人骨形成蛋白-7成熟肽cDNA的克隆和序列测定精

1、人骨形成蛋白-7成熟肽cDNA的克隆和序列测定关键词：骨形成蛋白-7 ;克隆；序列测定中号：Q786 文献标识码：B 文章编号：1007-8738(2000)03 0213 02 人骨形成蛋白？7(hBMP?7最早由Celeste等1克隆并命名。同年， Ozkaynat等2从人脑cDNA文库中也筛选出此克隆。以后研究表明，BMP?7除了诱导成骨外，还具有广泛的生物学活性3 6。由于hBMP?7S神经系统 及造血组织中的特殊作用，故其在基础研究和临床应用中具有广阔的前景。我 们采用自行设计合成的一对特异性引物，以骨肉瘤的入gt11噬菌体表达文库为模板，通过PCR扩增到hBMP?7成熟肽的cDNA

2、将其克隆入载体pGEM?3zf， 所获序列与已发表的序列完全一致，为进一步对其表达和功能研究创造了条 件。1PCF产物的琼脂糖凝胶电泳分析1:PCRmarker(从上至下为：1543，994，697，515，377和 237bp); 2： PCR 产物2重组质粒pGEB7的酶切鉴定1： PCRmarker从上至下为：1543，994, 697，515，377和 237bp); 2:重 组质粒 pGEB7的 EcoRI+ Hindill 双酶切.1材料和方法1.1材料大肠杆菌DH5x及质粒pGEM?3zf(-)均为本室保存。骨肉瘤细胞 U2-OS的入gt11噬菌体表达文库为本室构建。各种限制性内

3、切酶、连接酶和 Taq酶均为Gibco公司的产品。AdvantagePCR-purekit为Clontech公司产品。 常用试剂为进口分装或国产分析纯。PCFT增引物自行设计，由上海生物工程 中心合成。引物的序列如下：P1： 5 TTTAAATGTCCACGGGGAGCAAAC3P2: 5 GCGTCGACTTAGTGGCAGCCACAG31.2 方法1.2.1hBMP?7成熟肽基因的扩增PCF反应体系：P1和P2引物(20mmol/L)各 1卩 L, dNTP(10mmol/L)1 卩 L,模板 入 gt11 噬菌体 3 卩 L, 10X PCRbuffer5 卩 L 和 Taq酶 1U,加

4、水至总体积 50 卩 L。PCR反应条件：94C 30s, 50C 30s, 72C 30s 反应5个循环。然后，于94E 30s, 55E 30s, 72C 30s,反应30个循环。PCR 产物用 15g/L 琼脂糖凝胶电泳鉴定。1.2.2重组质粒的构建用Hinell酶切载体pGEM?3zf(-)并回收，同时回收 PCR产物，用T4连接酶连接，转化感受态细胞 DH5x，筛选阳性克隆。1.2.3序列测定利用PE公司ABI310型全自动核酸测序仪进行。2 结果2.1hBMP-7成熟肽基因的扩增以 入gt11噬菌体表达文库为模板，利用自行 设计的一对引物，进行PCF扩增hBMP-7成熟肽基因。经两

5、段反应共35个循环 后，用15g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定，获得约 440bp的特异条带，与预期的大小 相一致(1)。2.2重组质粒的构建回收440bp片段，在T4连接酶作用下，与用Hindi 酶切的质粒pGEM?3zf(-)于16E连接过夜。以连接产物转化感受态细胞 DH5x，加入IPTG和X-gal进行蓝白筛选。随机挑取白色克隆，提取质粒，用 限制性内切酶 EeoRI 和 HindIII 双酶切。经 15g/L 琼脂糖凝胶鉴定表明，切出 440bp片段者为阳性克隆，将此重组质粒命名为pGEB72.3序列测定利用PE公司ABI310型全自动核酸测序仪测定hBMP?成熟肽 基因的序列，所得结果与已

6、发表的序列完全一致 (3) 。TCCACGGGGAGCAAACAGCGCAGCCAGAACCGCTCCAAGACGCCCAAGAACCAGGAAGCC CTGCGGATGGCCAACGTGGCAGAGAACAGCAGCAGCGACCAGAGGCAGGCCTGTAAGAAG CACGAGCTGTATGTCAGCTTCCGAGACCTGGGCTGGCAGGACTGGATCATCGCGCCTGAA(1 GGCTACGCCGCCTACTACTGTGAGGGGGAGTGTGCCTTCCCTCTGAACTCCTACATGAAC(2 GCCACCAACCACGCCATCGTGCAGACGCTGGTCCACT

7、TCATCAACCCGCAAACGGTGCCC(3 AAGCCCTGCTGTGCGCCCACGCAGCTCAATGCCATCTCCGTCCTCTACTTCGATGACAGC(36TCCAACGTCATCCTGAAGAAATACAGAAACATGGTGGTCCGGGCCTGTGGCTGCCACTAG(42 3BMP?7成熟肽编码基因的部分核苷酸序列3 讨论hBMP-7具有广泛的生物学活性：胚胎发育中所产生的BMP-7和BMP-4是诱导交感神经元分化的信号分子。能抑制胚胎癌性细胞 (ECC)的增殖，诱导其 分化，可能对一些干细胞肿瘤有治疗价值。对牙齿的修复、形成有重要作 用。对鼠胚胎菱脑的发育和形

8、成有一定影响，为哺乳动物眼部发育所必需 5。剔除(knock?out)该基因的小鼠出生不久即死于肾脏发育不良，提示其可 能与小儿肾功能不良所致贫血和骨骼发育不良有关，从而使其在基础研究和临 床应用等方面具有比较重要的价值。但天然来源的BMP-7较少，限制了对其功能的研究。国外多用真核表达系统表达 BMP-7只有极少数人尝试用原核表达系统进行表达研究7，并获得活性产物。以往认为，BMP原核表达后，难以获 得高活性的产物，且表达产物往往处于非溶解状态，可溶性产物的量极少。近 来本室在原核表达的BMP-2的复性方面获得了突破8，可得到大量可溶性重组 BMF产品，为其体外活性测定方法的建立及功能研究提

9、供了极大的便利。为进 一步阐明BMP?7吉构与功能的关系，研究其在肾脏、神经系统发育及造血系统 中的作用，克隆BMP-7成熟肽基因很有必要。我们以骨肉瘤细胞U2-0S的入gt11噬菌体表达文库为模板，利用自行设计 的一对引物，仅一轮扩增即得到单 1 条带。测序吉果表明，设计的引物特异性 强，扩增得到的基因正确。将扩增产物以平端克隆入载体pGEM?3zf（-），可避免由于酶切处理过程的损失，无论是正向或反向克隆入载体都不影响测序，而 且不会破坏引物中所含的酶切位点和起始密码子。hBMP-7成熟肽基因克隆的成功，为其原核表达以及功能研究和应用奠定了基础。 作者简介： 王琦，男， 24岁，助教现工作

10、单位：兰州市段家滩 171 号，解放军 兰州医高专生化教研室， Tel.(0931)8972157 ? 2000 by J Cell Mol Immunol Press www.immunology. net/jcmi; Email. immuedit ISSN 1007? 8738 细 胞 与 分 子 免 疫 学 杂 志 (J Cell Mol Immunol)2000;16(3)王琦（第四军医大学生物化学与分子生物学教研室，陕西西安 710032） 柴玉波（第四军医大学生物化学与分子生物学教研室，陕西西安 710032） 李毅（第四军医大学生物化学与分子生物学教研室，陕西西安 710032

11、） 陈南春（第四军医大学生物化学与分子生物学教研室，陕西西安 710032） 薄勤（第四军医大学生物化学与分子生物学教研室，陕西西安 710032） 陈苏民（第四军医大学生物化学与分子生物学教研室，陕西西安 710032）参考文献： 1 Celeste AJ, Iannazzi JA, Taylor RC, et al. Identification of transforming growth factor family members present in bone inductive protein purified form bovine boneJ . Proc Natl Acad

12、Sci USA, 1990;87:9843 9847.2 0zkaynak E, Rueger DC, Drier EA, et al. 0P? 1 cDNA encodes an osteogenic protein in the TGF?B family J. EMBO J, 1990; 9: 2085 2093.3 Reissmann E, Ernsberger U, Francis? West PH, et al. Involvement of BMP4 and BMP7 in differentiation of the adrenergic phenotype in develop

13、ing sympathetic neurons J . Development, 1996; 122(7):2079 2088.4 Giannobile WV, Ryan S, Shih MS, et al. Recombinant human osteogenic protein? 1 (OP? 1) stimulates periodontal wound healing in class III furcation defectsJ . J Periodontol, 1998; 69(2):129137.5 Arkell R, Beddington RS. BMP? 7 influences pattern and growth of the developing hind? brain of mouse embryosJ . Development,1997; 124:1 12. 6 Luo G, Hofmann C, Bronckers AL, et al. BMP? 7 is an inducer of nephrogenesis, and is also required for eye development and skeletal patterning J .