槟榔种子超低温保存技术规程

1、ICS11.120.01C 23团 体 标 准T/CACM 00X2019槟榔种子超低温保存技术规程Technical procedures for cryopreservation of Areca catechu Linn. seeds2019-0X-0X发布2019-0X-0X实施中华中医药学会 发布T/CACM 0012019目 次目 次I前 言II1 范围12 规范性引用文件13 术语和定义14 种子的选择15 种子前处理26 种子保存量27 种子冷冻方式28 恢复培养2附录3参考文献4前 言本标准按照GB/T 1.12009标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写给出的规则起草。

2、本标准由中国医学科学院药用植物研究所海南分所提出。本标准由中华中医药学会归口。本标准起草单位：中国医学科学院药用植物研究所海南分所，中国医学科学院药用植物研究所。本标准主要起草人：曾琳，魏建和，顾雅坤，符丽，谭红琼，郑希龙，李榕涛，王秋玲，何明军，金钺。IIT/CACM 0012019槟榔种子超低温保存技术规程1 范围本标准规定了槟榔Areca catechu L.种子超低温保存过程中的术语和定义、种子的选择、种子前处理、种子保存量、种子冷冻方式、恢复培养等技术要求。本标准适用于槟榔种子的超低温长期贮藏。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版

3、本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 3543.6 农作物种子检验规程 水分测定GB/T 3543.7 农作物种子检验规程 其他项目检验3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1槟榔 Areca catechu L.为棕榈科（Palmae）槟榔属（Areca Linn.）常绿乔木，别称大腹子，位于中国“四大南药”之首。其果实具有杀虫、消积等功效，主要用于治疗人体肠道寄生虫、食积腹痛、水肿脚气等。收载于中国药典（2015）。3.2槟榔果实 Areca catechu L. fruits槟榔果实长圆形或卵球形，长 35cm，橙黄色，中果

4、皮厚，纤维质。3.3槟榔种子 Areca catechu L. seeds槟榔的播种材料为完整种子，贮藏特性判断为顽拗性种子。种子卵形，长1.53.5 cm，基部截平，淡黄棕色，底部中心具圆形凹陷的珠孔，种胚就在此处萌发，其旁有1条明显的瘢痕状种脐。质坚硬，不易破碎，断面可见棕色种皮与白色胚乳相间的大理石样花纹。3.4种子超低温保存 seed of cryopreservation 指将经过前处理的槟榔种子置于液氮（-196）中保存。4 种子的选择4.1 果实采收11月至次年5月，当果皮颜色由绿转为黄时，即可采收，去除果皮，取出种子。4.2 种子选择挑选发育饱满、均匀、健康的种子，置于4冰箱中

5、保存备用（存放时间不超过1 个月）。5 种子前处理5.1 生活力检测参照GB/T 3543.7中的2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)法检测种子生活力。随机选取15粒种子，取出种胚后放入培养皿内，滴入TTC溶液浸没种胚，室温(25)避光放置4h 后观察染色结果。5.2 生活力计算直接用肉眼对染色结果进行观察鉴定。凡胚及胚乳全部染成有光泽的鲜红色，且组织状态正常的，为有活力的种子；否则为无生活力的种子。计算：生活力（%）=有活力的种子数/受试种子数100%待保存的槟榔种子生活力应80%。5.3 含水量范围用尼龙网袋包裹槟榔种子，置于盛有变色硅胶的干燥器内，硅胶与种子的体积比为200:1，室温条

6、件下干燥处理36 h，在干燥过程中定期测定种子含水量，将种子含水量由45%55%降至34%36%。参照GB/T 3543.6中的高恒温烘干法（130烘干1h）测定种子含水量（W0），W0=（鲜重-绝干重）/鲜重100%。6 种子保存量槟榔种子保存量不少于200粒，以便后期的活力检测使用。7 种子冷冻方式槟榔种子超低温保存的冷冻方式为直接冷冻法，即将待保存的槟榔种子放入15 mL冻存管（每管23粒种子）中，迅速投入液氮中保存。8 恢复培养8.1 种子解冻处理液氮中至少冻存24 h后，取出10个冻存管，立即放入40水浴中快速解冻2 min。8.2 冻后种子生活力检测取出5管解冻后的种子，参照5.1

7、5.2生活力检测方法，进行超低温保存后的初始生活力检测。当种子生活力75%时视为保存成功。8.3 恢复培养将剩下5管解冻后的槟榔种子，播种到带有无菌滤纸的带盖发芽盒中，温度25 30 ，湿度70% 85%条件下培养。附录TTC的配制和保存方法称取TTC 1.00 g，溶于100 mL磷酸盐缓冲液中，制成浓度为1%的TTC溶液，调pH至6.57.5，置棕色瓶内4 冰箱备用。磷酸缓冲液配置方法：溶液I：9.08 g磷酸二氢钾溶于1 L无菌水中；溶液II：35.81 g磷酸二氢钠溶于1 L无菌水中；按I：II=2：3的比例混合制成磷酸盐缓冲液） 参考文献1 国家药典委员会.中华人民共和国药典M.北京，中国医药科技出版社，2015,365-3662 中国科学院中国植物志委员会. 中国植物志.第13(1)卷M.科学出版社, 2004(1991)：1333 Pei Shengji. Chen Sanyang.Guo Lixiu. Andrew Henderson. Palmae M /Flora Of China Beijing: Science Press/St. Louis: Missouri Botanical Garden Press. 2010. 23: 154-155.4 傅家瑞，宋松泉. 顽拗性种子生物学M. 中国