药物化学第十三章

1、 第十三章第十三章 生化药物和基因工程药物生化药物和基因工程药物 分析概念分析概念 基本要求基本要求 概述概述 质量检验的基本程质量检验的基本程序与方法序与方法 常用定量分析方法常用定量分析方法及其应用及其应用 练习与思考练习与思考 基本要求基本要求 1 1掌握本类药物质量检验的基本程序与掌握本类药物质量检验的基本程序与方法类型。方法类型。2 2掌握掌握HPLCHPLC法和酶活力测定法在本类药法和酶活力测定法在本类药物测定中的应用。物测定中的应用。3 3熟悉本类药物的范围、种类、质量控熟悉本类药物的范围、种类、质量控制的要点。制的要点。4 4了解本类药物含量测定的其他方法。了解本类药物含量测定

2、的其他方法。 一、防病、治一、防病、治 病的病的三大药源三大药源 第一节第一节 概概 述述biopharmaceutics or biopharmaceuticalsbiochemical drugsbiotechnology drugsbiological products药药物物化化学学药药物物生生物物药药物物中中药药生生化化药药物物生生物物技技术术药药物物生生物物制制品品 1 1生化药物：生化药物： 例例：氨基酸、多肽、蛋白质、酶等。：氨基酸、多肽、蛋白质、酶等。动动物物植植物物微微生生物物提提取取现现代代生生物物技技术术生生命命基基本本物物质质及及衍衍生生物物降降解解物物大大分分子子的

3、的结结构构修修饰饰物物生生物物- -化化学学半半合合成成2. 2. 基因工程药物基因工程药物： 以以DNADNA重组技术生产的蛋白质、多肽、重组技术生产的蛋白质、多肽、酶、激素、疫苗、单克隆抗体和细胞生长酶、激素、疫苗、单克隆抗体和细胞生长因子类药物。因子类药物。DNADNA重组技术（基因工程）：重组技术（基因工程）：生产过程生产过程为为天然基因天然基因合成的核合成的核苷酸序列苷酸序列内切酶内切酶连接酶连接酶载载体体重组重组的遗的遗传物传物质质转转移移到到宿主宿主细胞细胞增殖、表达增殖、表达分离纯化分离纯化目的目的产物产物二、种类二、种类氨基酸、多肽与蛋白质类氨基酸、多肽与蛋白质类酶类与辅酶类

4、酶类与辅酶类多糖类多糖类脂质类脂质类核酸及其降解物和衍生物核酸及其降解物和衍生物类药物类药物1 1生化药物生化药物2 2基因工程药物的种类基因工程药物的种类 1 1）激素类及神经递质类药物：）激素类及神经递质类药物： 人生长激素释放抑制因子、人胰岛人生长激素释放抑制因子、人胰岛素、人生长激素素、人生长激素 2 2）细胞因子类药物：）细胞因子类药物： 人干扰素人白细胞介素、集落刺激人干扰素人白细胞介素、集落刺激因子、促红细胞生成素因子、促红细胞生成素 3 3）酶类及凝血因子类药物）酶类及凝血因子类药物 三、特点三、特点 1. 1. 生物体的基本生化成分生物体的基本生化成分 2. 2. 分子量大分

5、子量大: : 分子量测定分子量测定 3. 3. 结构难确证结构难确证 4. 4. 全过程的质量控制：原料、生产过程、全过程的质量控制：原料、生产过程、 最终产品最终产品 5. 5. 生物活性检查生物活性检查 6. 6. 安全性检查安全性检查 7. 7. 效价（含量）测定：效价（含量）测定： 理化法理化法：有效成分的含量：有效成分的含量 效价测定和酶活力测定效价测定和酶活力测定：有效成分：有效成分 的生物活性的生物活性 生化药物和基因药物质量控制的项目：生化药物和基因药物质量控制的项目： 来源与种类来源与种类 纯度纯度 性状性状 干燥失重或水分干燥失重或水分 鉴别鉴别 炽灼残渣炽灼残渣 氨酸组分

6、分析氨酸组分分析 生物活性生物活性 肽图肽图 热源试验热源试验 糖含量糖含量 含量分析含量分析 第二节第二节 质量检验的基本程序与方法质量检验的基本程序与方法一、鉴别一、鉴别 理化鉴别法：化学鉴别法理化鉴别法：化学鉴别法 紫外分光光度法紫外分光光度法 HPLCHPLC法法生化鉴别法：酶法生化鉴别法：酶法 电泳法电泳法 等电聚焦法等电聚焦法生物鉴别法：家兔惊厥试验生物鉴别法：家兔惊厥试验（一）理化鉴别法一）理化鉴别法 1.1.化学鉴别法化学鉴别法： 例：溶菌酶例：溶菌酶 - CONH- +Cu- CONH- +Cu2+ 2+ 络合显色络合显色药药物物 + + 试试剂剂现现象象颜颜色色沉沉淀淀 2

7、.2.紫外分光光度法紫外分光光度法 溶剂：溶剂：0.01mol/L0.01mol/L盐酸盐酸例：三磷酸腺苷二钠例：三磷酸腺苷二钠 浓度：浓度：20g/ml20g/ml 判断：判断： maxmax：2572571nm1nm A A250250/A/A260260：0.170.170.270.27。3. 3. HPLCHPLC法：法： 利用对照品溶液和供试品溶液色谱图的保留利用对照品溶液和供试品溶液色谱图的保留时间和肽图谱的一致性进行鉴别。时间和肽图谱的一致性进行鉴别。 4. 4.酶法酶法： 例：尿激酶的鉴别例：尿激酶的鉴别-气泡上升法气泡上升法 原理：原理：牛牛 纤纤 维维 蛋蛋 白白 原原牛牛

8、 凝凝 血血 酶酶蛋蛋 白白 结结 块块尿尿 激激 酶酶牛牛 纤纤 维维 蛋蛋 白白 溶溶 酶酶 原原结结 块块 溶溶 解解 ：气气 泡泡 上上 升升 方法方法： 取小试管，加入尿激酶巴比妥溶液、牛纤取小试管，加入尿激酶巴比妥溶液、牛纤维蛋白原溶液，再依次加入牛纤维蛋白溶酶原维蛋白原溶液，再依次加入牛纤维蛋白溶酶原溶液、牛凝血酶溶液，迅速摇匀，立即置溶液、牛凝血酶溶液，迅速摇匀，立即置37370.50.5恒温水浴保温，记时。反应系统在恒温水浴保温，记时。反应系统在30304040秒内凝结，凝结块内有气泡生成，秒内凝结，凝结块内有气泡生成，1515分分钟内凝结块溶解，当凝结块溶解时，气泡逐渐钟内

9、凝结块溶解，当凝结块溶解时，气泡逐渐上升。以上升。以0.9%0.9%氯化钠作空白，同法氯化钠作空白，同法 操作，凝结操作，凝结块在块在2 2小时内不溶。小时内不溶。5. 5. 电泳法电泳法：以肝素鉴别为例。：以肝素鉴别为例。OOOOOOHCOO-OSO3-HNSO3-CH2OSO3-与国家肝素标准品对照，其移动位置相应。与国家肝素标准品对照，其移动位置相应。 6. 6. 生物法生物法： 利用生物体进行试验来鉴别药物。利用生物体进行试验来鉴别药物。 例：家兔惊厥试验鉴别胰岛素。例：家兔惊厥试验鉴别胰岛素。 利用胰岛素的降糖作用。给家兔大利用胰岛素的降糖作用。给家兔大剂量注射胰岛素，家兔惊厥，迅速

10、静注剂量注射胰岛素，家兔惊厥，迅速静注50%GS50%GS，惊厥停止。，惊厥停止。（二）杂质检查二）杂质检查 一般杂质检查一般杂质检查 特殊杂质检查：原料药纯度分析特殊杂质检查：原料药纯度分析 生产过程中杂质的检查生产过程中杂质的检查 1. 1. 原料药纯度分析原料药纯度分析： 多糖类多糖类-低聚糖、核酸、蛋白质低聚糖、核酸、蛋白质 酶类药物酶类药物-酶催化反应基本产物的分析，酶催化反应基本产物的分析， 具有一定活性的其他有关酶的检查。具有一定活性的其他有关酶的检查。例例：胰蛋白酶中糜蛋白酶的检查：胰蛋白酶中糜蛋白酶的检查 选用选用N-N-乙酰乙酰-L-L-酪氨酸乙酯作底物进行糜蛋酪氨酸乙酯作

11、底物进行糜蛋白酶的限度检查。糜蛋白酶的限度为白酶的限度检查。糜蛋白酶的限度为25002500个胰个胰蛋白酶单位中不得大于蛋白酶单位中不得大于5050单位，按每单位，按每1mg1mg胰蛋白胰蛋白酶为酶为25002500个单位和每个单位和每1mg1mg糜蛋白酶为糜蛋白酶为10001000单位，单位，折算成重量，则糜蛋白酶的限度为折算成重量，则糜蛋白酶的限度为5%5%（g/gg/g）。）。1:1000=x:50 x=0.051:1000=x:50 x=0.05（mgmg） L=0.05/1=5% L=0.05/1=5% 2. 2. 生产过程中杂质的检查生产过程中杂质的检查 （三）安全性试验（三）安全

12、性试验 热源试验热源试验 异常毒性试验异常毒性试验 : :急性毒性物质急性毒性物质 过敏试验：异性蛋白过敏试验：异性蛋白 降压物质试验：导致血压降低的杂质、组降压物质试验：导致血压降低的杂质、组 胺、类组胺胺、类组胺 无菌试验：活菌无菌试验：活菌 基因工程药物中可能杂质与污染物检查基因工程药物中可能杂质与污染物检查 来源于宿主细胞的残留来源于宿主细胞的残留DNADNA，外源性杂质，外源性杂质 致突变试验致突变试验 生殖毒性试验生殖毒性试验（四）含量测定（四）含量测定生化药物和基因药物的含量表示方法：生化药物和基因药物的含量表示方法：百分含量百分含量：适用于结构明确的小分子药：适用于结构明确的小

13、分子药 物或经水解后变成小分子的物或经水解后变成小分子的 药物。药物。生物效价或酶活力单位生物效价或酶活力单位：适用于酶类、：适用于酶类、 蛋白质类药物。蛋白质类药物。含量测定方法含量测定方法： 理化分析法理化分析法： 化学分析法：重量测定法、滴定分析法化学分析法：重量测定法、滴定分析法 电化学分析法电化学分析法 光谱分析法：比色法、紫外分光、荧光分光光法光谱分析法：比色法、紫外分光、荧光分光光法 色谱分析法：色谱分析法：HPLCHPLC法：法：RP-HPLCRP-HPLC、 HPIEC HPIEC 、HPGFCHPGFC、 灌注色谱法、灌注色谱法、HPCEHPCE法法 酶法酶法：酶活力测定法

14、、酶分析法：酶活力测定法、酶分析法 电泳法电泳法 生物检定法生物检定法 1 1电化学分析法电化学分析法 药物膜电极药物膜电极 生物组织膜电极生物组织膜电极 药物电极药物电极 微生物电极微生物电极 离子选择性电极法离子选择性电极法 免疫电极免疫电极 免疫场效应管免疫场效应管 酶电极酶电极 第三节第三节 常用定量分析方法及其应用常用定量分析方法及其应用 2. HPLC2. HPLC法法 1 1）RP-HPLCRP-HPLC：柱前衍生化自动测定氨基酸：柱前衍生化自动测定氨基酸 柱：柱：RP18RP18， 柱温：柱温：48 48 流动相：流动相：A-0.05% TFAA-0.05% TFA；B-B-乙

15、腈乙腈- -异丙醇（异丙醇（4 4：1 1） 梯度洗脱梯度洗脱 荧光检测器：荧光检测器： exex=280nm=280nm340nm,340nm, emem=430nm=430nm 测定测定： 样品样品-肽肽 样品水解：样品水解：5.7mol/L5.7mol/L盐酸，盐酸，0.1%0.1%苯酚、通苯酚、通N N2 2， 110110，20h 20h 24h24h。 样品干燥：真空样品干燥：真空 样品的衍生化：丹酰氯样品的衍生化：丹酰氯 水解剩余的衍生化试剂：水解剩余的衍生化试剂：0.4mol/L NaOH0.4mol/L NaOH 进样测定进样测定N(CH3)2SO2ClR-NH2SO2NHR

16、N(CH3)2+ 2 2）HPIECHPIEC 测定对象：蛋白质，多肽测定对象：蛋白质，多肽 柱：离子交换键合相柱：离子交换键合相 流动相：流动相：0.3mol/L0.3mol/L1.0mol/L1.0mol/L的盐的缓冲液。的盐的缓冲液。 梯度洗脱：盐的浓度增大。尽量避免使用卤梯度洗脱：盐的浓度增大。尽量避免使用卤 素类盐素类盐 特点：特点：可回收活性蛋白可回收活性蛋白。 3 3）HPGFCHPGFC 应用：蛋白质、多肽的分离及分子量测定。应用：蛋白质、多肽的分离及分子量测定。 示例：重组人肿瘤坏死因子衍生物的分子量示例：重组人肿瘤坏死因子衍生物的分子量 的测定的测定 柱：柱：Beckman

17、 Ultraspherogel SEC 3000Beckman Ultraspherogel SEC 3000 流动相：流动相：0.1mmol/LKH0.1mmol/LKH2 2POPO4 4:0.1mmol/LNa:0.1mmol/LNa2 2SOSO4 4 （1:11:1）0.05%0.05%叠氮化钠叠氮化钠标准蛋白分子量曲线的制备标准蛋白分子量曲线的制备： 醛缩酶醛缩酶血清白蛋白血清白蛋白右旋糖苷蓝右旋糖苷蓝 碳酸酐酶碳酸酐酶抑蛋白酶肽抑蛋白酶肽 酪氨酸酪氨酸T T0 0 完全排阻完全排阻完全进入填料空隙完全进入填料空隙 T Tt t标准蛋白分子量曲线：标准蛋白分子量曲线：K Kd d

18、- lg M.W. - lg M.W. 样品测定：样品测定： Kd =T -T0Tt - T0测测定定样样品品的的 T T查查出出K Kd d计计算算l lg g M M. .W W. .计计算算M M. .W W. .应用示例应用示例：ChPChP（20002000）重组人胰岛素的质量控制）重组人胰岛素的质量控制 1 1）鉴别：）鉴别： 法法1 1：在效价测定项下，供试品主峰的保留时间：在效价测定项下，供试品主峰的保留时间 应与对照品的一致。应与对照品的一致。 法法2 2：供试品与对照品分别经过酶解后，再分别：供试品与对照品分别经过酶解后，再分别 进行梯进行梯 度洗脱，供试品的肽图谱与对照品

19、度洗脱，供试品的肽图谱与对照品 的肽图谱一致。的肽图谱一致。 2 2）检查：）检查： 检查项目：有关物质、高分子蛋白、锌、氮、检查项目：有关物质、高分子蛋白、锌、氮、 干燥失重、无菌、细菌内毒素。干燥失重、无菌、细菌内毒素。 有关物质：供试液经梯度洗脱，按峰面积归一化有关物质：供试液经梯度洗脱，按峰面积归一化 法计算有关物质的量不得超过法计算有关物质的量不得超过3.0%3.0%。 高分子蛋白质：高分子蛋白质： 固定相固定相：色谱用亲水硅胶，它可以分离分子量：色谱用亲水硅胶，它可以分离分子量 为为5000500060006000的球状蛋白。的球状蛋白。流动相流动相：0.4mol/L 0.4mol

20、/L 碳酸氢铵碳酸氢铵- -乙腈（乙腈（69 : 3169 : 31）测定测定：分别测定供试液（：分别测定供试液（1mg/ml1mg/ml）和对照液（将）和对照液（将供试液稀释成供试液稀释成0.01mg/ml0.01mg/ml），供试液显示的所有），供试液显示的所有分子量大于重组人胰岛素单体的各峰面积之和，分子量大于重组人胰岛素单体的各峰面积之和，应不大于对照液主峰面积（限量应不大于对照液主峰面积（限量1.0%)1.0%)。 3）效价测定：）效价测定：固定相：固定相：ODS CODS C1818 流动相：硫酸盐缓冲液流动相：硫酸盐缓冲液- -乙腈（乙腈（74742626） 系统适用性试验系统适

21、用性试验：测定胰岛素主峰和：测定胰岛素主峰和A A2121脱氨胰脱氨胰 岛素峰之间的分离度与拖尾因子。岛素峰之间的分离度与拖尾因子。含量测定含量测定：分别进样供试液和对照液，按峰面积：分别进样供试液和对照液，按峰面积 外标法计算含量。外标法计算含量。3.3.灌注色谱法灌注色谱法 固定相：聚苯乙烯二乙烯高度交联结构上构固定相：聚苯乙烯二乙烯高度交联结构上构 成贯穿孔成贯穿孔 颗粒分离介质颗粒分离介质-POROS-POROSR R。 双模式孔结构：双模式孔结构：8080150nm150nm大扩散孔大扩散孔 600600800nm800nm贯穿孔贯穿孔 允许液体传送流经过分离介质内表面，使允许液体传

22、送流经过分离介质内表面，使样品由流动相直接灌注入介质颗粒中，扩散作样品由流动相直接灌注入介质颗粒中，扩散作用不再是主要的。用不再是主要的。 介质颗粒内部可利用反应的表面积增加，介质颗粒内部可利用反应的表面积增加，容量和分辨率也随之增加，可使生物活性大分容量和分辨率也随之增加，可使生物活性大分子快速分离纯化。子快速分离纯化。灌灌注注色色谱谱预预添添充充柱柱分分析析型型F F系系列列：用用于于B Bi io oC CA AD D工工 作作站站或或中中压压系系统统M M系系列列：用用于于B Bi io oC CA AD D工工作作站站和和 传传统统H HP PL LC C的的分分离离纯纯化化P P系

23、系列列：用用于于低低压压、B Bi io oC CA AD D 工工作作站站或或中中压压系系统统制制备备型型H H系系列列：用用于于B Bi io oC CA AD D工工作作站站 和和传传统统H HP PL LC C系系统统（POROS 10）灌灌注注色色谱谱预预添添充充柱柱反反相相柱柱阴阴离离子子交交换换柱柱阳阳离离子子交交换换柱柱亲亲和和色色谱谱柱柱活活化化的的亲亲和和色色谱谱柱柱疏疏水水性性相相互互作作用用色色谱谱柱柱R2 2酶活力测定法酶活力测定法 1 1）基本）基本原理原理： 酶活力是指酶催化一定化学反应的能力。酶活力是指酶催化一定化学反应的能力。酶活力测定实质上是测定一个被酶所催

24、化的化酶活力测定实质上是测定一个被酶所催化的化学反应速度。酶反应速度越快所表示的酶活力学反应速度。酶反应速度越快所表示的酶活力越高。越高。 酶反应速度可以用单位时间反应底酶反应速度可以用单位时间反应底物的减少或产物的增加来表示。物的减少或产物的增加来表示。 通常酶活力测定时，先制备通常酶活力测定时，先制备酶反应酶反应进程曲线进程曲线和和酶浓度曲线酶浓度曲线。通过酶反应速。通过酶反应速度的测定，求得酶的浓度或含量。度的测定，求得酶的浓度或含量。酶反应进程曲线酶反应进程曲线 纵坐标为底物或产物的变化纵坐标为底物或产物的变化量，横坐标为反应时间，曲线斜率表示反应速量，横坐标为反应时间，曲线斜率表示反

25、应速度。从酶反应进程曲线求得反应的初速度。度。从酶反应进程曲线求得反应的初速度。酶浓度曲线酶浓度曲线 纵坐标为反应速度，横坐标为酶纵坐标为反应速度，横坐标为酶量。通过酶浓度曲线检验反应测定系统是否适量。通过酶浓度曲线检验反应测定系统是否适宜。宜。 酶活力测定的酶活力测定的要求：要求：测得的反应速度测得的反应速度必须和酶浓度有线性的比例关系，这必须和酶浓度有线性的比例关系，这也是检验酶反应和测定系统是否适宜、也是检验酶反应和测定系统是否适宜、正确的标准。正确的标准。2 2）酶促反应的）酶促反应的条件条件及及影响因素影响因素 底物的浓度底物的浓度：一般选用底物的浓度：一般选用底物的浓度S=100K

26、S=100Km m。 pHpH：选用一个适宜的缓冲离子和离子强度、：选用一个适宜的缓冲离子和离子强度、 适宜的适宜的pHpH值的缓冲系统来控制值的缓冲系统来控制pHpH。 温度温度：酶反应的温度通常选用：酶反应的温度通常选用2525、3030或或 3737，实验中温度变动应控制在，实验中温度变动应控制在0.10.1以内。以内。 辅助因子辅助因子：有些酶需要金属离子，有些需要：有些酶需要金属离子，有些需要 相应的辅酶。相应的辅酶。空白和对照试验空白和对照试验： 空白试验：是指杂质反应和自发反应引空白试验：是指杂质反应和自发反应引起的变化量，它提供的是未知因素的影响。起的变化量，它提供的是未知因素

27、的影响。空白值可以通过不加酶，或不加底物，或二空白值可以通过不加酶，或不加底物，或二者都加（酶预先经过失效处理）。者都加（酶预先经过失效处理）。 对照试验：是指用纯酶或标准酶制剂测对照试验：是指用纯酶或标准酶制剂测得的结果，主要作为比较或标定的标准。得的结果，主要作为比较或标定的标准。 3 3）测定方法：）测定方法： 取样测定法：取样测定法：酶酶反反应应不不同同的的时时间间取取样样终终止止反反应应测测定定酶酶变变性性剂剂：5 5% % 三三氯氯醋醋酸酸 3 3% % 高高氯氯酸酸 其其它它酸酸、碱碱、醇醇类类加加热热：使使酶酶失失效效连续测定法连续测定法：在反应过程中对反应系统进：在反应过程中

28、对反应系统进行直接连续检测。行直接连续检测。检测方法：检测方法：紫外紫外- -可见分光光度法可见分光光度法 旋光法旋光法荧光分光光度法荧光分光光度法 电化学测定法电化学测定法 酶偶联测定法酶偶联测定法 离子选择性电极测定法等。离子选择性电极测定法等。 示例：胰蛋白酶效价测定示例：胰蛋白酶效价测定胰蛋白酶胰蛋白酶 肽键、酰氨键、酯键（碱性氨基酸）肽键、酰氨键、酯键（碱性氨基酸）水解速率：酯键水解速率：酯键酰氨键酰氨键肽键肽键供试品溶液：供试品溶液：50506060单位单位/ml/ml底物溶液：底物溶液：N-N-苯甲酰苯甲酰-L-L-精氨酸乙酯精氨酸乙酯 浓度：浓度：A A：0.5750.575.

29、0585.0585N-N-苯甲酰苯甲酰-L-L-精氨酸乙酯精氨酸乙酯 N-N-苯甲酰苯甲酰-L-L-精氨酸精氨酸 253nm253nm处的处的A A随酶促反应递增，根随酶促反应递增，根据酶活力单位定义计算酶活力。据酶活力单位定义计算酶活力。H2N-C-NHCH2CH2CH2-CH-COOC2H5NHNH-CO-酶活性单位酶活性单位：在最适的条件下，每分钟能：在最适的条件下，每分钟能转化一个微摩尔底物的酶量定为一个活性转化一个微摩尔底物的酶量定为一个活性单位。单位。测定测定：空白：底物溶液空白：底物溶液 + 0.001mol/L HCl+ 0.001mol/L HCl 每每30s A30s A的

30、改变：的改变：0.0150.0150.0180.018，呈线性关系的时间不得少于呈线性关系的时间不得少于3min3min。供供试试品品溶溶液液 + + 底底物物溶溶液液计计时时摇摇匀匀25.0。C+0.5。C测测定定：每每隔隔 3 30 0 s s，读读取取A A，共共 5 5 m mi in n A A每分钟改变每分钟改变0.0030.003，相当于，相当于1 1个胰蛋个胰蛋白酶单位。白酶单位。 供试液的供试液的A A每分钟改变每分钟改变A1 - A2T相当于的单位数为相当于的单位数为每每mgmg供试品中含胰蛋白酶单位数为供试品中含胰蛋白酶单位数为0.003:1A1 - A2T=:XA1 -

31、 A20.003TA1 - A20.003TWP =A1A20.003 T W 重组人白细胞介素重组人白细胞介素 1111的胰蛋白酶切肽的胰蛋白酶切肽图分析图分析 肽图分析是评价重组产品蛋白质结构肽图分析是评价重组产品蛋白质结构及其生产工艺稳定性的重要方法及其生产工艺稳定性的重要方法, ,目前常用目前常用的方法有裂解的方法有裂解- -微微量肽图法和胰蛋白酶切量肽图法和胰蛋白酶切 肽图肽图法法。 1 1。酶切条件。酶切条件 取浓度为取浓度为3 3-1-1的样品的样品0 40 4对对1%1%4 43 3充分透析充分透析, ,然后取透析样品然后取透析样品250250至微量进样瓶至微量进样瓶, ,加加0 30 3-1-1处理处理的胰蛋白酶的胰蛋白酶1010混匀混匀, ,于于3737温控自动进样器温控自动进样