水中大肠杆菌的检测方法

1、word完美格式附件水肠杆菌群检测方法一多管发酵法NIEA E201.54B一、方法概要本方法系用以检测水中革兰氏染色阴性，不产生生砲子之杆状好氧或兼性厌氧菌，且能在351匸、48 土 3小时发酵乳檢并产生酸及气体之大肠杆菌群（Coliform group）；在不同体积或不同稀释度之水 样所产生之结果，以r 100 mL水中最大可能数（MPN/100 mL）表示100 mL水中存在之大肠杆菌群数目。二、适用围本方法适用地面水体、地下水体、废水、污水及水源水质水样肠杆菌群之检验。三、干扰（一）水样中含有抑制或促进大肠杆菌群细菌生长之物质。（二）检测使用的玻璃器皿及设备含有抑制或促进大肠杆菌群细菌

2、生长的物质。四、设备（一）虽筒：100至1000 mL之虽筒。（二）吸管：有0.1刻度之10 mL灭菌玻璃吸管或市售无菌塑料吸管，或无菌微童:吸管（micropipet）。（三）试管：大小约150 X 15 mm之试管或有盖螺族试管。（四）发酵管（fermentation tube）:大小约22 X 9 nun之玻璃管。（五）稀稗瓶：容量约100 mL可灭菌之硼硅玻璃制品。（六）锥形瓶：200至2000 mL之可灭菌硼硅玻璃制品。（七）采样容器：容虽120 mL以上无菌之硼硅玻璃瓶或无菌塑料有盖容器，或市售无菌袋。（八）冰箱：温度能保持在4 土 29者。（九）天平：待测物重虽大于2（?时，须能

3、精秤至0.01 g；待测物重虽不大于2 g时，须能精秤至0. 001 go（十）培养箱：温度能保持在35 土 者。（十一）高压灭菌釜：温度能维持在121C （压力约15 lb/in2或1.1 Kg/cm2）灭菌15分钟以上者。精心整理学习帮手word完美格式(十二)高温干热烘箱：如用于玻璃器皿等用具之灭菌，温度须能保持在16(rc达2小时或170T达1小时以上 者。(十三)接种环：为白金或線辂合金制，适用于细菌接种或移植，亦可使用无菌塑料制品。(十四)pH计：精确度达0.1 pH单位。五、试剂(一)试剂水：蒸翎水或去离子水，导电度在25时小于2 y mho / cm ( n S / cm) (

4、二)培养基，应使用市售商品化培养基。1、硫酸月桂酸脇化蛋白月东培养基(Lauryl sulfate tryptose broth,简称LST)1倍浓度LST培养基含有下列成份：胰牝蛋白脓(Tryptose)乳糖(Lactose)氯化钠(NaCl)5.0g磷酸氢二钾(KzHPO.)2. 75g磷酸二氢钾(KH2PO.)2. 75g硫酸月桂酸钠(Sodium lauryl sulfate)试剂水20. 0g5. 0g0. lgIL配成2倍浓度(取71.2 g LST培养基粉末溶于1 L试剂水)，完全溶解后，分取10 niL注入装 有倒置发酵管之试管，经121X3灭菌15分钟，冷却后备用，灭菌后培养

5、基之pH值应在6.8 0.2。 灭菌后培养基若未当日使用，应保存在4 土 2C,保存期限为14天。可根据检验需求呈，依配方配 制培养基。2、煌绿乳糖胆汁培养基(Brilliant green lactose bile broth,简称 BGLB)1公升的BGLB培养基中含有下列成份:蛋白脓(Peptone)精心整理学习帮手10. 0gword完美格式10. 0g乳糖(Lactose)牛胆粉（Oxgall Powder）20. Og煌绿色试剂（Bri 11 iant Green）0. 0133g试剂水IL取40 g BGLB培养基粉末溶于1 L试剂水，完全溶解后，分取5至10 mL注入装有倒置发

6、酵管之 试管，经1219灭菌15分钟，冷却后备用，其pH值应在7.2 土 0.2。灭菌后培养基若未当日使用， 应保存在4 土 2,保存期限为14天。可根据检验需求量，依配方配制培养基。（三）无菌稀释液1、磷酸二氢钾储备溶液取3.4 g磷酸二氢钾（K1LP0,）溶于50 ml的试剂水中，俟完全溶解后，以1. 0 N NaOH溶液调节 其pH值为7.2 0. 1,然后加试剂水至100 mL,灭菌（过滤灭菌或121工高温高压灭菌15分钟）后 储存于冰箱中备用。4 土 2 C下保存期限为3个月。2 ,氯化镁储备溶液取8.1 g氯化镁（MgCL- 6H20）,先溶于少量试剂水,俟完全溶解后，再加试剂水至

7、全量为100 mL, 灭菌（过滤灭菌或1219高温高压灭菌15分钟）后，储存于冰箱中备用。4 土 2 C下保存期限为3 个月。3、无菌稀释液分别取10 mL氯化铁储备溶液和2. 5 mL确酸二氢钾储备溶液再加入试剂水至2,000 mL,混摇均 匀后，分装于稀释瓶中，经12TC灭菌15分钟，作为无菌稀释液备用。如欲用于水样稀释，分装之无 菌稀释液灭菌后体积须为90 2.0 mL。4 2 C下保存期限为3个月。六、采样与保存（一）盛装水样检验微生物之容器，应使用清洁并经灭菌之玻璃瓶或无菌塑料容器或市售无菌釆样袋，且 于采样时应避免受到污染。水样若含有余氯时，无菌容器中应加入适虽之无菌硫代硫酸钠（采

8、取加氯之 废水时，每100 mL水样中加入0. 1 mL. 10%硫代硫酸钠可还原15 mg/L余氯。采取含氮之饮用水水样时, 每100 mL之水样如加入0. 1 mL之3%硫代硫酸钠，可中和之余氯虽约为5 mg / L。）。（二）采样前应清洁手部，再行采水样，所采水样应具有代表性。精心整理学习帮手word完美格式（三）运送时水样温度应维持在小于10 C且不得冻结，而实验室保存温度应维持在4 土 2 9。（四）水样应于采样后24小时完成推定实验之水样添加步骤（七、步骤（一）4、），并置入培养箱中培养。（五）水样虽须以能做完所需检验为度，但不得少于120 mL。七、步骤试验分两阶段进行。首先进行

9、推定试验，若推定试验结果为阳性反应，则继续进行第二阶段之确定试 验，如结果仍是阳性反应则显示有大肠杆菌群存在。各试验步骤如下述：（一）推定试验1、慎选发酵管中没有气泡且未污染之10 mL、2倍浓度LST试管。2、水样在进行检测或稀禅之前必须剧烈摇晃25次以上，以使样品充分混摇均匀。3、视水样中微生物可能浓度围进行水样稀释步骤，使用无菌吸管吸取10mL水样至90mL无苗稀释液中， 形成10倍端释度水样，混合均匀，而后自10倍稀释度水样以相同操作方式进行一系列适当之100、 1000、10000倍等稀释水样，进行稀释步骤时，均需更换无菌稀释吸管，水样稀释步骤如图一所示（注 1）04、以无菌吸管分别

10、取各稀释度10 mL水样至含10 mL 2倍浓度的LST试管中，每一稀释度各作5支，小 心混合均匀，混合后发酵管不可产生气泡。5、在35 土 1培养箱中培养48 3小时，观察并记录发酵情形，若有气体产生则推定试验为阳性反 应，若无气体产生则推定试验为阴性反应，但若培养液呈混浊状态，虽无产气，亦应进行确定试验。（二）确定试验若推定试验之发酵管中有气体或混浊产生时，则使用BGLB进行确定试验：1、慎选发酵管中没有气泡且未污染之BGLB试管。2、利用无菌接种环自产生气体以及混浊之LST培养基试管中，接种一圈培养液至BGLB培养基试管中。3、在35 土 1C培养箱中培养48 3小时。4 ,在48 3小

11、时，BGLB培养基试管如有气体产生，则确定试验为阳性反应。八、结果处理（一）经确定试验确认BGLB试管为阳性反应后，应以r 100 mL水中最大可能数（MPN/100 mL）计算及记录。 5支发酵管连续三种稀释度之MPN可查表一。精心整理学习帮手word完美格式（二）表一所示接种之水样量为10 mL、1.0 mL及0. 1 ml,若所用之稀释度有三种以上时，釆用最具意义之 三种稀释度，查表后再计算100 mL水肠杆菌群最大可能数。稀释度之选取方式如下：1、先选取5管均呈阳性反应的最高稀释度（此时稀釋度较低之各组试管必须全部呈阳性反应），再选取 下两个稀释度（如表二水样别a） o2、如果稀释度最

12、低的一组并非5管均呈阳性反应，则选取稀释度最低的一组，再选取下两个稀释度（如 表二水样别b、c）。3、如果依摇上述原则（1、及2、）选取3个稀释度后，下一稀释度试管组仍有阳性反应试管，则舍弃 原先3组中稀释度最低的一组，纳入下一稀釋度的数摇（如表二水样别d） o4、如果依据上述原则（1、至3、）选取3个稀释度后，更高稀释度之试管组仍有阳性反应试管，则把 更高稀释度之阳性反应试管数加至原先3组中稀释度最高的一组（如表二水样别e） o（三）100 mL水肠杆菌群最大可能数（UPN/100 ml）之计算公式如下:大腸桿菌群最大可能數（MPN/100 mL）=查表所得之MPN値山最具意義三種稀釋度之最

13、犬水樣體積结果小于100时，以整数表示（小数字数四舍五入），菌落数大于100以上时，只取两位有效数字： 例如 110 以 1.1 X 10?表示，16.000 以 1.6 X 10表示。（四）检测纪录须注明采样时间、培养起始及终了时间、培养基名称、培养盘度及各稀釋度的数据等相关数摇。九、质量管理（一）微生物采样人员及检测人员应具备微生物基本训练及知识。（二）每批次采样时应进行运送空白。（三）每批次或每10个水样需进行试剂空白实验。（四）新购入之培养基，每批号均须以大肠杆菌群阳性控制菌株（如E coli. Enterobacter aerogenes, Citrobacter freundii进

14、行测试，以确保数据质虽。（五）若一季期间水样均未检出大肠杆菌群，则须以大肠杆菌群菌株进行培养基测试，以确保数据质虽。（六）本方法培养所得之细菌可能具有感染性，检测后之培养基及器皿应经高温高压灭菌处理。十、精密度及准确度精心整理学习帮手word完美格式十一、参考数据（一） APIU. 2005. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. 21st Edition,Section 9221 American Public Health Association, Washington, D. C（二） Difco &

15、BBL Manual： Manual of Microbiological Culture Media. 2003. BD Diagnostic Systems.注水样如须稀释,建议于稀释后30分钟完成检测步骤，以免造成细菌死亡或增生，影响实验结果。10mL10mLlOmL10mL1000 倍稀釋力漏100Q倍辭水棣10000 倍删水様分別取10mL 10 倍稀釋水樣至5 支2倍濃度LT 培養基之試管分牙瞰lOinL 100倍 稀釋水樣至于支2倍 谧度LST培看基之試 管分另瞰10mL 1000 倍稀曙水樣至5支 2倍濃度LT培養 基之試管分別磁lOmL 10000 倍髒水樣至5支2 倍濃度LST培養基 之碗图一水样稀释步骤表一三连续稀释度（10 mL、1 mU 0.1 mL）五试管重复测试时，阳性结果组合之MPN指数及95%信賴区间精心整理学习帮手word完美格式阳性反应组合MPN/100 mL95%信赖区间阳性反