流式细胞术原理及应用

1、流式细胞术原理及应用 Principle and Application of Flow Cytometry Fu Fenfen 流式细胞术原理及应用 流式细胞术 流式细胞仪的出现和流式细胞术的发展是多学科领域共同发展流式细胞仪的出现和流式细胞术的发展是多学科领域共同发展 的结晶，其中涉及细胞细胞生物学、分子生物学、分子免疫学、单克隆的结晶，其中涉及细胞细胞生物学、分子生物学、分子免疫学、单克隆 抗体技术、激光技术、荧光化学、光电子物理、流体力学、计算机技术抗体技术、激光技术、荧光化学、光电子物理、流体力学、计算机技术 等。等。 流式细胞术用于主要用于生命科学的基础研究，尤其是免疫学、流式细胞

2、术用于主要用于生命科学的基础研究，尤其是免疫学、 细胞生物学、肿瘤学。从细胞生物学、肿瘤学。从8080年代后期开始应用于临床，流式细胞术能辅年代后期开始应用于临床，流式细胞术能辅 助多种疾病的诊断，尤其是白血病的诊断和分型。此外，利用流式分选助多种疾病的诊断，尤其是白血病的诊断和分型。此外，利用流式分选 干细胞过继回输可用于疾病的治疗。干细胞过继回输可用于疾病的治疗。 流式细胞术原理及应用 基本原理 特定波长的激光束直接照射到高压驱动的液流，产生的特定波长的激光束直接照射到高压驱动的液流，产生的 光信号（散射光信号和荧光信号）被多个接收器接受，根据光信号（散射光信号和荧光信号）被多个接收器接受

3、，根据 信号的强弱波动就能反映出每个细胞的物理化学特征。信号的强弱波动就能反映出每个细胞的物理化学特征。 流式细胞仪流式细胞仪 细胞样品细胞样品 荧光染料或者荧光素偶联抗体荧光染料或者荧光素偶联抗体 流式细胞术原理及应用 流式细胞仪 1.1. 液流系统液流系统 2.2. 光路系统光路系统 3.3. 检测检测分析系统分析系统 4.4. 分选系统分选系统 1. 液流系统 样品管 鞘液桶 废液桶 喷嘴 Injector Tip 光源散射光信号 荧光信号 流式细胞术原理及应用 流式细胞术原理及应用 2. 光路系统 光源光源 激光器：常用的有激光器：常用的有 488nm blue, 635nm red,

4、 488nm blue, 635nm red, 355nm 355nm UV, UV, 514nm 514nm greengreen 激光器激光器常用通道分配常用通道分配 488nm blue488nm blueFSC, SCC, FITC, PE, PE-FSC, SCC, FITC, PE, PE-TexRedTexRed, PE-Cy5, PE-Cy7, PE-Cy5, PE-Cy7 635nm red635nm redAPC, APC-Cy7APC, APC-Cy7 355nm UV355nm UVHoechst, DAPIHoechst, DAPI 流式细胞术原理及应用 散射光信号

5、前向角散射光前向角散射光（FS, Forward ScatterFS, Forward Scatter） 在光束正前方检测，前向散射光的强度与细胞或颗粒在光束正前方检测，前向散射光的强度与细胞或颗粒 的大小有关的大小有关 侧向角散射光侧向角散射光（SS, Side ScatterSS, Side Scatter） 与光束垂直方向检测，侧向散射光的强度与细胞内颗与光束垂直方向检测，侧向散射光的强度与细胞内颗 粒结构复杂程度有关粒结构复杂程度有关 前向散射光（前向散射光（FSCFSC） Detector 流式细胞术原理及应用 Laser Laser 侧向散射光（侧向散射光（SSCSSC） 流式细胞

6、术原理及应用 外周全血细胞散射光双参数点图外周全血细胞散射光双参数点图 （红细胞溶解后）（红细胞溶解后） 流式细胞术原理及应用 流式细胞术原理及应用 荧光信号 每每种荧光染料均有特定的激发波长种荧光染料均有特定的激发波长, , 并激发后会有发射并激发后会有发射 波长波长, ,流式细胞仪检测的即是它特定的发射波长流式细胞仪检测的即是它特定的发射波长. . 利用利用各种不同波长的光学滤片来收集各种不同波长的光学滤片来收集( (检测检测) )这些光学这些光学信号信号. . 荧光染料荧光染料 激发波长激发波长 ( (nm) nm) 发射波长发射波长( (nm) nm) 用途用途 颜色颜色 FITC F

7、ITC 488 488 525 525 免疫荧光免疫荧光 绿色绿色 PE(RD1) PE(RD1) 488 488 575 575 免疫荧光免疫荧光 橙色橙色 ECD ECD 488 620 488 620 免疫荧光免疫荧光 橙红橙红 PeCy5 PeCy5 488 675 488 675 免疫荧光免疫荧光 红红 PI PI 488 620 DNA488 620 DNA染色染色 橙红橙红 PECy7PECy7 488 488 755 755 免疫荧光免疫荧光 深红深红 PerCPPerCP 488488 670670 APC APC 633633 670670 常用荧光染料的特性常用荧光染料的

8、特性 流式细胞术原理及应用 异硫氰酸荧光素 (FITC) 400 nm600 nm700 nm Wavelength 500 nm 激发激发 发射发射 Relative Intensity 流式细胞术原理及应用 藻红蛋白 (PE) 400 nm600 nm700 nm Excitation Emission 500 nm Wavelength Relative Intensity 流式细胞术原理及应用 5 Color Single Laser (488nm) FITC/PE/ECD/PC5/PC7 流式细胞术原理及应用 滤光片滤光片 1.1. 长通滤片长通滤片(long pass filter

9、)(long pass filter)：波长大于特定波长的光可以通过，小：波长大于特定波长的光可以通过，小 于该波长的光被反射于该波长的光被反射； 2.2. 短通滤片短通滤片( (lshortlshort pass filter) pass filter)：波长小于特定波长的光可以通过，：波长小于特定波长的光可以通过， 大于该波长的光被反射；大于该波长的光被反射； 3.3. 带通滤片带通滤片(band pass filter)(band pass filter)：波长在特定范围的光可以通过，该范：波长在特定范围的光可以通过，该范 围以外的光被反射；围以外的光被反射； 当当以以 4545o o

10、角放置滤片时 角放置滤片时, ,该滤片可以通过一定波长的光该滤片可以通过一定波长的光, ,同时也可以阻同时也可以阻 断并折射该波长以外的光断并折射该波长以外的光 二向色性滤片二向色性滤片( ( dichroicdichroic filter) filter) 光路系统就是利用滤光片的不同组合达到分离光信号的目的。光路系统就是利用滤光片的不同组合达到分离光信号的目的。 流式细胞术原理及应用 Dichroic Filter/Mirror at 45 deg Reflected light Transmitted LightLight Source 630 nm Band Pass Filter T

11、ransmitted Light White Light Source 620 -640 nm Light 带通滤片带通滤片(band pass filter)(band pass filter) 光路系统就是利用滤光片的不同组合达到分离光信号的目的。光路系统就是利用滤光片的不同组合达到分离光信号的目的。 流式细胞术原理及应用 SSC PE-TxRed PE-Cy7 FITC PE PE-Cy5 630/30nm带通 650短通 718短通 605短通 488/10nm带通 670/30nm带通 530/40nm带通 580/30nm带通 505短通 555长通 740长通 SSC和荧光 74

12、0nm 483-493nm 655-685nm 510-550nm 565-595nm 615-645nm 488488激光侧面接收光光信号分离示意图激光侧面接收光光信号分离示意图 流式细胞术原理及应用 3. 检测分析系统 光电倍增管光电倍增管(Photomultiplier tube, PMT)(Photomultiplier tube, PMT) 流式细胞术原理及应用 通道 (channel) 流式细胞术原理及应用 4. 分选系统 + + + + + + + + + + - - - - - - - - - + + + + + + + + + - - - - - - - - - - - -

13、- - - - - - + - - - - - - - - - - - + + + + + + + + + 分选系统分选原理示意图分选系统分选原理示意图 流式细胞术原理及应用 流式图 流式直方图 Log FITC 1000 100 10 1 11 0 .1 Count 3 0 70 0 15 0 ImmunophenotypingImmunophenotyping Cell cycle analysis 流式细胞术原理及应用 流式散点图 流式细胞术原理及应用 CST #5616 (Alexa Fluor 488 Conjugate) : Jurkat (blue) and HeLa (green) 流式细胞术原理及应用 流式细胞术原理及应用 流式细胞术的应用 科研应用： 细胞表面分子细胞表面分子 细胞内或细胞核内抗原细胞内或细胞核内抗原 细胞核酸细胞核酸 细胞凋亡细胞凋亡 细胞增殖细胞增殖 细胞融合细胞融合 细胞毒细胞毒 胞内活性氧水平胞内活性氧水平 细胞膜电位细胞膜电位 细胞内钙离子浓度细胞内钙离子浓度 干细胞（干细胞（SPSP） 荧光蛋白表达荧光蛋白表达 临床应用： HIVHIV免疫分