发酵工程_第六章_发酵过程控制

1、 本章内容本章内容一、概述一、概述二、代谢调控在发酵过程控制中的应用二、代谢调控在发酵过程控制中的应用1. 初级代谢物的生产调节初级代谢物的生产调节 2. 次级代谢物的生产调节次级代谢物的生产调节三、营养基质和菌体浓度对发酵过程的影响及控制三、营养基质和菌体浓度对发酵过程的影响及控制四、四、 温度对发酵的影响及其控制温度对发酵的影响及其控制五、五、 pH对发酵的影响及其控制对发酵的影响及其控制六、六、溶解氧对发酵的影响及其控制溶解氧对发酵的影响及其控制七、泡沫对发酵的影响及其控制泡沫对发酵的影响及其控制八、八、CO2和呼吸商对发酵的影响及其控制和呼吸商对发酵的影响及其控制九、发酵终点的控制九、

2、发酵终点的控制十、发酵过程的控制十、发酵过程的控制十一、十一、自动控制技术在发酵过程控制中的应用自动控制技术在发酵过程控制中的应用1. 过程控制的重要性过程控制的重要性 菌株特性菌株特性(营养要求、生长速率、营养要求、生长速率、 呼吸强度、产物合成速率呼吸强度、产物合成速率) 传递性能传递性能 物理：物理：n、T、Ws 化学化学：pH、DO、浓度浓度 过程控制的意义：过程控制的意义：最佳工艺条件的优选（即最佳工艺参数最佳工艺条件的优选（即最佳工艺参数 的确定）以及在发酵过程中通过过程调节达到最适水平的的确定）以及在发酵过程中通过过程调节达到最适水平的 控制。控制。决定发酵决定发酵单位单位(水平

3、水平)的因素的因素外部环境因素外部环境因素工艺条件工艺条件生物因素：生物因素：设备性能：设备性能：2. 发酵过程控制的一般步骤发酵过程控制的一般步骤 确定能反映过程变化的各种理化参数及其检测方法确定能反映过程变化的各种理化参数及其检测方法 研究这些参数的变化对发酵生产水平的影响及其机制，研究这些参数的变化对发酵生产水平的影响及其机制，获取最适水平或最佳范围获取最适水平或最佳范围 建立数学模型定量描述各参数之间随时间变化的关系建立数学模型定量描述各参数之间随时间变化的关系 通过计算机实施在线自动检测和控制，验证各种控制通过计算机实施在线自动检测和控制，验证各种控制模型的可行性及其适用范围，实现发

4、酵过程最优控制模型的可行性及其适用范围，实现发酵过程最优控制 3. 参数检测参数检测n代谢参数按性质可分为三类：代谢参数按性质可分为三类：物理参数：物理参数：温度、搅拌转速、罐压、空气流量、溶解温度、搅拌转速、罐压、空气流量、溶解氧、表观粘度、排气氧（二氧化碳）浓度等氧、表观粘度、排气氧（二氧化碳）浓度等化学参数：化学参数：基质浓度（包括糖、氮、磷）、基质浓度（包括糖、氮、磷）、 pH、产物、产物浓度、核酸量等浓度、核酸量等生物参数：生物参数：菌丝形态、菌体浓度、菌体比生长速率、菌丝形态、菌体浓度、菌体比生长速率、呼吸强度、摄氧率、关键酶活力等呼吸强度、摄氧率、关键酶活力等3. 参数检测参数检

5、测n参数按获取方式可分为两类：参数按获取方式可分为两类： 如如T、pH、罐压、空气流量、搅罐压、空气流量、搅拌转速、溶氧浓度等拌转速、溶氧浓度等 如摄氧率如摄氧率()、呼吸强度、呼吸强度(QO2)、比生长、比生长速率（速率（) 、体积溶氧系数体积溶氧系数(KLa)、呼吸商呼吸商(RQ)等等。直接参数直接参数： 间接参数间接参数：将直接参数通过公式计算获得的：将直接参数通过公式计算获得的参数，参数，3. 参数检测参数检测n参数的测量形式参数的测量形式离线测量：离线测量：基质（糖、脂类、无机盐等）、前体和代基质（糖、脂类、无机盐等）、前体和代谢产物（抗生素、酶、有机酸、氨基酸等）谢产物（抗生素、酶

6、、有机酸、氨基酸等）在线测量在线测量：如：如T 、pH、DO、溶解、溶解CO2、尾气、尾气CO2、黏度、黏度、搅拌转速等搅拌转速等n优点：及时、省力，可从繁琐操作中解脱出来，便优点：及时、省力，可从繁琐操作中解脱出来，便于计算机控制。于计算机控制。 n困难：传感器要求较高。困难：传感器要求较高。 v对传感器的要求对传感器的要求n能经受高压蒸汽灭菌；能经受高压蒸汽灭菌；n传感器及其二次仪表具有长期稳定性；传感器及其二次仪表具有长期稳定性；n最好能在过程中随时校正，灵敏度好；最好能在过程中随时校正，灵敏度好；n探头材料不易老化，使用寿命长；探头材料不易老化，使用寿命长；n安装使用和维修方便；安装使

7、用和维修方便；n解决探头敏感部位被物料（反应液）粘住、堵塞解决探头敏感部位被物料（反应液）粘住、堵塞 问题；问题；n价格合理，便于推广。价格合理，便于推广。 3. 参数检测参数检测3. 参数检测参数检测v参数检测方法参数检测方法n温度测量温度测量 感温元件：热电偶（温度信号感温元件：热电偶（温度信号 电信号电信号） 二次仪表：将热电偶输出的电信号转换成二次仪表：将热电偶输出的电信号转换成 被测介质的温度被测介质的温度v参数检测方法参数检测方法n搅拌转速和搅拌功率的测量搅拌转速和搅拌功率的测量搅拌转速：磁感应式，光感应式，搅拌转速：磁感应式，光感应式， 测速电机；测速电机；搅拌功率：功率表，测定

8、力矩求功率法。搅拌功率：功率表，测定力矩求功率法。3. 参数检测参数检测3. 参数检测参数检测v参数检测方法参数检测方法n空气流量测定空气流量测定体积流量型：体积流量型： 会引起流体能量损失，受温度和压力变化的影响；会引起流体能量损失，受温度和压力变化的影响； 同心孔板压差式流量计；同心孔板压差式流量计； 转子流量计。转子流量计。质量流量型：质量流量型： 根据流体固有性质（质量、导电性、热传导性能）根据流体固有性质（质量、导电性、热传导性能）设计的流量计。设计的流量计。v参数检测方法参数检测方法n罐压测量罐压测量 压力表压力表 压力传感器压力传感器 3. 参数检测参数检测http:/ 压差法：

9、压差法：H=（P2/P1）H 直接重量测量法：直接称重直接重量测量法：直接称重 体积计量法：计算进出料液体积计量法：计算进出料液 流量计量法：计算流量和时间流量计量法：计算流量和时间 液位探针液位探针3. 参数检测参数检测v参数检测方法参数检测方法n发酵液粘度测定发酵液粘度测定 毛细管粘度计毛细管粘度计 回转式粘度计回转式粘度计 涡轮旋转粘度计涡轮旋转粘度计3. 参数检测参数检测http:/ 复合复合pH电极电极 pH测量仪器测量仪器3. 参数检测参数检测http:/ 化学法化学法 极谱法极谱法 复膜氧电极法复膜氧电极法 3. 参数检测参数检测复膜氧电极示意图复膜氧电极示意图（a）极谱型极谱型

10、 （b）原电池型原电池型v参数检测方法参数检测方法n溶解二氧化碳测量溶解二氧化碳测量 复膜式电极法复膜式电极法 渗透膜渗透膜碳酸氢钠法碳酸氢钠法n发酵尾气的在线分析发酵尾气的在线分析 CO2分析分析 O2分析分析3. 参数检测参数检测v参数检测方法参数检测方法n细胞浓度的测量细胞浓度的测量 化学法：如化学法：如DNA、RNA分分析等析等 物理法：如重量分析、分光光度分析、物理法：如重量分析、分光光度分析、 浊度分析等浊度分析等新技术：以电容法为测量原理的在线新技术：以电容法为测量原理的在线 活细胞浓度测量传感器活细胞浓度测量传感器 3. 参数检测参数检测原位活细胞在线检测仪原位活细胞在线检测仪

11、1. 初级代谢物的生产调节初级代谢物的生产调节初级代谢物初级代谢物：指一类低分子量的终点产物及这些：指一类低分子量的终点产物及这些终点产物的生物合成途径中的中间体。终点产物的生物合成途径中的中间体。 (1) 避开固有的反馈调节避开固有的反馈调节(2) 细胞通透性的变更细胞通透性的变更n反馈调节包括反馈调节包括 反馈抑制反馈抑制：某一生物合成途径的最终代谢物抑：某一生物合成途径的最终代谢物抑制该途径的第一或第二个酶的活性。制该途径的第一或第二个酶的活性。 反馈阻遏反馈阻遏：抑制酶的形成，是由途径终点产物：抑制酶的形成，是由途径终点产物或其衍生物施行的。或其衍生物施行的。（1）避开固有的反馈调节避

12、开固有的反馈调节http:/ 从遗传上改变酶的活性和酶的形成系统，筛选有抗反从遗传上改变酶的活性和酶的形成系统，筛选有抗反馈作用的基因突变型（对反馈作用不敏感）。馈作用的基因突变型（对反馈作用不敏感）。n具体应用具体应用积累中间产物积累中间产物积累终点产物积累终点产物耐反馈作用的突变株的筛选耐反馈作用的突变株的筛选：抗结构类似物突变株：抗结构类似物突变株 抗结构类似物突变株的筛选机制抗结构类似物突变株的筛选机制n末端产物类似物和末端产物结构类似，因而能够引起反末端产物类似物和末端产物结构类似，因而能够引起反馈作用，但是它们不能参与生物合成。在培养基中添加馈作用，但是它们不能参与生物合成。在培养

13、基中添加末端产物类似物后，未突变的细胞将由于代谢途径受阻末端产物类似物后，未突变的细胞将由于代谢途径受阻而不能获得生物合成所需的该种末端产物，从而导致细而不能获得生物合成所需的该种末端产物，从而导致细胞死亡。那些对类似物不敏感的突变株仍能制造末端产胞死亡。那些对类似物不敏感的突变株仍能制造末端产物并长成菌落。物并长成菌落。 n突变株耐结构类似物的原因：突变株耐结构类似物的原因： 酶的结构起了变化（指耐反馈抑制的突变株）酶的结构起了变化（指耐反馈抑制的突变株） 酶的合成系统起了变化（指耐反馈阻遏的突变株）酶的合成系统起了变化（指耐反馈阻遏的突变株）（1）避开固有的反馈调节避开固有的反馈调节n双突

14、变株的概念：双突变株的概念：单一菌株内同时发生耐单一菌株内同时发生耐反馈抑制和耐反馈阻遏的突变作用。反馈抑制和耐反馈阻遏的突变作用。 n回复筛选回复筛选：用突变除去反馈敏感的酶和用用突变除去反馈敏感的酶和用第二次突变置换它，常产生分泌终点产物第二次突变置换它，常产生分泌终点产物的回复子。的回复子。 细胞通透性的变更细胞通透性的变更n细菌细胞膜通透性的增加是谷氨酸过量生产的原因之一。细菌细胞膜通透性的增加是谷氨酸过量生产的原因之一。n能过量生产谷氨酸的细菌有两个共同特征：能过量生产谷氨酸的细菌有两个共同特征： -酮戊二酸脱氢酶缺失：表明这类细菌的酮戊二酸脱氢酶缺失：表明这类细菌的TCA上的酶受上

15、的酶受阻，保证了碳引向谷氨酸的合成歧路。阻，保证了碳引向谷氨酸的合成歧路。 对生物素的营养需求：表明这类细菌的生物素的生物合对生物素的营养需求：表明这类细菌的生物素的生物合成受阻，导致细胞膜通透性的改变，使细胞可以分泌出谷成受阻，导致细胞膜通透性的改变，使细胞可以分泌出谷氨酸。氨酸。 2. 次级代谢物的生产调节次级代谢物的生产调节(1) 次级代谢的特点及与初级代谢的关系次级代谢的特点及与初级代谢的关系(2) 调节方法调节方法n诱导作用诱导作用 n避开固有的负反馈避开固有的负反馈n操纵环境条件来控制次级代谢物的生物合成操纵环境条件来控制次级代谢物的生物合成n耐负反馈调节的抗性突变株的筛选耐负反馈

16、调节的抗性突变株的筛选n初级代谢物的调节作用初级代谢物的调节作用n能荷调节能荷调节 e.g.磷酸盐影响金霉素的合成磷酸盐影响金霉素的合成n （1）次级代谢的特点及与初级代谢的关系次级代谢的特点及与初级代谢的关系n次级代谢酶的特异性较初级代谢酶的特异性低，故受次级代谢酶的特异性较初级代谢酶的特异性低，故受遗传及环境因素的影响大。遗传及环境因素的影响大。 n次级代谢物的合成途径比初级代谢的种类多，但大多次级代谢物的合成途径比初级代谢的种类多，但大多数次级代谢物都是由少数关键中间代谢物组装的。数次级代谢物都是由少数关键中间代谢物组装的。n次级代谢产物的合成一般是在生长期后，即培养基中次级代谢产物的合

17、成一般是在生长期后，即培养基中的养分快耗尽，菌的比生长速率降低时才合成。的养分快耗尽，菌的比生长速率降低时才合成。 操纵环境条件来控制次级代谢物的生物合成操纵环境条件来控制次级代谢物的生物合成n改变培养基成分来避免分解阻遏作用改变培养基成分来避免分解阻遏作用 n改变培养基成分来避免反馈抑制和阻遏作用改变培养基成分来避免反馈抑制和阻遏作用 e.g.链霉素发酵中限制磷酸盐的加量，避免其对参与生链霉素发酵中限制磷酸盐的加量，避免其对参与生物合成的磷酸酯酶的反馈抑制和阻遏作用物合成的磷酸酯酶的反馈抑制和阻遏作用n培养基中添加前体物来避免分支途径终产物对发酵产培养基中添加前体物来避免分支途径终产物对发酵

18、产品的间接抑制作用品的间接抑制作用http:/ 分解阻遏作用的解除主要是在多个碳源中选择慢碳分解阻遏作用的解除主要是在多个碳源中选择慢碳源或者采用缓慢流加快碳源的工艺源或者采用缓慢流加快碳源的工艺 http:/ e.g. 不需添加色氨酸的硝吡咯菌素的高产菌株不需添加色氨酸的硝吡咯菌素的高产菌株n回复筛选回复筛选 e.g. 高产金霉素产生菌高产金霉素产生菌n筛选耐药性菌株筛选耐药性菌株 e.g. 利用抗生素筛选耐药性菌株利用抗生素筛选耐药性菌株 本章主要内容第一节第一节 营养基质和菌体浓度营养基质和菌体浓度 的影响及控制的影响及控制第二节 温度的影响及其控制第三节 pH的影响及控制第四节 溶氧的

19、影响及控制第五节 泡沫的影响及控制第六节 二氧化碳和呼吸商第七节 发酵终点的控制第八节 发酵过程的控制http:/ 营养基质和菌体浓度的影响及控制（一）碳源 1、碳源的种类的影响迟效碳源迟效碳源 种类：淀粉、乳糖、蔗糖、麦芽糖、玉米油 优点：不易产生分解产物阻遏效应；有利于延长次级代谢产物的分泌期 缺点：溶解度低，发酵液粘度大。速效碳源速效碳源种类：葡萄糖优点：吸收快，利用快，能迅速参加代谢合成菌体和产生能量缺点：有的分解代谢产物对产物的合成会产生阻遏作用。糖对青霉素生物合成的影响2、碳源的浓度影响发酵过程举例（1）碳分解代谢物阻遏：在某一浓度下碳源会阻遏一个或多负责产物合成的酶。克服该效应一

20、种方法是采用中间补料的方式使补入碳源的速率等于其消耗速率；另一种方法是使用非阻遏性碳源。（2）过高浓度对菌体生长的影响：在重组毕赤酵母发酵生产水蛭素过程中，甲醇既作为碳骨架，使细胞生长，又作为诱导物可以提高产物表达，但甲醇浓度的提高会抑制细胞生长甚至导致细胞死亡。因此，利用甲醇传感器控制甲醇流量，同时以限制性速度混合流加甘油，可获得较高的水蛭素产量。（3）yeast Crabtree effect：即酵母生长在高糖浓度下，即使溶氧充足，它还会进行厌氧发酵，从葡萄糖生产乙醇。因此，一般采用补料分批或连续培养方式来避免crabtree效应。yeast Crabtree effect describ

21、es the phenomenon whereby the yeast, Saccharomyces cerevisiae, produces ethanol (alcohol) aerobically in the presence of high external glucose concentrations rather than producing biomass via the tricarboxylic acid cycle, the usual process occurring aerobically in most yeasts e.g. Kluyveromyces spp.

22、Increasing concentrations of glucose accelerates glycolysis (the breakdown of glucose) which results in the production of appreciable amounts of ATP through substrate-level phosphorylation. This reduces the need of oxidative phosphorylation done by the TCA cycle via the electron transport chain and

23、therefore decreases oxygen consumption. The phenomenon is believed to have evolved as a competition mechanism (due to the antiseptic nature of ethanol) around the time when the first fruits on Earth fell from the trees.Here is the detail of yeast Crabtree effect（二）氮源1、氮源的种类无机氮源和有机氮源无机氮源和有机氮源：发酵工业中常用

24、的无机氮源包括硝酸盐、铵盐、氨水等；有机氮源包括豆饼粉、花生饼粉、蛋白胨、酵母粉、酒糟、尿素等。无机氮源或以蛋白质降解产物形式存在的有机氮源可以直接被菌体吸收利用，这种氮源叫做速效氮源速效氮源，反之为迟效氮源迟效氮源。前者包括氨基态氮的氨基酸或者铵盐形式的硫酸铵和玉米浆等，后者包括黄豆饼粉、花生饼粉、棉籽饼粉等。速效氮源易于被菌体吸收利用，所以有利于菌体生长，却会影响某些产物的的产量；迟效氮源对延长次级代谢产物的分泌期、提高产物产量有好处，但一次性投入容易使养分过早耗竭，导致菌体过早衰老自溶，从而缩短产物分泌期。因此，发酵培养基一般选用含有速效迟效氮源的混合氮源发酵培养基一般选用含有速效迟效氮

25、源的混合氮源。对某些发酵过程来说，培养基中某些氮源的添加有利于该发酵过程中产物的积累，这些主要是培养基中的有机氮源有机氮源作为菌体生长繁殖的营养外，还有作作为产物的前体为产物的前体。无机氮源无机氮源利用会快于有机氮源，但是常会引常会引pH值的变化值的变化，这必须注意随时调整。 2、氮源的浓度氮源浓度过高，会导致细胞脱水死亡，且影响传质；浓度过低，菌体营养不足，影响产量。影响发酵的方向：谷氨酸发酵NH4+供应不足,促使形成-酮戊二酸；NH4+过量,促使谷氨酸转变成谷氨酰胺，所以要控制适量的NH4+浓度 。为调节菌体生长和防止菌体衰老自溶，可根据需要随时补加有机和无机氮源。（三）磷酸盐浓度的影响及

26、控制基础培养基中采用适量的浓度给予控制，以保证菌体的正常生长所需； 代谢缓慢：补加磷酸盐。举例：在四环素发酵中,间歇,微量添加磷酸二氢钾,有利于提高四环素的产量。微生物生长良好时，所允许的磷酸盐浓度为0.32300mmol/L，但次级代谢产物合成良好时所允许的磷酸盐最高水平浓度仅为1mmol/L。因此，在许多抗生素，如链霉素、新霉素、四环素、土霉素、金霉素和万古霉素等的合成中要以亚适量添加。 举例：四环素发酵：菌体生长最适的磷浓度为6570 g/mL,而四环素合成最适磷浓度为2530 g/mL。（四）菌体浓度的影响及控制1、菌体浓度（cell concentration）指单位体积中菌体的含量

27、，是发酵工业中的一个重要参数。它不仅代表菌体细胞的多少，而且反应菌体细胞生理特性不完全相同的分化阶段。在发酵动力学研究中，常采用菌体浓度来计算菌体的比生长速率和产物的比生产速率等动力学参数及相互关系。n菌体浓度的检测浊度法：用于非丝状菌的浓度测定。通常测定420-600nm波长范围内的光密度值（OD）。吸光度要求控制在0.3-0.5。干重法：取一定体积的发酵液离心或过滤，105烘至恒重称重。离心称湿重法：取一定体积的发酵液离心或过滤，自然沉降或离心，测定湿重。2、影响菌体生长速率的因素：菌体生长速率与微生物的种类和自身的遗传特性相关；如：典型的细菌，酵母，霉菌和原生动物的倍增时间分别为45 m

28、in，90 min，3 h和6 h左右，这说明各类微生物增殖速率的差异。 取决于营养物质的种类和浓度，基质浓度与比生长率的关系如右图所示。如：各种碳源和氮源等成分和它们的浓度。上限浓度，基质抑制(渗透压，关键酶，代谢废物)。一些营养物质的上限浓度(g/L)如下：葡萄糖 100，NH4+ 5，PO43- 10。有影响的环境条件有温度,pH值,渗透压和水分活度等因素。3、菌体浓度对产物的影响在适当的比生长速率下，发酵产物的产率与菌浓成正比关系,即 P=QPmc(X)。式中，P 发酵产物的产率(产物最大生成速率或生率),g/(Lh);QPm 产物最大比生成速率,h-1;c(X) 菌体浓度,g/L.初

29、级代谢产物的产率与菌体浓度成正比；而次级代谢产物的生产中，控制菌体的比生长速率比临略高一点的水平，即c(X) c(X)临时，菌体浓度越大，产物的产量才越大。c(X)过高，摄氧率增加，溶氧成为限制因素，使产量降低。控制接种量：接种量指种子液体积和培养液体积之比。一般发酵常用接种量5%10%；抗生素的接种量有时可增至20% 25%，甚至更大。基质含量：营养的配比和中间补料的方式。生长速率取决于基质的浓度，在微生物发酵的研究和控制中，营养条件（含溶氧）的控制至关重要，主要受基质浓度的影响，所以要依靠调节培养基的浓度来控制菌浓。4、发酵中菌体浓度的控制为了获得抗生素最高的生产率，需要采用摄氧速率OUR

30、与传氧速率OTR相平衡时的菌体浓度，也就是传氧速率随菌浓变化的曲线和摄氧速率随菌浓变化的曲线的交点所对应的菌体浓度，即临界菌体浓度c(X)临。（七）基质浓度对发酵过程的影响及补料控制（七）基质浓度对发酵过程的影响及补料控制1. 基质浓度对发酵的影响基质浓度对发酵的影响 2. 补料控制补料控制（1） 基质浓度对微生物生长的影响基质浓度对微生物生长的影响ns时时，可忽略，微生物处于生长状态可忽略，微生物处于生长状态。、皆与皆与T有有关，其关系均可用阿累尼乌斯公式描述关，其关系均可用阿累尼乌斯公式描述：nEE 死亡速率比生长速率对温度变化更为敏感死亡速率比生长速率对温度变化更为敏感 xxdtdxdt

31、dxx1RTE1eARTE2eAhttp:/ 温度对微生物生长的影响温度对微生物生长的影响(续续)n在其最适温度范围内，生长速率随温度升高而增加，在其最适温度范围内，生长速率随温度升高而增加，当温度超过最适生长温度，生长速率随温度增加而迅当温度超过最适生长温度，生长速率随温度增加而迅速下降。速下降。 n不同生长阶段的微生物对温度的反应不同不同生长阶段的微生物对温度的反应不同 n处于延迟期的细菌对温度的影响十分敏感。处于延迟期的细菌对温度的影响十分敏感。n对于对数生长期的细菌，如果在略低于最适温度的对于对数生长期的细菌，如果在略低于最适温度的条件下培养，即使在发酵过程中升温，则升温的破条件下培养

32、，即使在发酵过程中升温，则升温的破坏作用较弱。坏作用较弱。 n处于生长后期的细菌，其生长速度一般主要取决于处于生长后期的细菌，其生长速度一般主要取决于溶解氧，而不是温度。溶解氧，而不是温度。 http:/ 糖比消耗速率糖比消耗速率qs nRighelato假定假定：m维持因子，即生长速率为零时的葡萄糖的消耗维持因子，即生长速率为零时的葡萄糖的消耗。m项项与渗透压调节、代谢产物的生成、迁移性及除繁殖以与渗透压调节、代谢产物的生成、迁移性及除繁殖以外的其它生物转化等过程所需的能量有关。这些过程外的其它生物转化等过程所需的能量有关。这些过程受温度的影响，所以受温度的影响，所以m也和温度相关也和温度相

33、关。B生长系数，即同一生长速率下的糖耗生长系数，即同一生长速率下的糖耗，B值越大，说值越大，说明同样比生长速率下，用于纯粹生长的糖耗越大明同样比生长速率下，用于纯粹生长的糖耗越大。 n改变温度可以控制改变温度可以控制qs和和 Bmqshttp:/ nqs一定一定：n当当TTm时时， m ， , B 底物转化效率低底物转化效率低当当T=Tm时时，mhttp:/ 温度对产物合成的影响温度对产物合成的影响n影响发酵过程中各种反应速率，从而影响微生物的生影响发酵过程中各种反应速率，从而影响微生物的生长代谢与产物生成。长代谢与产物生成。 e.g. 青霉菌发酵生产青霉素青霉菌发酵生产青霉素 青霉菌生长活化

34、能青霉菌生长活化能E1=34kJ/mol 青霉素合成活化能青霉素合成活化能E2=112kJ/mol 青霉素合成速率对温度较敏感青霉素合成速率对温度较敏感http:/ 。n影响生物合成方向。影响生物合成方向。 e.g. 四环素发酵中金色链霉菌：四环素发酵中金色链霉菌：T5.0：酵母形态变小，发酵液变黑，且污染大量细菌酵母形态变小，发酵液变黑，且污染大量细菌 pH0.5% 低低pH6.8控制加糖控制加糖 7% ， OTR逐渐逐渐至至OTR=，即即 ，高位平衡高位平衡 当处于高位平衡时，表明供氧性能好。高位平衡通常发生当处于高位平衡时，表明供氧性能好。高位平衡通常发生在正常情况的前、后期。在正常情况

35、的前、后期。LLaCCKOTR0dtdCLOTR,CC,CLL0dtdCLhttp:/ ，OTRCm, 卷须霉素卷须霉素: n而有些菌株而有些菌株 Ccr CCr，生产阶段满足生产阶段满足CLCm。 http:/ 1）发酵异常指标）发酵异常指标n发酵中污染杂菌，溶解氧发生异常变化。发酵中污染杂菌，溶解氧发生异常变化。 对于好气性杂菌，溶解氧会一反往常在较短时间内跌对于好气性杂菌，溶解氧会一反往常在较短时间内跌到零附近，跌零后长时间不回升到零附近，跌零后长时间不回升。 对于厌气性杂菌，对于厌气性杂菌，溶解氧溶解氧升高。升高。n污染噬菌体或其它不明原因引起污染噬菌体或其它不明原因引起 发酵液变稀，

36、此时发酵液变稀，此时溶解氧溶解氧迅速上升。迅速上升。 n操作故障或事故分析操作故障或事故分析 谷氨酸正常发酵和异常发酵的溶解氧曲线正常发酵溶解氧曲线-异常发酵溶解氧曲线异常发酵光密度曲线http:/ n中间补料是否得当可以从中间补料是否得当可以从溶解氧溶解氧的变化看出。的变化看出。n发酵过程中出现发酵过程中出现“发酸发酸”现象，此时溶解氧很快下降。现象，此时溶解氧很快下降。 http:/ n测量溶解氧可以确定测量溶解氧可以确定CCr、Cm值值n通过溶氧测量可以掌握由好气转为厌气培养的关键时机通过溶氧测量可以掌握由好气转为厌气培养的关键时机 e.g.天门冬酰胺酶发酵天门冬酰胺酶发酵：45%饱和度

37、饱和度 n在酵母以及其他微生物菌体的生产中，溶氧值是控制其代在酵母以及其他微生物菌体的生产中，溶氧值是控制其代谢方向的最好的指标之一谢方向的最好的指标之一 。http:/ n设备反映供氧性能：设备反映供氧性能： 搅拌桨形式搅拌桨形式 叶片形式叶片形式 搅拌器直径搅拌器直径d 搅拌档数搅拌档数m和搅拌器间距和搅拌器间距s 档板宽度档板宽度w和档板数和档板数z 通气：空气分布器的类型和位置通气：空气分布器的类型和位置 n，P/V 设备操作参数设备操作参数 罐压罐压 WS或或VVM搅拌搅拌设备几何参数设备几何参数http:/ 菌种性能：耗菌种性能：耗O2 培养基性能：耗培养基性能：耗O2、供供O2

38、温度：耗温度：耗O2、供供O2 RQ（O2与与CO2水平比较水平比较）：耗耗O2 表面活性剂：耗表面活性剂：耗O2、供供O2http:/ 的调节、中间补水、的调节、中间补水、 添加表面活性剂等等添加表面活性剂等等 对现有发酵工对现有发酵工厂进行技术改造厂进行技术改造 浅层次浅层次 修改设备和工艺修改设备和工艺 规模和控制水平上档次规模和控制水平上档次 引入新型发酵类型引入新型发酵类型 深层次深层次 工艺的改进是否有效可通过溶解氧水平进行评价：工艺的改进是否有效可通过溶解氧水平进行评价： P/V的改变对溶解氧和产量的影响的改变对溶解氧和产量的影响 e.g.利福霉素发酵利福霉素发酵：5080h波谷

39、阶段波谷阶段，P/V，KLa，供氧供氧；3W/L比比1 W/L批号的发酵单位增加约批号的发酵单位增加约900u/ml 搅拌转数搅拌转数n 对溶解氧和产量的影响对溶解氧和产量的影响e.g.赤霉素发酵赤霉素发酵：15 50h期间期间，n从从155 提高至提高至180r/min， 赤霉素单位赤霉素单位http:/ 1）溶解氧控制的一般原则）溶解氧控制的一般原则 n生长阶段生长阶段： 即可即可n产物合成阶段产物合成阶段： 即可即可v过高的溶氧水平反而对菌体代谢有不可逆的抑过高的溶氧水平反而对菌体代谢有不可逆的抑制作用制作用CrLCC mLCC http:/ v控控制原理制原理 发酵过程中，发酵过程中，

40、 糖量糖量 x , QO2 CL 糖量糖量 QO2 CL 补糖使补糖使CL下降，而下降，而CL回升的快慢取决于供氧效率回升的快慢取决于供氧效率。 对于一个具体的发酵，存在一个最适氧浓度对于一个具体的发酵，存在一个最适氧浓度（Cm）水水平，补糖速率应与其相适应。平，补糖速率应与其相适应。 mLCC ，加大补糖速率加大补糖速率 mLCC ，减小补糖速率减小补糖速率实现用溶解氧水平控制补料速率实现用溶解氧水平控制补料速率 http:/ 补糖速率控制在正好使生产菌处于所谓补糖速率控制在正好使生产菌处于所谓“半饥饿半饥饿状态状态”，使其仅能维持正常的生长代谢，即把更，使其仅能维持正常的生长代谢，即把更多

41、的糖用于产物合成，并永远不超过罐设计时的多的糖用于产物合成，并永远不超过罐设计时的KLa水平所能提供的最大供氧速率。水平所能提供的最大供氧速率。 v控制原则控制原则（2）溶氧控制作为发酵中间控制的手段之一溶氧控制作为发酵中间控制的手段之一 http:/ 溶氧和补糖控制系统溶氧和补糖控制系统 溶氧和溶氧和pH控制的系统控制的系统 （2）溶氧控制作为发酵中间控制的手段之一溶氧控制作为发酵中间控制的手段之一 http:/ n供氧方面：供氧方面：提高氧分压（氧分含量），即提高氧分压（氧分含量），即 ，提高供氧能力提高供氧能力改变搅拌转速：通过改变改变搅拌转速：通过改变KLa来提高供氧能力来提高供氧能力

42、 通气速率通气速率Ws ：Ws增加有上限，引起增加有上限，引起“过载过载”、泡沫、泡沫提高罐压：提高罐压： ，但同时会增加，但同时会增加CO2的溶解度，影响的溶解度，影响pH及及可能会影响菌的代谢，另外还会增加对设备的强度要求。可能会影响菌的代谢，另外还会增加对设备的强度要求。n CChttp:/ ，Ii） 加消泡剂，补加无菌水，改变培养基成分加消泡剂，补加无菌水，改变培养基成分改变改变KL改变温度：改变温度： ，提高推动力提高推动力（C*CL）C,Thttp:/ 供氧方面：供氧方面：（3）溶解氧控制的工艺方法（续）溶解氧控制的工艺方法（续）n耗氧方面耗氧方面 n限制性基质的流加控制（补料控制

43、）：在限制性基质的流加控制（补料控制）：在OTR一定情况一定情况下，控制基质浓度下，控制基质浓度限制限制、x 限制限制 控制溶解氧控制溶解氧http:/ n改变搅拌转速的溶氧控制系统改变搅拌转速的溶氧控制系统n改变通气量、转速、罐压所组成的多参数溶氧改变通气量、转速、罐压所组成的多参数溶氧控制系统控制系统 http:/ (AA) 的影响的影响 溶氧量对溶氧量对AA产量的影响产量的影响注：摇床转速注：摇床转速150r/min, 25 KLa越大越大，培养基中溶培养基中溶解氧越多解氧越多, , AA合成速合成速度越快度越快http:/ DO 变化与鸟苷变化与鸟苷 积累的关系积累的关系http:/

44、控制在控制在1020，产物积累产物积累，鸟苷含量最高。，鸟苷含量最高。DO在在5和和30，前期产物积累前期产物积累，但后期基本不增加，但后期基本不增加.DO水平的超高阶段水平的超高阶段(发酵周期发酵周期28h44h)，鸟苷积累量基本不，鸟苷积累量基本不增加；调整增加；调整DO 在适当水平上，鸟苷积累量继续上升。在适当水平上，鸟苷积累量继续上升。 （六）（六）CO2和呼吸商对发酵的影响及其控制和呼吸商对发酵的影响及其控制1. 定义定义 2. 发酵过程中发酵过程中CO2释放率的变化释放率的变化3. . CO2对发酵的影响对发酵的影响 http:/ 定义定义 n 呼吸商呼吸商（RQ）：指菌体呼吸过程

45、中，指菌体呼吸过程中，CO2释放率和菌的耗释放率和菌的耗 氧速率之比，氧速率之比，RQ反映菌的代谢情况反映菌的代谢情况。n菌体耗氧速率菌体耗氧速率 OUR，molO2/Lh 菌体菌体CO2释放率释放率CER，molCO2/LhOURCERRQ http:/ 1）影响尾气中）影响尾气中CO2浓度的因素浓度的因素 n通入空气量通入空气量： n呼吸强度：呼吸强度：nCO2溶解度：溶解度：n菌体量菌体量：出2COC,VVM出，2CO2CO2OCQQ出出，；、2CO2COCPC,TPT出，2CO2COCCERxQxhttp:/ nCO2积累量渐增，与积累量渐增，与x曲线对应，基本类似曲线对应，基本类似S

46、型曲线变化型曲线变化；n当工艺和设备参数一定的情况下当工艺和设备参数一定的情况下，CER与与x有比例关系有比例关系（CER菌体生长速率菌体生长速率）；nCO2浓度变化与浓度变化与O2浓度变化成反向同步关系浓度变化成反向同步关系。http:/ CERdt1- CERdt；2-2-菌量菌量（3）CER的测量与计算的测量与计算 n测量方法：热导、测量方法：热导、红外分析仪红外分析仪、质谱仪、质谱仪n计算计算 fCCC1CCVFxQCER2CO2O2CO2COL2CO进出出出惰进进http:/ 1）研究参数）研究参数CO2的意义的意义 n作为代谢产物或中间前体，尾气中作为代谢产物或中间前体，尾气中CO

47、2积累与生物量积累与生物量 成正比，通过成正比，通过C质量平衡估算生长速率和细胞量。质量平衡估算生长速率和细胞量。n高浓度高浓度CO2对发酵多表现为抑制作用，应实施测量与对发酵多表现为抑制作用，应实施测量与 控制；控制；n尾气尾气CO2不仅直接反映代谢情况，而且和其它参数及不仅直接反映代谢情况，而且和其它参数及补料操作密切相关，可作为工艺优化的指标。补料操作密切相关，可作为工艺优化的指标。 http:/ CO2及及HCO3-都会影响细胞膜的结构，使膜的流动都会影响细胞膜的结构，使膜的流动性及表面电荷密度发生变化，导致许多基质的跨膜运性及表面电荷密度发生变化，导致许多基质的跨膜运输受阻，影响了细

48、胞膜的运输效率，使细胞处于输受阻，影响了细胞膜的运输效率，使细胞处于“麻麻醉醉”状态，细胞生长受到抑制，形态发生改变。状态，细胞生长受到抑制，形态发生改变。 http:/ nCO2, 基质分解速率基质分解速率，ATP ，中间产物中间产物或形态变异或形态变异导致产量导致产量n高浓度高浓度CO2抑制作用的独立性抑制作用的独立性: 只要只要CO2在培养液中浓度在培养液中浓度过量，即使供氧充足过量，即使供氧充足（CLCCr），CO2的抑制作用不能的抑制作用不能解除，这种负作用在放大过程更明显。解除，这种负作用在放大过程更明显。n正确评价通气的作用：正确评价通气的作用：n供氧：供氧：n排废气：排废气：n

49、水分及挥发性组分的散失水分及挥发性组分的散失 LaK,VVMhttp:/ n糖糖、CO2、pH三者的相关性三者的相关性，被青霉素工业生产上用于补被青霉素工业生产上用于补料控制的参数，并认为排气料控制的参数，并认为排气CO2的变化比的变化比pH变化更为敏感，变化更为敏感，所以测定排气所以测定排气CO2释放率释放率 （CER）来控制补糖速率来控制补糖速率。 补糖与溶氧及补糖与溶氧及pH协同控制协同控制 补糖速率与补糖速率与CER控制控制 http:/ n相关程度表示：相关程度表示：n尾气尾气CO2与与O2相关性：反向同步关系相关性：反向同步关系n呼吸商呼吸商（RQ）与发酵的关系与发酵的关系不同菌株

50、、同一菌株不同代谢途径、同一菌株利用不不同菌株、同一菌株不同代谢途径、同一菌株利用不同基质、同一菌株在不同发酵阶段，同基质、同一菌株在不同发酵阶段，RQ值不相同值不相同。RQ值可以表征发酵状况值可以表征发酵状况。 OURCERRQ fCC1CCCVFxQOUR2O2CO2O2OL2O出出出惰进进http:/ 菌体生长阶段菌体生长阶段：RQ0.909 维持阶段维持阶段：RQ=1 生产阶段生产阶段：RQ=4如果产物的还原性比基质大时，其如果产物的还原性比基质大时，其RQ值就增加；反之，当值就增加；反之，当产物的氧化性比基质大时产物的氧化性比基质大时，RQ值就要减少值就要减少，其偏离程度决其偏离程度

51、决定于单位菌体利用基质形成产物的量。定于单位菌体利用基质形成产物的量。 http:/ 基质浓度对发酵的影响基质浓度对发酵的影响 2. 补料控制补料控制http:/ 基质浓度对微生物生长的影响基质浓度对微生物生长的影响nsKS情况下情况下，比生长速率与基质浓度呈直线关系比生长速率与基质浓度呈直线关系：n一般情况下符合一般情况下符合Monod方程式方程式n基质浓度高时基质浓度高时 SkSmaxSkSSmaxSkkiimaxhttp:/ 基质浓度对产物合成的影响基质浓度对产物合成的影响n低浓度限制低浓度限制n低水平诱导低水平诱导n高浓度抑制及分解阻遏作用高浓度抑制及分解阻遏作用e.g.葡萄糖氧化酶发

52、酵葡萄糖氧化酶发酵：葡萄糖用量从：葡萄糖用量从8%降至降至6%，补入补入2%氨基乙酸或甘油，使酶活力分别提高氨基乙酸或甘油，使酶活力分别提高26%或或6.7%。 谷氨酸发酵谷氨酸发酵（乙醇为碳源）：当乙醇浓度为（乙醇为碳源）：当乙醇浓度为2.5g/L和和35g/L时，可延长谷氨酸生产时间，但在更高浓度下，时，可延长谷氨酸生产时间，但在更高浓度下，菌体生长受到抑制，谷氨酸产量降低。菌体生长受到抑制，谷氨酸产量降低。http:/ 补充微生物能源和碳源补充微生物能源和碳源n 补充菌体所需要的氮源补充菌体所需要的氮源n 补充微量元素或无机盐补充微量元素或无机盐n 添加前体、诱导剂等添加前体、诱导剂等（

53、3）补料的原则）补料的原则n中间补料的数量为基础料的中间补料的数量为基础料的13倍倍 。n补料的原则就在于控制微生物的中间代谢，使之向着有补料的原则就在于控制微生物的中间代谢，使之向着有利于产物积累的方向发展。利于产物积累的方向发展。n现有的各种补料措施都是通过实验方法确定的。现有的各种补料措施都是通过实验方法确定的。 http:/ e.g. 谷氨酸发酵谷氨酸发酵 在谷氨酸发酵过程中的某阶段，生产菌的摄氧率和基在谷氨酸发酵过程中的某阶段，生产菌的摄氧率和基质消耗速率之间存在着线性关系。质消耗速率之间存在着线性关系。mmolmmolOxqOURk2S糖耗耗氧量http:/ e.g.青霉素发酵：青

54、霉素发酵：KLa大的设备补料速率相应大些；供大的设备补料速率相应大些；供氧低的设备，补料速率相应减少，产量比供氧能力好氧低的设备，补料速率相应减少，产量比供氧能力好的设备降低的设备降低23。http:/ （ 45h后加）后加）补糖时间过晚补糖时间过晚 （62h开始加）开始加） 补糖时间过早补糖时间过早 （20h后加）后加）http:/ 维持不同还原糖水平的四环素发酵中流加补糖的作用维持不同还原糖水平的四环素发酵中流加补糖的作用http:/ 在最适补加葡萄在最适补加葡萄糖的条件下，能正糖的条件下，能正确控制菌丝量的增确控制菌丝量的增加、糖的消耗与发加、糖的消耗与发酵单位增长三者之酵单位增长三者之

55、间的关系，就可获间的关系，就可获得比采用丰富培养得比采用丰富培养基时更长的生物合基时更长的生物合成期。成期。n 维持不同还原糖水平的四环素发酵中流加补糖的作用维持不同还原糖水平的四环素发酵中流加补糖的作用http:/ 高密度发酵高密度发酵2.高密度发酵策略高密度发酵策略3.高密度发酵技术高密度发酵技术4.高密度发酵存在的问题高密度发酵存在的问题http:/ 高密度发酵高密度发酵n代谢产物的合成是靠菌体作为生产者来完成的。代谢产物的合成是靠菌体作为生产者来完成的。 n高细胞密度发酵就是为了适应这一要求而得到广高细胞密度发酵就是为了适应这一要求而得到广泛的重视。泛的重视。n高密度发酵：在发酵过程中

56、保持较高的细胞密度，高密度发酵：在发酵过程中保持较高的细胞密度，同时细胞或菌体的生产能力保持在较佳的状态。同时细胞或菌体的生产能力保持在较佳的状态。 http:/ (g/L)/d大肠杆菌大肠杆菌需氧、葡萄需氧、葡萄糖过量、形糖过量、形成乙醇成乙醇葡萄糖矿物盐葡萄糖矿物盐或甘油矿物盐或甘油矿物盐搅拌罐搅拌罐葡萄糖（甘油）葡萄糖（甘油）非限制指数补料非限制指数补料140150304090100枯草杆菌枯草杆菌嗜温菌嗜温菌含葡萄糖的完含葡萄糖的完全培养基全培养基搅拌罐搅拌罐补料分批培养，补料分批培养，以葡萄糖调节以葡萄糖调节pH18530160毕氏酵母毕氏酵母嗜温菌嗜温菌葡萄糖矿物盐葡萄糖矿物盐搅拌

57、罐搅拌罐补料分批培养，补料分批培养，补甲醇补甲醇10050120120150酿酒酵母酿酒酵母嗜温菌嗜温菌含葡萄糖的完含葡萄糖的完全培养基全培养基搅拌罐搅拌罐连续培养，流加连续培养，流加葡萄糖葡萄糖2108050150http:/ n优化细胞生长速率，使得碳源能被充分利用和优化细胞生长速率，使得碳源能被充分利用和获得较高的产率，用养分流加来限制菌的生长获得较高的产率，用养分流加来限制菌的生长速率还能控制培养物对氧的需求和产热速率。速率还能控制培养物对氧的需求和产热速率。 n可用碳源作为限制性养分，且采用补料分批发可用碳源作为限制性养分，且采用补料分批发酵来实现高密度发酵。酵来实现高密度发酵。 h

58、ttp:/ 搅拌罐，透析膜反应器，搅拌罐，透析膜反应器， 气升式反应器，气旋式反应器气升式反应器，气旋式反应器 n在工业化生产中，通常采用的是搅拌罐与补料工艺来在工业化生产中，通常采用的是搅拌罐与补料工艺来进行高细胞密度发酵。进行高细胞密度发酵。n重组大肠杆菌高密度发酵成功的关键技术是补料策略，重组大肠杆菌高密度发酵成功的关键技术是补料策略，限制性基质（葡萄糖）的流加模式有限制性基质（葡萄糖）的流加模式有3种：恒速流加补种：恒速流加补料、变速流加补料和指数流加补料。料、变速流加补料和指数流加补料。 http:/ 高密度发酵存在的问题高密度发酵存在的问题n水溶液中的固体与气体物质的溶解度，基质对

59、水溶液中的固体与气体物质的溶解度，基质对生长的限制或抑制作用，基质与产物的不稳定生长的限制或抑制作用，基质与产物的不稳定性和挥发性，产物或副产物的积累达到抑制生性和挥发性，产物或副产物的积累达到抑制生长的水平，高浓度的长的水平，高浓度的CO2与热的释放速率，高与热的释放速率，高的氧需求以及培养基的粘度不断增加等的氧需求以及培养基的粘度不断增加等 。http:/ 泡沫的产生及其影响泡沫的产生及其影响n泡沫的产生泡沫的产生 通气和搅拌通气和搅拌 代谢气体的逸出代谢气体的逸出 存在稳定泡沫的表面活性物质存在稳定泡沫的表面活性物质http:/ 泡沫的产生及其影响泡沫的产生及其影响n泡沫的类型泡沫的类型

60、一类存在于发酵液的液面上。这类泡沫气相所占比例一类存在于发酵液的液面上。这类泡沫气相所占比例特别大，并且泡沫与它下面的液体之间有能分辨的界特别大，并且泡沫与它下面的液体之间有能分辨的界线。如在某些稀薄的前期发酵液或种子培养液中所见线。如在某些稀薄的前期发酵液或种子培养液中所见的泡沫。的泡沫。另一类出现在粘稠的菌丝发酵液当中。这种泡沫分散另一类出现在粘稠的菌丝发酵液当中。这种泡沫分散很细，而且很均匀，也较稳定。泡沫与液体间没有明很细，而且很均匀，也较稳定。泡沫与液体间没有明显的波面界限，在鼓泡的发酵液中气体分散相占的比显的波面界限，在鼓泡的发酵液中气体分散相占的比例由下而上地逐渐增加。例由下而上