现代生物技术概论完整章

1、 参 考 书 1、宋思扬、楼士林主编生物技 术概论。 2、瞿礼嘉、顾红雅、胡平、陈章 良主编现代生物技术导论。 第一章第一章 生物技术总论生物技术总论 第一节第一节 生物技术的概念生物技术的概念 一、生物技术的定义一、生物技术的定义 生物技术(biotechnology),有时也称生物 工程(bioengineering),是指人们以现代生命 科学为基础,结合先进的工程技术手段和其他 基础学科的科学原理,按照预先的设计改造生 物体或加工生物原料,为人类生产出所需产品 或达到某种目的。 二、二、 生物技术的种类及相互关系生物技术的种类及相互关系 1 1、基因工程、基因工程(gene engine

2、ering)(gene engineering) 是应用人工方法把生物的遗传物质脱氧核 糖核酸(DNA)分离出来,在体外进行切割,拼接和 重组。然后将重组DNA导入某种宿主细胞或个体 ,从而改变它们的遗传品性, 使新的遗传信息在 新的宿主细胞或个体中大量表达,以获得基因产 物(多肽或蛋白质)。基因工程也称DNA重组技术。 2 2、细胞工程、细胞工程(cell engineering)(cell engineering) 细胞工程是指以细胞为基本单位,在体外条 件下进行培养、繁殖,或人为地使细胞某些生物 学特性按人们的意愿发生改变,从而达到改良生 物品种和创造新品种, 加速繁育动、植物个体, 或

3、获得某种有用的物质的过程。所以细胞工程应 包括动、植物细胞的体外培养技术、细胞融合技 术(也称细胞杂交技术)、细胞器移植技术等。 3 3、酶工程、酶工程(enzyme engineering)(enzyme engineering) 酶工程是利用酶、细胞器或细胞所具有的 特异催化功能,对酶进行修饰改造,并借助生物 反应器和工艺过程来生产人类所需产品的一项 技术。它包括酶的固定化技术、细胞的固定化 技术、酶的修饰改造技术及酶反应器的设计等 技术。 4 4、发酵工程、发酵工程(fermentation engineerig)(fermentation engineerig) 利用微生物生长速度快、

4、生长条件简单以 及代谢过程特殊等特点,在适合条件下,通过现 代化工程技术手段,由徽生物的某种特定功能生 产出人类所需的产品称为发酵工程,有时也称微 生物工程。 5 5、蛋白质工程、蛋白质工程(protein engineering)(protein engineering) 是指在基因工程的基础上,结合蛋白质结 晶学,计算机辅助设计和蛋白质化学等多学科 的基础知识,通过对基因的人工定向改造等手 段,从而达到对蛋白质进行修饰、改造,拼接以 产生能满足人类需要的新型蛋白质。 三、生物技术涉及的学科三、生物技术涉及的学科 1、所有生物科学的次级学科：包括分子 生物学、细胞生物学、微生物学、免疫生物

5、学、人体生理学、动物生理学、植物生理学、 微生物生理学、生物化学、生物物理学、遗 传学等。 2、其它学科：化学、化学工程学、数学、 微电子技术、计算机科学等。 生物技术所涉及的行业种类生物技术所涉及的行业种类 第二节第二节 生物技术发展简史生物技术发展简史 一、传统生物技术的产生一、传统生物技术的产生 乳腐、酱和醋、酒发酵、泡菜、制作面 包、天花的活疫苗、青霉素大规模发酵等。 二、二、 现代生物技术的发展现代生物技术的发展 20世纪未,国际著名的新闻媒体评选20世纪100 件大事,在包括政治、经济、文化、历史、战争和科学 等100件大事中，涉及自然科学的大事大部分属于生命 科学领域。 * 19

6、281942年Fleming发现青霉素 * 1953年Watson Crick首次提出DNA双螺旋结构模 型 * 1973年Tanley Cohn 、Paul Boyer、 Paul Berg 分别完成DNA体外重组 * 1997年Roslin、Ian Wilmut、Leith Campbell， 完成了首例克隆羊“多莉”。 除媒体评选以外，还有很多除媒体评选以外，还有很多 * * 2000年6月26日，人类基因组工作框架图 完成。 * 2001年，人类干细胞研究取得重大突破。 * 2002年，世界科学杂志发表了中国科学家 完成的世界第一张籼稻基因组精细图。 * 2003年，一些重大疾病相关的

7、基因被发现。 * 2005年，人类X染色体基因测序完成，微 RNA调节身体中大部分基因的表达功能被发现， 人类蛋白质相互作用首张，图谱完成。 分子生物学 微生物学 生物化学 遗传学 细胞生物学 化学工程 计算机科学 农业生物技术 医药生物技术 航天生物技术 军事生物技术 环境生物技术 海洋生物技术 现代生物技术 第三节第三节 生物技术对经济社会发展的影响生物技术对经济社会发展的影响 一、改善农业生产、解决食品短缺一、改善农业生产、解决食品短缺 (l)(l)、 提高农作物产量及其品质提高农作物产量及其品质 A、培育抗逆的作物优良品系 B、植物种苗的工厂化生产 C、提高粮食品质 D、生物固氮,减少

8、化肥使用量 (2) (2) 发展畜牧业发展畜牧业 A A、动物的大量快速无性繁殖（克隆技术）、动物的大量快速无性繁殖（克隆技术） 1996年英国Dolly(多利)羊的诞生标志着克隆技术 的成功。其核细胞取自6岁的芬兰多特种羊处于晚期妊 娠阶段的母羊。 卵细胞取自苏格兰黑脸种母羊。 用电 冲击法使乳腺细胞核进入去核卵细胞的胞质体中,将融 合细胞置于羊的结扎的输卵管中, 6天后发育为桑椹期 胚胎或胚囊(8-16个细胞), 再转移至母羊子宫内。经 148天的妊娠期,多利羊出生了。出生时体重6.6公斤。1 997年二月才进行了报道， 引起了世界轰动， 许多科学家对此表示怀疑。1998年,经DNA微卫

9、星分析表明,多利羊确属体细胞克隆动物。 克 隆羊“多利”,有较大的技术难度, 将434个乳腺 细胞核移植到434个去核卵中,产生的融合细胞 为277个,成功率为63.8。 将277个融合细胞 移植到输卵管中成功者247个, 成功率为89.2%， 247中, 在输卵管中能够发育到桑椹期胚胎者 29,成功率为11.7。 将29个桑椹期胚胎移植 到13只代理羊子宫中,成功者1个。 * 1998年7月, 美国用小鼠卵丘细胞克隆了 27只存洁小鼠,并连续克隆三代,获得50只小鼠。 * 1999年1月，美国用牛耳细胞克隆出牛。 * 同年日本石川县畜产品综合中心利用成年 牛耳细胞克隆出了二条牛。 * 英国P

10、PL公司克隆出转基因羊和转基因牛。 * 1999年12月, 我国济南山东农科院动物克 隆科研课题小组成功克隆了二只兔。 * 2000年3月，英国PPL公司克隆的5只小猪 在美国弗吉尼亚公司降生。 * 2000年7月日本成功诞生了世界首头胚胎 细胞核移植克隆猪。 * 2000年龄月中国用一只山羊的耳细胞克隆 山羊获得成功。 B B、培育动物的优良品系、培育动物的优良品系 利用转基因技术,将与动物优良品质有关 的基因转移到动物体内,使动物获得新的品质。 例如1983年美国学者将大鼠的生长激素基 因导入小鼠的受精卵中,使转基因小鼠的生长 速度比变通小 鼠快50%。 转基因蚕转基因蚕 导入抗病或抗寄生

11、虫的外源基因，牛便不怕“ 疯牛病“，猪便不怕瘟从而使畜牧业”旱涝保 收“，成为”黄金“产业。 转基因动物还将是人类最好的“器官库”，提 供从皮肤、角膜，到心、肝、肾等几乎所有的“ 零件“。让器官移植专家有充分施展才华的用武 之地，让体内部分“零部件”出了故障的病人重获 生的希望。 二、二、 提高生命质量提高生命质量. .延长人类寿命延长人类寿命 医药生物技术是生物技术领域中最活跃,产 业发展最迅速，效益最显著的领域。其投资比例 及产品市场均占生物技术领域的首位。 生物技术在医药领域的应用涉及到新药开发 、新诊断技术、预防措施及新的治疗技术。 （1 1）、开发制造奇特而又贵重的新型药品）、开发制

12、造奇特而又贵重的新型药品 * 生产抗生素。 * 转基因羊生产人凝血因子和抗胰蛋白 酶。用传统生物技术生产的产品，成本需800 5 000美元的，利用转基因动物只需0.5美元! 美国每年要有600万人输血，才够本国血友 病人所需的凝血因子，而以后只要2头转基因牛 就可代劳。 三只名为“连连”、“田田”和“云云”的小山羊，憨态可 掬地亮相于顺义三高科技农业试验示范区，这是我国首 例3只转有人抗胰蛋白酶基因的转基因山羊。 * 转基因牛生产人促红细胞生成素。这头取名 为“滔滔”的转基因试管牛诞生于1999年2月19日， 出生时体重38公斤。经检测，它的身上携带有科 研人员导入的人蛋白基因。 * 转基因

13、按蚊 ，短期目标是培育出失去传播疟 原虫能力的按蚊，而长期目标则是让它们逐渐取 代大自然中危害人类健康的按蚊，从而达到彻底 消灭疟疾的目的。 * 转基因猪生产人体球蛋白等。 * 生产人生长激素释放抑制激素, 该激素可 抑制生长激素、胰岛素和胰高血糖素的分泌,用 来治疗肢端肥大症和急性胰腺炎。 如果用常规 方法生产该激素, 50万头羊的下丘脑才能生产 5mg, 而用大肠杆菌生产,只需9L细菌发酵液。 * 生产人胰岛素、人生长激素、人干扰素、 生产肿瘤坏死因子、集落刺激因子。 目前全世界已有20多种基因工程药物面市 。另外还有约400多种生物制剂正在进行临床 试验。1987年所有上市的基因工程药品

14、价值约 5.4亿美元,到了1993年,10种主要基因工程药品 的经销额已接近77亿美元。2003年达到130亿 美元。 （2 2）、疾病的预防和诊断）、疾病的预防和诊断 利用细胞工程技术可以生产单克隆抗体。单 克隆抗体既可用于疾病治疗,又可用于疾病的诊 断。如用于肿瘤治疗的“生物导弹”，就是将治 疗 肿瘤的药物与抗肿瘤细胞的抗体联结在一起,利 用抗体与抗原的亲和性,使药物集中于肿瘤部位 以杀死肿瘤细胞,减少药物对正常细胞的毒副作 用。单克隆抗体更多地是用于疾病的诊断和治疗 效果的评价。目前单克隆抗体用于免疫检测大约 占全部诊断试剂的30%, 其利润达l00亿美元。 （3 3）基因治疗）基因治疗

15、 导入正常的基因来治疗由于基因缺陷而引起 的疾病,如美国FDA批准了用ADA(腺苷脱氨酶)基 因治疗严重联合型免疫缺陷病(一种单基因遣传 病),并取得了较满意的结果。 目前已有涉及到恶性肿瘤、遗传病、代谢性 疾病、传染病等90个基因治疗方案通过了FDA的 审查,其中60个方案正在实施中。我国血友病、 地中海贫血、恶性肿瘤等多个基因洽疗方案正在 实施中。 三、解决能源危机、治理环境污染三、解决能源危机、治理环境污染 （1）、 解决能源危机：生物替代能源 （2）、 环境保护：“三废”治理。 四、四、 制造工业原料、生产贵重金属制造工业原料、生产贵重金属 (1）、 制造工业原料 （2） 、生产贵重金

16、属 第四节第四节 生物技术的安全及其对伦理、生物技术的安全及其对伦理、 道德、法律的影响道德、法律的影响 (一)转基因作物品种商业化的主要问题 1、安全性问题：即转入的某一特性对最终 产品使用的影响，特别是作为食品，对人体有 无不良影响；在遗传转化过程中作为选择标记 使用的抗生素的安全性； 导入植物的DNA序列 在加工过程中可能出现的改变，都是值得考虑 的问题。 2、转基因DNA的移动性： 这种DNA是否会 转至其它作物或杂草，因而引起环境及生态的 恶化，因此在作转基因植物田间试验时，首先 必须考虑隔离区的大小，周围有无可有性杂交 的作物或杂草。 3、 对其它农业措施的后效应，如农药、作 物遗

17、传背景狭窄，对发展中国家农业及农产品 出口的影响。 4、公众的接受性：即心理因素。 水果或 蔬菜(如番茄)均会系统感染病毒，因此人们生 食水果或蔬菜，实际上每天都在摄入病毒外壳 蛋白，但 “你愿意吃带病毒外壳蛋白的转基 因番茄吗” ? 5 5、动物克隆引起的争论、动物克隆引起的争论 * 伦理方面：克隆人将彻底搞乱世代的概 念和传统的生育模式。其次，有可能激活优生 思想。再者，可能会有人进一步研究人猴杂目 科或人猪杂种。 * 道德方面：从“克隆人”身上取器官是不 道德的。 * 生物学方面：物种多样性减少，群体生 存能力降低，这样会严重影响社会安全，导致 社会混乱，因此全世界严禁“克隆人”研究。

18、第二章第二章 基因工程基因工程 基因的概念：具有特殊功能的DNA片段，即 能编码一条多肽链或功能RNA所必须的全部核苷 酸序列。基因控制性状。 1、 DNA的概念：由二条多核苷酸链构成的 右旋的双螺旋结构。 2 2、基因工程的理论依据、基因工程的理论依据 (1)、不同的基因具有相同的物质基础DNA （2）、基因可以切割 （3）、基因可以转移重组 （4）、多肽与基因之间存在对应关系 （5）、遗传密码是通用的 （6）、基因可以遗传 第一节第一节 DNADNA重组重组 是应用人工方法把生物的遗传物质脱氧核 糖核酸(DNA)分离出来,在体外切割成片段,再 有目的拼接,形成重组DNA,使遗传信息发生预

19、期的改变。 一、 DNADNA 1、DNA的组成 2、结构 3、特点（变性与复性） 2. DNA2. DNA的功能的功能 (1)、在细胞中进行复制：半保留复制和半 不连续复制。 生物体单个的DNA复制单位叫复制子，一个 复制子只有一单独的起始位点。原核生物的基 因只的一个复制子，而真核生物的基因组（染 色体）包含多个复制子。 （2）、携带遗传信息，控制蛋白质的合成。 遵循中心法则：DNA转录形成MRNA，MRNA翻译成 蛋白质。 遗传密码：MRNA上决定一个氨基酸分子的三 个连续的核苷酸序列叫遗传密码或三联密码。 二、二、 限制性内切核酸酶和限制性内切核酸酶和DNADNA片段化片段化 1、 限

20、制性内切核酸酶 能识别DNA链上的某一位点的磷酸二酯键， 如EcoR,Hind,BamH。 2、限制性内切核酸酶的识别序列 指能被限制性内切核酸酶识别的DNA上的 序列,常用5 3链上的碱基序列表示,如AAGGTT 3、限制性内切核酸酶的酶切位点 一般在识别系列的内部,有的在识别系列的 两侧,切割后有的为粘性未端,有的为平未端。 4、限制性内切核酸酶反应系统 酶、底物、温度、缓冲液 5、限制性内切核酸酶酶切DNA的方法 单酶切、双酶切、 部分酶切 三、特异性三、特异性DNADNA片段的片段的PCRPCR的扩增的扩增 1、 PCR（聚合酶链式反应）的基本原理 基本原理为：DNA复制扩增,分升温变

21、性(90- 95)、降温复性(37-60) 、延伸(70-75) 三个阶段。 2 、耐热性DNA聚合酶：如TaqDNA聚合酶。 3 、PCR引物:由20-30个核苷酸构成。 4 、DNA片段PCR扩增系统:使用PCR仪 四、四、DNADNA片段的化学合成片段的化学合成 使用DNA合成仪合成小分子的DNA： 1、合成引物 2、合成寡核苷酸连杆 3、合成基因片段 五、五、DNADNA片段的连接重组片段的连接重组 1、DNA连接酶（DNA ligase) 能催化形成磷酸二酯键，常见的如E.coli DNA 连接酶（只能催化粘性未端的连结）、T4 DNA连接酶（既能连接粘性未端，也能连接平 未端）。

22、2 2、 DNADNA片段之间的连接片段之间的连接 （1）、粘性未端之间的连接 （2）、平未端之间的连接 （3）、未端修饰后进行连接：使用核酸外切 酶将粘性未端修饰成平未端， 采用未端脱氧核 苷酸转移酶将平未端修饰成互补粘性未端。 （4）、加连杆后进行连接： 人工合成连杆， 再用限制性核酸内切酶切成平未端或互补粘性 未端。 3、DNA重组类型 （1）、插入重组 （2）、置换重组 第二节第二节 基因克隆载体（基因克隆载体（gene cloning vector) 能够承载外源基因，并将其带入受体细胞 得以稳定维持的DNA分子称为基因克隆载体。 它必须具备以下几个条件: (1)、 在克隆载体合适的

23、位置必须含有允许 外源DNA片段组入的克隆位点， 并且这样的克 隆位点应尽可能的多。 质粒载体中往往组装一 个含多种限制性内切核酸酶识别序列的多克隆 位点(Mcs)连杆。 (2)、克隆载体能携带外源DNA片段(基因) 进入受体细胞，或停留在细胞质中进行自我复 制，或整合到染色体DNA或线粒体DNA、叶绿体 DNA中，随这些DNA同步复制。 (3)、克隆载体必须含有供选择转化子的 标记基因或报告基因。 如根据转化子抗药性进行筛选的氨苄青 霉素抗性基因( ap或ampr)、氯霉素抗性基因 (cat或cmr)、卡那霉素抗性基因(kn或kanr)、 链霉素抗性基因(sm或strr)、四环素抗性基 因(

24、tcr或tetr)等. 表达产物容易观察和检测的报告基因如 gus(葡萄醛酸酐酶基因)、gfp(绿色荧光蛋 白基因)等。 (4)、克隆载体必须是安全的， 不含有对 受体细胞有害的基因，并且不会任意转入除受 体细胞以外的其他生物的细胞，尤其是人的细 胞。 根据构建克隆载体所用的 DNA来源可分为 质粒载体、病毒或噬菌体载体、质粒 DNA与病 毒或噬菌体DNA组成的载体、以及质粒DNA与染 色体DNA片段组成的载体等。 一、质粒克隆载体一、质粒克隆载体 质粒(plasmid)是一种寓于宿主细胞中染 色体外的裸露 DNA分子， 一个质粒就是一个 DNA分子。 质粒含有复制起始位点， 能在相应的宿 主

25、细胞内进行自我复制， 但不会像某些病毒 那样进行无限制地复制， 导致宿主细胞的崩 溃。 每种质粒在相应的宿主细胞内保持相对 稳定的拷贝数，少者几个，多者上百个。 1 1、大肠杆菌质粒载体、大肠杆菌质粒载体 作用： （1）、用于基因克隆； （2）、作为构建新克隆载体的构架。 2 2、蓝藻穿梭质粒载体、蓝藻穿梭质粒载体 蓝藻质粒经过加工形成，可以在大肠 杆菌中复制，也可以在蓝藻中进行复制。 3 3、农杆菌、农杆菌TITI质粒载体质粒载体 致癌农杆菌含有一种内源质粒，当农杆 菌同植物接触时，这种质粒会引发植物产生 肿瘤(冠瘿瘤)，所以称此质粒为Ti质粒。Ti 质粒是一种双链环状DNA分子，其大小20

26、0kb 左右，但是能进入植物细胞的只是一小部分， 约25kb，称为TDNA(transfer DNA)。 T-DNA左右两边界各有一个25 bp长的正向 重复序列(lTS和RTS)， 对T-DNA的转移和整合 是不可缺少的， 并且已证实T-DNA只要保留两 端边界序列，虽然中问的序列不同程度被任何 一个外源DNA片段所替换,仍可转移整合到植物 基因组中。 4 4、酵母质粒载体、酵母质粒载体 几乎所有的酿酒酵母菌中都存在一种质粒， 即2 m质粒。因此，酿酒酵母作为表达外源基 因产物的重要宿主细胞，构建了一系列用于酵 母转基因的质粒载体。一般也构建成穿梭质粒 载体，含有2 m质粒的复制起始位点和大

27、肠杆 菌源质粒的复制起始位点。 5 5T-T-克隆载体和克隆载体和U-U-克隆载体克隆载体 一种线性质粒，其一端各带一个不配对的 碱基T。采用这样的质粒可将PcR产物以TA配对 连接的方式直接进行克隆，TA克隆的载体被称 为T一克隆载体，它的出现使PCR产物的克隆更 加简便快捷。 脱氧胸腺嘧啶核苷(T)容易与其他碱基发生 非特异性配对，而且T一克隆载体也容易同反 应系统中残留的引物或不完整的PCR扩增片段 连接。另一种一端带一个不配对碱基u的线性 质粒。 二、病毒二、病毒( (噬菌体噬菌体) )克隆载体克隆载体 病毒主要由DNA(或RNA)和外壳蛋白组 成，经包装后成为病毒颗粒。通过感染， 病

28、毒颗粒进入宿主细胞，利用宿主细胞的 合成系统进行DNA(或RNA)复制和壳蛋白的 合成，实现病毒颗粒的增殖。人们利用这 些性质构建了一系列分别适用于不同生物 的病毒克隆载体。把感染细菌的病毒专门 称为噬菌体，由此构建的载体则称为噬菌 体载体。 1 噬菌体克隆载体 (1) 噬菌体克隆载体 入噬菌体由DNA和 外壳蛋白组成，对大肠杆菌具有很高的感染能 力。DNA在噬菌体中以线状双链DNA分子存在， 全长48502bp。其左右两端有各12个核苷酸组成 的凸出黏性末端，而且两者的核苷酸序列互补， 进入宿主细胞后，黏性末端连接成为环状DNA分 子。把此末端称为COS位点。入噬菌体能包装原 DNA长度的7

29、5-105，约364-515kb。并 且DNA上约有20 kb的区域对入噬菌体的生长不 是绝对需要的，可以缺失或被外源DNA片段取代。 这就是用DNA构建克隆载体的依据。 2 植物病毒克隆载体 植物病毒种类繁多，已用于构建植物载体的 有双链DNA病毒花椰菜花叶病毒，单链NA病毒蕃 茄金黄花叶病毒、非洲木薯花叶病毒、玉米线 条病毒、小麦矮缩病毒，以及RNA病毒雀麦草花 叶病毒、大麦条纹花叶病毒、蕃茄丛矮病毒、 马铃薯x病毒、烟草花叶病毒、烟草蚀刻病毒、 李痘病毒等。 构建植物病毒克隆载体的基本策略是对病毒 DNA进行加工，消除其对植物的致病性，保 留其通过转导或转染能进人植物细胞的特性， 使携带

30、的目的基因导人植物细胞。由于植物 病毒克隆载体的应用局限性比较大，并且目 前已有比较好用的由Ti质粒改建的克隆载体 和不受植物种类限制的整合平台系统克隆载 体，所以植物病毒克隆载体用得并不普遍。 3、动物病毒克隆载体 由于动物转基因不能应用质粒克隆载体， 所以动物病毒克隆载体在动物转基因研究中 起着更重要的作用。目前用于构建克隆载体 的动物病毒有痘苗病毒、腺病毒、杆状病毒 等。 三、 染色体定位整合载体 采用上述质粒载体或病毒(噬菌体)载体 ，进人受体细胞的外源DNA分子，或者游离在 细胞质中，作为染色体外遗传物质自行复制； 或者随机插入染色体DNA，随染色体DNA的复制 而复制。前者虽然能多

31、拷贝复制，但是容易丢 失，导致转基因生物的不稳定性；后者虽然能 稳定维持，但是由于插入的位点的不确定性， 可能对受体细胞基因组的自稳系统产生干扰， 进而导致出现有害的突变，给选育转基因生 物带来不可知性和难度。 四、人工染色体克隆载体 人工染色体载体实际上是一种“穿梭”载体， 含有质粒载体所必备的第一受体(大肠杆菌)内 源质粒复制起始位点(删)，还含有第二受体(如 酵母菌)染色体DNA着丝点、端粒和复制起始位 点的序列，以及合适的选择标记基因。它与目 的DNA片段重组后，在第一受体细胞内按质粒复 制形式进行高拷贝复制，再转入第二受体细胞， 按染色体DNA复制的形式进行复制和传递。筛选 第一受体

32、的转化子，一般采用抗菌素抗性选择 标记；而筛选第二受体的转化子，常用与受体 互补的营养缺陷型。主要用于构建基因组文库， 也可用于基因治疗和基因功能鉴定。 五、几种特殊用途的克隆载体 1、启动子探针载体 启动子是调控基因有效转录的必备元件，是 构建基因表达载体的重要组成部分，在研究生 物发育机制、提高目的基因表达产量和进行基 因治疗等方面起着重要的作用。分离不同类型 基因启动子已成为基因工程的重要任务之一， 而启动子探针(pmmoter pmbe)载体则是一种有 效、经济、快速分离基因启动子的工具。启动 子探针载体除了质粒载体必备的元件外，还必 须含有检测部件。检测部件有两部分组成，即 一个已失

33、去启动子且易于检测的遗传标记基因 以及克隆位点。 2 、 诱导型表达载体 诱导型表达载体指启动子必须在特殊的诱导条件 下才有转录活性或比较高的转录活性的表达载体。 外源基因处于这样的启动子下，必须在合适的诱导 条件下才能表达。采用这种表达载体获得的转基因 生物便于人工控制，即使进入自然环境中，由于不 存在合适的诱导条件，因此不能表达外源基因产物， 也不会导致环境污染和影响生态系统的平衡。可以 认为这是一类较安全的基因表达载体，并且鉴于诱 导表达载体能人为地控制基因时空的表达，将为基 因治疗的临床应用及基础研究提供良好的手段。目 前用作诱导型的启动子有二价金属离子诱导启动子、 红光诱导启动子、热

34、诱导启动子和干旱诱导启动子 等。 3 、组织特异性表达载体 在较高等的真核生物中，有一类特殊的调控序 列(启动子等)可以调控基因只能在一定的组织中 才进行有效的表达。选用这样的调控序列可以构 建一系列组织特异性表达载体，为研究动植物发 育和人类基因治疗等提供了有效的手段。目前 已构建的组织特异性表达载体有乳腺组织特异性 表达载体、肿瘤细胞特异性表达载体、神经组织 特异性表达载体、花药特异性表达载体和种子特 异性表达载体等。 4 、 反义表达载体 反义核酸技术是目前人工干预基因表达 的一项重要技术，它利用人工合成或重组 的与靶基因互补的一段反义DNA或RNA片段， 特异性地与靶基因结合，达到封闭

35、其表达 的目的。此技术已成为基因治疗的重要手 段，其中构建反义表达载体就可以在靶细 胞内直接产生致病基因的反义RNA片段。 第三节目的基因 被用于基因重组、改变受体细胞性状和获 得预期表达产物的基因称为目的基因，它是结 构基因，能合成蛋白质。 一、目的基因的来源： 人、真核生物、原核生物等。 二、获得目的基因的途径 1、利用限制性内切核酸酶酶切法直接分 离目的基因 2、利用PCR法直接扩增目的基因 （不超过1Kb=1000pb，需要20pb引物) 3、目的基因的化学合成 4、通过构建基因组文库分离目的基因 把某种生物基因组的全部遗传信息通过 克隆载体贮存在一种受体菌克隆子群体之中 ，这个群体即

36、为这种生物的基因组文库。再 用核酸探针或mRNA探针进行杂交选择分离。 5、通过构建cDNA基因文库分离目的基因 某种生物基因组转录的全部mRNA经反转 录产生的各种cDNA片段分别与克隆载体重组 ，贮存在一种受体菌克隆子群体中，这样的 群体称cDNA基因文库。再用核酸探针或mRNA 探针进行杂交选择分离。 第四节 重组DNA导入细胞 一、受体细胞 选择受体细胞时应重点考虑以下几点： 安全性高，不会对外界环境造成生物污染； 便于重组DNA分子的导人； 便于筛选克隆子； 重组DNA分子在受体细胞内能稳定维持； 适于外源基因的高效表达、分泌或积累； 具有较好的翻译后加工机制，便于真核目的基 因的高

37、效表达； 对遗传密码的应用上无明显偏倚性； 遗传性稳定，易于扩大培养或发酵 在理论研究和生产实践上有较高的应用价值。 1、原核生物的细胞是较为理想的受体细胞 其原因是 大部分原核生物细胞没有纤维素组成的坚硬 细胞壁，便于外源DNA的进入； 没有核膜，染色体DNA没有固定结合的蛋白质 ，这为外源DNA与裸露的染色体DNA重组减少了 麻烦； 基因组小，遗传背景简单，并且不含线粒体和 叶绿体基因组，便于对引入的外源基因进行遗传 分析； 原核生物多数为单细胞生物，容易获得一 致性的实验材料，并且培养简单，繁殖迅速， 实验周期短，重复实验快。因此普遍作为受 体细胞用来构建基因组文库和cDNA文库，或 者

38、用来建立生产某种目的基因产物的工程菌， 或者作为克隆载体的宿主菌。常见的如大肠 杆菌、枯草杆菌等。 2、真核细胞 （1）、酵母属于单细胞真菌，是外源真 核基因理想的表达系统。酵母作为基因工程 受体细胞，除了真核生物细胞共有的特性外， 还具有以下优点： 基因结构相对比较简单，对其基因表达调 控机制研究得比较清楚，便于基因工程操作； 培养简单，适于大规模发酵生产，成本低 廉； 外源基因表达产物能分泌到培养基中，便 于产物的提取和加工； 不产生毒素，是安全的受体细胞。 （2）、植物细胞作为基因工程受体细胞， 除了真核生物细胞共有的特性外，最突出的 优点就是其体细胞的全能性，即一个分离的 活细胞在合适

39、的培养条件下，比较容易再分 化成植株，这意味着一个获得外源基因的体 细胞可以培养出能稳定遗传的植株或品系。 不足之处是植物细胞有纤维素参与组成的坚 硬细胞壁，不利于摄取重组DNA分子。但是采 用农杆菌介导法或用基因枪、电激仪处理等 方法，同样可使外源DNA进入植物细胞。现在 用作基因工程受体的植物有水稻、棉花、玉 米、马铃薯、烟草和拟南芥等。 （3）、动物细胞作为受体细胞，同样便 于表达具有生物活性的外源真核基因产物。 不过早期由于对动物的体细胞全能性的研 究不够深入，所以多采用生殖细胞、受精 卵细胞或胚细胞作为基因工程的受体细胞， 获得了一些转基因动物。近年来由于干细 胞的深入研究和多种克隆

40、动物的获得，表 明动物的体细胞同样可以用作转基因的受 体细胞。目前用作基因工程受体的动物有 猪，羊、牛、鱼、鼠、猴等。 二、重组DNA导入受体细胞的途径 1、外源DNA转化法：通过生物学、物理学和 化学等方法使外源裸露DNA进入受体细胞，并在 受体细胞中稳定维持和表达的过程称为转化。 （1）、直接转化法： （2）、化合物诱导转化法： （3）、接合转化法： （4）、电穿孔转化法： （5）、微弹轰击转化法： （6）、激光微束穿孔转化法： （7）、超声波处理转化法： （8）、脂质体介导转化法： （9）、体内注射转化法 （10）、花粉管通道转化法 （11）、精子介导法 （12）、磷酸钙转染法 2、病毒

41、（噬菌体）颗粒转导法 三、克隆子的筛选 通常将摄取外源DNA分子并能使该分子在 其中稳定维持的受体细胞称为克隆子,把采用各 种转化方法或转导方法获得的克隆子叫做转化 子.含有重组DNA分子的克隆子称为重组子. 1、根据载体选择标记基因筛选转化子 在载体DNA分子中组装了一种或两各选择标 记基因，在受体细胞内进行表达，呈现出特殊的 表型或遗传学特性，作为筛选轩化子的依据。 （1）、根据载体抗生素抗性基因和相应措施的 药物筛选转化子 植物及动物常用的抗性基因： (1)、新霉素磷酸转移酶基因抗新霉素、卡霉 那素、庆霉大素等。 (2)、潮霉素磷酸转移酶基因抗潮霉素 (3)、氯霉素酰基转移酶基因抗氯素 （2）、根据载体除草剂抗性基因和相应的选择 药物筛选转化子。 （3）、根据lacZ基因互补显色筛选转化子，主 要用于原核生物，含有外