6565下预热下预热, ,加等体积加等体积水饱和酚水饱和酚于上述解于上述解聚溶液内聚溶液内. 65. 65水浴中摇水浴中摇15 min, 4000r/min15 min, 4000r/min离心离心15min.15min.离心液分三

8、层离心液分三层: :上层水相含上层水相含RNARNA, ,中层为变性蛋白与少量中层为变性蛋白与少量RNA,RNA,下层是酚层下层是酚层. .小心吸出上层水相小心吸出上层水相, ,去除蛋白质层，下层的苯去除蛋白质层，下层的苯酚回收入大烧杯中。酚回收入大烧杯中。 回收的苯酚用回收的苯酚用4000r/min4000r/min离心离心10min10min，去除含有的杂蛋，去除含有的杂蛋白，苯酚放入白，苯酚放入6565下预热，循环使用下预热，循环使用. .2.2. 酚去蛋白酚去蛋白 再在收集的水相中加等体积水饱和酚再在收集的水相中加等体积水饱和酚, ,同上步骤同上步骤, ,抽抽提去蛋白提去蛋白. .如此

9、重复如此重复2 2次次, ,直至上下二相界面之间无蛋白直至上下二相界面之间无蛋白为止为止. .小心吸取上层水相溶液小心吸取上层水相溶液, ,量取体积后置于烧杯中。量取体积后置于烧杯中。 2.2. 酚去蛋白酚去蛋白 取取2.52.5倍体积预冷的倍体积预冷的95%95%乙醇乙醇-2%-2%醋酸钾溶液醋酸钾溶液, ,加入上述去蛋白的加入上述去蛋白的RNARNA溶液内溶液内,RNA,RNA沉淀，并以沉淀，并以4000r/min4000r/min离心离心10 min10 min，收集此沉淀。，收集此沉淀。 3.3. RNARNA的沉淀的沉淀 RNARNA沉淀沉淀复溶于复溶于SSCSSC（0.15M Na

10、Cl0.15M NaCl；0.015M0.015M柠檬酸三柠檬酸三钠）溶液中钠）溶液中( (此处此处SSCSSC溶液体积不易过大溶液体积不易过大, ,否则影响下一步否则影响下一步得率得率, ,开始应滴加少量开始应滴加少量SSCSSC溶解，溶解，5-85-8滴管即可，如果该剂滴管即可，如果该剂量的量的SSCSSC不能溶解，则继续滴加不能溶解，则继续滴加SSCSSC，直到沉淀完全溶解，直到沉淀完全溶解),),再用二倍体积再用二倍体积95%95%冷乙醇沉淀冷乙醇沉淀RNA,RNA,离心收集离心收集RNARNA。此。此RNARNA再再溶于少量溶于少量SSCSSC溶液，置于溶液，置于44冷藏待冷藏待RN

11、ARNA沉淀沉淀. .3.3. RNARNA的沉淀的沉淀RNA沉淀沉淀RNA沉淀沉淀 取取RNARNA溶液溶液10ul10ul，直接放入石英比色皿中，加水至比，直接放入石英比色皿中，加水至比色皿色皿2/32/3以上处，用紫外分光光度计测定以上处，用紫外分光光度计测定260nm260nm和和280nm280nm吸吸收值，计算两者吸收比值来鉴定其纯度。收值，计算两者吸收比值来鉴定其纯度。 纯的纯的RNARNA，其，其ODOD260260/OD/OD280280为为2.02.04.4. RNARNA含量及纯度测定含量及纯度测定B B组：组：DNADNA的提取的提取 1.1. 析出析出DNPDNP 向

12、得到的细胞核沉淀中加入向得到的细胞核沉淀中加入125 ml 125 ml 10%NaCl10%NaCl溶液，溶液，充分混匀，搅拌充分混匀，搅拌10-15min, 10-15min, 于于4000r/min4000r/min离心离心15min15min。将所得的半透明粘稠状液体，沿玻璃棒慢慢倒入将所得的半透明粘稠状液体，沿玻璃棒慢慢倒入1010倍体倍体积的冷蒸馏水内，这时有白色丝状物积的冷蒸馏水内，这时有白色丝状物- -核蛋白核蛋白DNPDNP析出，析出，4000 r/min4000 r/min离心离心10min 10min 。将沉淀物再溶于。将沉淀物再溶于10%NaCl10%NaCl溶液中溶液

13、中（用量筒取（用量筒取50ml 10%NaCl50ml 10%NaCl，每次取少量溶解沉淀，逐步将，每次取少量溶解沉淀，逐步将溶解液移至两个离心管中），迅速搅拌至充分溶解。溶解液移至两个离心管中），迅速搅拌至充分溶解。 加入加入1/21/2体积氯仿体积氯仿- -异戊醇混合液，剧烈振荡异戊醇混合液，剧烈振荡5min5min左左右，于右，于4000r/min4000r/min离心离心10min10min。得三层得三层：上面为含有上面为含有DNADNA和和DNADNA核蛋白的水层核蛋白的水层，下面为氯仿下面为氯仿- -异戊醇的有机溶剂层异戊醇的有机溶剂层，变变性蛋白质凝胶介于两层之间性蛋白质凝胶介于

14、两层之间。吸出上面的水层，用玻璃棒。吸出上面的水层，用玻璃棒挑出蛋白质凝胶层（前几次易挑出，当蛋白质含量少后不挑出蛋白质凝胶层（前几次易挑出，当蛋白质含量少后不易挑出时，可用吸管吸出蛋白层），将吸出的水层倒回原易挑出时，可用吸管吸出蛋白层），将吸出的水层倒回原离心管。如前振荡离心进行脱蛋白，直至界面处不再出现离心管。如前振荡离心进行脱蛋白，直至界面处不再出现蛋白质凝胶为止。从中取样测定。蛋白质凝胶为止。从中取样测定。 2.2.析出析出DNADNA 吸出上清液并将它注入两倍体积的吸出上清液并将它注入两倍体积的95%95%冰乙醇中。可见冰乙醇中。可见到白色纤维状到白色纤维状DNADNA沉淀。沉淀。4.4.DNADNA的测定的测定 取取D