高分辨率溶解曲线HRM完整版

1、 内容提示内容提示 高分辨熔解曲线（High Resolution Melting） 高分辨熔解曲线在遗传育种中的应用 筛查突变筛查突变 （mutation scanning） 基因分型基因分型（Mutation Genotyping） 小片段+内标法（ Small Amplicon Genotyping ） 非标记探针法（Unlabeled Probe Genotyping，LunaProbe） SSR分析分析 检测甲基化检测甲基化 HRM仪器 High Resolution DNA Melting（HRM)是基于有序列变化的是基于有序列变化的Amplicon之间微弱的之间微弱的 Tm值差异

2、，通过值差异，通过DNA片段熔解曲线的差异进行突变检测，比如：片段熔解曲线的差异进行突变检测，比如： PCR Tube 1 Tube 2 Tube 3 Wild type Homozygote Heterozygote LightScanner突变检测原理突变检测原理 Lightscanner高分辨溶解曲线结果高分辨溶解曲线结果 Saturating dyeSaturating dye LC Green plus LC Green plus 高分辨溶解曲线专用荧光染料高分辨溶解曲线专用荧光染料 内容提示内容提示 高分辨熔解曲线（High Resolution Melting）的定义 高分辨熔解

3、曲线在蚕的遗传育种中的应用 筛查突变筛查突变 （mutation scanning） 基因分型基因分型（Mutation Genotyping） 小片段+内标法（ Small Amplicon Genotyping ） 非标记探针法（Unlabeled Probe Genotyping，LunaProbe） SSR分析分析 检测甲基化检测甲基化 HRM仪器 未知未知SNPSNP扫描扫描 M.H.Ye等对北京油鸡CAPN1基因外显子进行扫描，筛查其潜在SNPs。 Bernhard J. HoWnger Hai-Chun Jing Kim E. Hammond-Kosack Kostya Kany

4、uka (Barley Application) Theor Appl Genet (2009) 119:851865 DOI 10.1007/s00122-009-1094-2 数据来自英国洛桑农业实验站 Bernhard等对Barley的eukaryotic translation initiation factor 4E (eIF4E) gene基因外显子进行突变扫描结果基因外显子进行突变扫描结果 内容提示内容提示 高分辨熔解曲线（High Resolution Melting）的定义 高分辨熔解曲线在蚕的遗传育种中的应用 筛查突变筛查突变 （mutation scanning） 基因分

5、型基因分型（Mutation Genotyping） 小片段+内标法（ Small Amplicon Genotyping ） 非标记探针法（Unlabeled Probe Genotyping，LunaProbe） SSR分析分析 检测甲基化检测甲基化 HRM仪器 Small Amplicon Genotyping 扩增小片段直接进行基因型鉴定扩增小片段直接进行基因型鉴定 使用已知Tm值的双链DNA做温 度内标，低温内标Tm(61) ,高 温内标Tm (92 ) 内标能够实现96/384孔板的温度 均一矫正。 PCR片段的Tm值范围： 70-88 优点：不需要探针，直接利用 PCR产物针对已

6、知突变位点进行 基因分型 为何要使用温度内标为何要使用温度内标 M.H.Ye等对北京油鸡A-FABP基因进行小片段法基因分型，扩增片段为 56bp，灰色曲线显示的是杂合型（CT），蓝颜色和红颜色曲线分别代表纯 合型CC和TT。 内容提示内容提示 高分辨熔解曲线（High Resolution Melting）的定义 高分辨熔解曲线在蚕的遗传育种中的应用 筛查突变筛查突变 （mutation scanning） 基因分型基因分型（Mutation Genotyping） 小片段+内标法（ Small Amplicon Genotyping ） 非标记探针法（Unlabeled Probe Gen

7、otyping，LunaProbe） SSR分析分析 检测甲基化检测甲基化 HRM仪器 Class 1 C:T, G:A Class 2 C:A, G:T Class 3 C:G Class 4 A:T David De ，Yong Song at el.Application og high-resolution DNA melting for genotyping and variant scanning of diploid and autotetraploid potato Mol Breeding (2010) 25:6790 rr RR Rr Mix Rr:rr by 1:1 Rr

8、rr Mix RR:Rr by 1:1 RRRr 内容提示内容提示 高分辨熔解曲线（High Resolution Melting）的定义 高分辨熔解曲线在蚕的遗传育种中的应用 筛查突变筛查突变 （mutation scanning） 基因分型基因分型（Mutation Genotyping） 小片段+内标法（ Small Amplicon Genotyping ） 非标记探针法（Unlabeled Probe Genotyping，LunaProbe） SSR分析 检测甲基化检测甲基化 HRM仪器 Rosario Muleo（2009）等用HRM方法对三个品种的SSR DCA4进行分析，DC

9、A4的等位基因有131bp的重复序列，杂 合等位基因的序列为131-133bp，分析结果如图8所示，HRM曲线可以将纯合样品和杂合样品明显的区分，其中一个 等位基因只相差2bp。 三种颜色（浅灰，深灰、黑色）表明3种不同的品种。 Rosario Muleo等得出结论： HRM是一种快速、重复性 高、成本低，操作简单，且 可以应用于其他物种的SNP 检测及SSR基因分型的方法。 Rosario Muleo,Marir Chiara Colao,Dario Miano at el. 2009 Genome52:252-260 内容提示内容提示 高分辨熔解曲线（High Resolution Mel

10、ting）的定义 高分辨熔解曲线在蚕的遗传育种中的应用 筛查突变筛查突变 （mutation scanning） 基因分型基因分型（Mutation Genotyping） 小片段+内标法（ Small Amplicon Genotyping ） 非标记探针法（Unlabeled Probe Genotyping，LunaProbe） SSR分析分析 检测甲基化 HRM仪器 内容提示内容提示 高分辨熔解曲线（High Resolution Melting）的定义 高分辨熔解曲线在蚕的遗传育种中的应用 筛查突变筛查突变 （mutation scanning） 基因分型基因分型（Mutation

11、Genotyping） 小片段+内标法（ Small Amplicon Genotyping ） 非标记探针法（Unlabeled Probe Genotyping，LunaProbe） SSR分析分析 检测甲基化检测甲基化 HRM仪器 2005 LightScanner 96/384 96/384 孔板孔板 8 分钟分钟/板板 2-6 秒秒/样品样品 温度均一性：温度均一性： 0.15oC 数据采集速度：大于数据采集速度：大于100pts/秒秒 升温速度：升温速度： 0.1oC/秒秒 2010 LS32 32 样品转盘样品转盘, 玻璃毛细管玻璃毛细管 HRM 检测检测 60 分钟内完成定量分

12、钟内完成定量 PCR 和和 HRM 检测检测 HRM检测升温速度可以在检测升温速度可以在 0.05 0.90oC/秒之间调秒之间调 节节 在升温速度小于在升温速度小于0.3/秒时，温度均一性：秒时，温度均一性：0.05oC 数据采集速度：数据采集速度：20pts/秒秒400pts/秒（与升温速度有秒（与升温速度有 关）关） 0.3oC/秒秒 升温速度升温速度= 67 pts/ 0.05oC/秒秒 升温速度升温速度 = 400 pts/ LunaProbesLunaProbes 非标记探针基因分型非标记探针基因分型 未知未知SNPSNP扫描扫描 Small AmpliconSmall Amplicon小片段小片段 基因分型基因分型 HRM分析流程分析流程 在PCR反应前加入 LCGreen 荧光染料 时间大约时间大约2 2小时（包含试剂准备）小时（包含试剂准备） 在LightScanner上进行高分辨溶解曲线分析 大约需要大约需要5-10 5-10 分钟分钟 数据分析和处理 大约需要大约需要5-10 5-10 分钟分钟 PCR产物可以直接进行下游的测序分析等（如 需要） 大约需要大约需要30-6030-60分钟分钟 LightScanner适于适于SNP分析分析 速度、通量LightScanner 510分钟完成96/384孔板的PCR产物检