显微镜荧光波长详解

1、人肉眼对光源波长的颜色感觉红色 770-622 nm橙色 622597 nm黄色 597577 nm绿色 577492 nm蓝靛色492455nm紫色455350nm荧光类型生产厂家激发光（nm）发射光（nm）颜色GFP蛋白395-495509绿色EGFP蛋白487509绿色DAPI358-360460-461蓝色Alexa Fluor 488In vitroge n495519绿色Alexa Fluor 594In vitroge n590617红色FITC490-495520-530黄绿色罗丹明(Rhodam ine)565590红色TRITC （Tetramethyl Rhodam in

2、Isothiocyanate,四甲 基异硫氰酸罗丹明， 是罗丹明的一种衍 生物之一）550620橙红色Rhodam ine Red-X(RRX)570590橙红色Texas Red(TR)589-595615橙红色常见显微镜滤光片的波长在激发波长在Ex范围内才能被激发，只有发射光波长大于BA/EM才能被观察到，背景光的波长只有大于DM才能被观察到。红色滤光片G-2AEx 510-560DM 575BA 590绿色滤光片B-2AEx 450-490DM 505BA 520蓝色滤光片UV-2AEx 330-380DM 400BA 420其它荧光染料介绍【菁类染料 -Cyanine dyes( Cy

3、2 , Cy3 , Cy5 )】Cy2 耦联基团激发波长为 492nm ，发光为波长 510nm 的绿色可见光。 Cy2 和 FITC 使用相 同的滤波片。由于 Cy2 比 FITC 在光下更稳定。要避免使用含有磷酸化的苯二胺的封片剂， 因为这种抗淬灭剂和 Cy2 反应，在染色片储存后会导致荧光微弱和扩散。 Cy3 和 Cy5 比其 他的荧光团探针要更亮，更稳定，背景更弱。 Cy3 耦联基团激发光的最大波长为 550nm ， 最强发射光为 570nm 。因为激发光和发射光波长很接近 TRITC, 在荧光显微镜中，可使用 和 TRITC 一样的滤波片。Cy3 在氩光灯 (514nm 或 528n

4、m) 下可以被激发出 50 的光强，在氦氖灯 (543nm) 或者汞灯 (546nm) 下则约 75 。 Cy3 可以和荧光素一起作双标。 Cy3 还可以和 Cy5 一起在共聚焦显 微镜实验中作多标记。 Cy5 耦联基团的激发波长最大 650nm ，发光波长最大 670nm 。在氪 氩灯(647nm)下它们可被激发出 98 %的荧光，在氦氖灯下(633nm)为63 %。Cy5可以和很 多其他的荧光基团一起用在多标记的实验中。由于它的最大发射波长在670nm ， Cy5 很难用裸眼观察，而且不能用汞灯作理想的激发。通常观察 Cy5 时采用具有合适激发光和远红 外检测器的共聚焦显微镜。 在水相封片

5、剂中应当加入抗淬灭剂。 使用传统的表面荧光显微镜 时，不推荐使用 Cy5 。【藻红蛋白或藻胆色素蛋白 -Phycoerythrin(PE) 荧光标记二抗】 存在于被称为藻红的多聚微粒中， 位于叶绿素的反应中心， 在自然结构中， 藻红蛋白吸收光 能，吸收后转化成能量， 供其发育生长。 当藻红蛋白被分离和纯化后， 其蛋白质变得具有很 强的荧光， 能吸收不同波长的光，发出亮红色的荧光，此时不再接受任何外来的光，也不能 转移光能。藻红蛋白 PE 的吸收波长范围较广，最大的吸收波长为 566nm ，最大的发射波 长为 574nm 。藻红蛋白作为荧光标记物具有以下优点：首先具有强的长波长激发和发射荧 光，

6、可避免来自其他生物材料荧光的干扰；并且具有极高的发射量子产率；另外PE 具有非常高的水溶性而且与许多生物学或合成材料的多位点稳定交联。【 Aminomethylcoumarin Acetate (AMCA)】耦联的 AMCA 吸收光波长最大为 350nm ，发荧光则为 450nm 。对于荧光显微镜来说， AMCA 可以用汞灯来激发，用紫外滤板来观察。由于 AMCA 的信号相对较弱，单标实验中不推荐 使用 AMCA 。 AMCA 和荧光素的荧光波长只有很小的重叠范围，而和发出长波长荧光的荧 光基团没有或者只有极少的重叠， 因此它最常用于多标记实验中， 比如免疫荧光显微镜和流 式细胞仪。由于人眼不

7、能很好的检测蓝色荧光，在多标记的实验中，AMCA 耦联的二抗应当被用于检测大量的抗原。 AMCA 和荧光素一样很快淬灭，使用抗淬灭剂可以减轻。且由 于肉眼不能很好的检测 AMCA 所激发的蓝色荧光， 因而 AMCA 耦联的二抗更适用于检测大量存在的抗原。如果使用在流式细胞仪中，AMCA可以用汞灯或者水冷却的氩光灯激发，因为它们发出的光线是在光谱的紫外区。注：由于观察荧光需要一定波长的激发光，必须根据实验室已有的仪器可发光的波段进行选择。另外，多标记中对探针色彩区分程度的要求。例如，若丹明红-X (RRX)和德克萨斯红(TR)荧光素的区别就比四甲基若丹明(TRITC)或者Cy3的区别明显。如果对

8、灵敏度有更高的要求，贝U Cy3和Cy5就比其他的荧光团探针要亮。西美杰备有全面的二抗现货产品并能提供最完整的二抗产品线。主要二抗品牌为全球最大的二抗和底物生产厂商 KPL以及前沿抗体生产商Prote in Tech。针对荧光标记二抗，有FITC、TRITC、Rhodamine、PE、Cy3/5、AMCA、Dylight等多种荧光标记二抗；按照检测物种分，有抗人、大鼠、小鼠、猪、驴、绵羊、山羊、小鸡、马、兔、仓鼠、狗、牛，以及多种细菌类二抗；另外，还有 IgG、IgA、IgM以及IgG(Fc)、lgG(ab )2等不同类型抗体。The role of filters in epi-fluore

9、scenee microscopy在激发波长在Ex范围内才能被激发，只有发射光波长大于BA/EM才能被观察到，背景光的波长只有大于DM才能被观察到。ToDichroic miirorLight from mencury tampWoiSE temnprwtw 曲filterTo obervatnn sysTerm(Ey.eu.)Fluarcsccnce filter block (for inverted microscope)Excitatian filterFigure 1As shown in Figure 1, filter blocks are constructed from 2

10、types of filters and 1 dichroic mirror. Selecting appropriate filters and mirrors for each use allows researchers to atta in a high sig nal to no ise (S/N) ratio betwee n the fluoresce nee and backgro und light. The fun cti ons of these optical eleme nts are described below.荧光滤色块组示意图。每个滤色块组有一个半透半反镜，

11、 一个激发光滤光片，两 个发射光滤光片。如前面介绍的，由光源发出的光透过激发光滤光片进入滤色块 组，被半透半反镜反射；发射出的荧光透过发射光滤光片进入目镜或相机。在这一组合中，半透半反镜以及左侧的发射光滤光片是固定在架子上的，而右侧的发射光滤光片则安装在一个可以拆卸的滤片框内。只要松动螺丝，就可以拆下右侧的滤片框，然后根据需要，更换半透半反镜。更换时需要注意，不要把固定用的 胶水，涂到半透半反镜上，操作要带手套，避免将指纹留在镜面上。上述体视镜可搭配3各荧光滤色块，以及一个用于明场观察的无滤片块。观察时，可通过拉动杠杆调节滤色块的位置， 每一个滤色块配有不同的标识，便于 选择。Figure 3

12、Barrier Fitter*-Excitation FitterFilter (Left Cbannel)r恤r k FrameNikon SMZ1500 StereomicgcopE Fluorescence Filter CombinationDichromatic MirrorExcitation Light to SpecimenFitter FrameScrewExcitation filter (EX)激发光Excitation filter example: EX4S0-490 FiBure100SO040200400 450 500 5S0 600 S50 700Vavf-l

13、ength (nnr)The excitation filter is the optical element that passes only the wavelen gth of light n ecessary for excitati on from the excitati on light source (usually a mercury lamp) to the fluorophore. As shown in Figure 2, only the excitation wavelength passes through the filter, usually a band p

14、ass filter.Dichroic mirror (DM)400 450 50C 55C 00 50 700 wavcjlength (rml(眾)2u冲匚 el-in cide neeThe dichroic mirror is the optical element that separates the excitation light from the fluoresce nee. Dichroic mirrors are special mirrors that reflect only a specific wavelength of light, allowing all ot

15、her wavelen gths to pass through (Figure 3). Dichroic mirrors used in epi-fluoresce nee microscope filter blocks are placed in a 45 an gle to light, creat ing a stop ban dof reflected light and a pass bandof transmitted light. Light passing through the excitation filter is reflected 90 toward the ob

16、jective and the specime n. Fin ally, light ema nati ng from the specime n is passed through and directed toward the observer (or high-se nsitivity camera).Barrier filters (BA) or emission (EM) filters1厂!g a11一 Bio1h Iran srrirttedqeked i-1 11j i!ihj.jBarrier filter example： BA520 Figure4 ICCao6C4620

17、0400 450 500 5S0 SCO 50 700Wavlejnoth rm)Barrier filters are optical eleme nts that separate fluoresce nee ema nat ing from the fluorophore from other backgro und light. As show n in Figure 4, the barrier filter tran smits light of the fluoresce nee wavelen gth which passes through the dichroic mirr

18、or while block ing all other light leaking from the excitation lamp (reflected from the specime n or optical eleme nts). This is n ecessary because the stre ngth of the fluoresce nt light is weaker tha n the excitati on light by a factor of more than 100,000:1. Most barrier filters are positioned at a slight an gle to allow b