jnk信号通路在转化生长因子-β诱导系膜细胞外纤维连接蛋白合成中的作用

1、 信号通路在转化生长因子一诱导系膜细胞外纤维连接蛋白合成中的作用 硕士研究生：杜娟指导教师：王秋月中国医科大学沈阳棚中国二零零六年五月阶 舶舾 怕： 钔，： 刚倍时 鸵， 一，”，中国医科大学研究生学位论文独创性声明本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。论文作者签名：越日期：竺

2、筮基！中国医科大学研究生学位论文版权使用授权书本人完全了解中国医科大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属中国医科大学。本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为中国医科大学，且导师为通讯作者，通讯作者单位亦署名为中国医科大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布学位论文的全部或部分内容（保密内容除外），以采用影印、缩印或其他手段保存论文。论文作者签名： 缝指导教师签名：雄一， 一中一一文一亘一摘一一要一一一信号通路在转化生长因子一诱导系膜细胞外纤维连接蛋白合成中的作用刖吾随着人们生活水

3、平的提高和人口老龄化进程不断加速，糖尿病发病率逐年上升。糖尿病肾病（）是糖尿病的主要致死并发症之一，基本病理改变为早期肾脏细胞增殖肥大，细胞外基质（）增多，晚期则为肾小球硬化。为提高患者生存质量，延缓肾功能损害，研究的发病机制已成为迫切需要。，与的发生发展密切相关，其特征性作用是刺激系膜外基质沉积。近年来，通过家族分子调控细胞周期的信号转导通路已得到细致论证，但对其调节合成的信号转导通路仍未明确。近年来通路倍受瞩目，主要有：，三条通路。多项研究证实，通路可介导。诱导的基质扩张效应，其中是较有争议的一条通路。本研究旨在检测，对系膜细胞活性及纤维连接蛋白（）分泌的影响，探究信号通路在。诱导的系膜细

4、胞分泌中的作用，从而进一步探讨的发病机制及防治措施。国内未见相关报道。材料与方法用含胎牛血清的培养基培养大鼠肾系膜细胞株，亚传代代细胞用于实验。转种对数生长期系膜细胞（ 瓶）于的培养瓶中，待细胞生长至触合时更换培养液（含的培养液）继续培养。分组：组：。（）刺激，及，。组：加入不同浓度（，）刺激 。组：用不同浓度特异性抑制剂（，斗）预处理，后加入一，（）刺激。于实验终点，用预冷的洗次，刮下细胞，离心。弃去上清，在沉淀中加入细胞裂解液（含一，斗 ，斗 ），冰上孵育，一储存备用。电泳前用法测定提取液的蛋白浓度，保证每孔上样量的一致性。取蛋白样品在电泳，电转至膜过夜，与抗磷酸化抗体孵育，再与标记的羊抗

5、兔二抗孵育，显色。用法检测。实验结果。诱导系膜细胞活化，正常对照组系膜细胞内有低水平活化， 内活性明显上调，达到高峰，后几乎恢复到正常水平，后再次升高，时仍高于正常。随着。浓度的递增，活性逐渐增强。随着特异性抑制剂浓度递增，由。刺激系膜细胞所引起的活化逐渐被抑制，当浓度达到斗时活化被明显抑制。刺激系膜细胞后分泌明显增加，且呈剂量依赖效应。一，刺激系膜细胞后分泌明显增加，且呈时间依赖效应。能抑制，诱导的系膜细胞分泌，且随其浓度的增加，这种抑制作用增强，当浓度达斗时抑制作用最强，但浓度仍明显高于正常对照组（）。单纯组与正常对照组相比浓度无显著性差异（）。讨论哺乳动物中有，：，。三种异构体，糖尿病时

6、，肾脏中，增加最显著。等研究发现。可激活系膜细胞内及通路，但没有激活通路。等研究则发现一￥。可通过通路及杂二聚体诱导应答元件（）的激活导致肿瘤细胞的合成。对人系膜细胞的研究发现，刺激了及通路的激活，却无的激活。总之，在糖尿病肾病中，信号通路的作用尚无定论。本研究首次发现，。可迅速诱导系膜细胞内活化，在。刺激 后活性明显上调，达到高峰，后几乎恢复到正常水平，而后活性再次上调，至时其活性仍高于正常水平。我们认为，出现这样的实验结果可能是：，使活化，而活化后的很可能再通过其他机制引起系膜细胞自身生成的。增加，从而使系膜细胞本身的持续活化。研究还发现，随着，浓度的增加，的活性逐渐增加。本研究证实了。刺

7、激系膜细胞分泌呈时间依赖效应和剂量依赖效应。能抑制上述效应，并随其浓度增加，抑制作用增强，但不能使恢复至正常对照组水平，说明。引起的增加的作用中，不是唯一的通路。这一结论与之前有关通路的研究相吻合：的研究发现，也可通过细胞外信号调节蛋白激酶（）及导致应答元件结合蛋白（）丝氨酸磷酸化，从而结合基因的位点使表达增加。结论。可使肾小球系膜细胞蛋白分泌增加，且呈剂量依赖效应和时间依赖效应。通路参与了。引起的系膜细胞过度分泌，阻断通路可使分泌明显减少。以上结果证实了通路在。诱导的系膜细胞过度分泌中有一定的调控作用。关键词；糖尿病肾病；系膜细胞；转化生长因子一，；纤维连接蛋白，一一一一一、；、苎兰篓鎏塑曼

8、一， 一 。 王 咖 ， 言 “ 一 ， ， ，：， 上 ， 台 ， 珊 （ ） “， （ ） ：，（） ， ： （，） ： （恤，卜，斗）， 一（） ， ， 山 ， 仙（一， ，斗 ，斗 ）， ，一 ， ， 唔，毛 “ ， 珊 ， ， ，曲【 ， “ 斗， ， 舢 ， 色 、 一 ， “ 肛， ， 肫 珊（） 培 加 （）：， 一 矗珊 趣 ， 咖 ， ； ； ； 珊 ， ， ， ， ， 如 “ （）【 （）， ，珊 ， ， 】 ；舀 ；，一一、；、一要篓堕堕曼，；、。一一一论一 一一文一 ；、信号通路在转化生长因子一诱导系膜细胞外纤维连接蛋白合成中的作用刖罱随着人们生活水平的提高和人口老龄

9、化进程不断加速，糖尿病发病率逐年上升。糖尿病肾病（）是糖尿病的微血管并发症之一，基本病理改变为早期肾脏细胞增殖肥大，细胞外基质（）增多，晚期则为肾小球硬化和肾小管间质纤维化，最终导致。肾功能衰竭。为提高患者生存质量，延缓肾功能损害，研究的发病机制已成迫切需要。，与的发生发展密切相关”其特征性作用是刺激系膜区基质沉积。近年来，通过家族分子调控细胞周期的信号转导通路已得到细致论证，但对其调节系膜区基质的信号转导通路仍未明确。高糖是的主要致病因素，它可经蛋白质非酶糖化、多元醇通路、二酰基甘油一通路及氧化应激等环节导致激活，进而磷酸化转录因子，调节基因表达，参与的发生，故有学者将视为高糖致糖尿病并发症

10、的信号转导子旧。多项研究证实。，通路可介导，诱导的基质扩张效应。其中是较有争议的一条通路。本研究旨在检测，对系膜细胞活性及分泌的影响，探究信号通路在。诱导的系膜细胞分泌中的作用，从而进一步探讨的发病机制及防治措施。国内未见相关报道。实验材料与方法一、实验材料细胞大鼠肾小球系膜细胞株试剂购自武汉大学生命研究院一 一一日 抗上海康成低分子量蛋白培养基上海康成美国， ，丙酮酸钠，磁力搅拌； ，磁力搅拌。调值一滤器过滤除菌。仪器设备超净工作台（国产）培养箱（）低温高速离心机（，）水平摇床（）一可见一紫外分光光度仪（）一深冻冰箱（）恒温振荡水浴（ ，肌）垂直电泳仪（）层析冷柜（国产）转印仪（）二、实验方

11、法肾小球系膜细胞的培养用含胎牛血清的培养基培养系膜细胞，放入含：孵箱中。胰酶加消化传代，隔天换液，传代一次，亚传代代细胞用于实验。胞核蛋白的提取转种对数生长期系膜细胞（ 瓶）于的培养瓶中，待细胞生长至触合时更换培养液（含的培养液）继续培养。于实验终点，用预冷的洗次，刮下细胞，离心弃去上清，在沉淀中加入细胞裂解液汕（含一，一， ， ，斗 ），冰上孵育，一储存备用。电泳前用也法测定提取液的蛋白浓度，保证每孔上样量的一致性电泳和取蛋白样品在电泳，电转至膜过夜，与抗磷酸化抗体孵育，再与标记的羊抗兔二抗孵育，显色。法测，步骤如下：（）将试剂盒室温下平衡小时，按照说明书的要求配制稀释液，洗涤液及标准品。（

12、）加样：每孔加入不同浓度的标准品和收集的上清液斗，空白对照孔加入稀释液肛，孵育分钟。（）洗涤：弃去反应孔液体，用洗涤液注满各孔，静置秒，甩干，反复次后拍干。（）每孔加酶标抗体斗，孵育分钟。（）按步骤，反复洗涤次。（）显色：每孔加底物液，孵育分钟。（）每孔加终止液仙，酶标仪上以空白孔调零，读取吸光度值。（）数据处理：用删软件，以标准品浓度的对数作为，。：为做出标准曲线，在标准曲线上查出相应的待测样本浓度即可。三、统计学分析实验结果以元表示。用软件，实验组和对照组间的比较采用单因素方差分析。认为差异有显著性。实验结果一、，诱导系膜细胞活化正常对照组系膜细胞内有低水平活化，内活性明显上调，达到高峰，

13、后几乎恢复到正常水平，后再次升高，时仍高于正常（），见图。随着。浓度的递增，活性逐渐增强（），见图。随着浓度递增，由，刺激系膜细胞所引起的活化逐渐被抑制，当浓度达到时活化被明显抑制，但仍明显高于正常对照组（），见图。二、，和对系膜细胞分泌的影响，刺激系膜细胞后分泌明显增强，且呈剂量和时间依赖效 应。与对照组相比，刺激系膜细胞后分泌增加即有显著性差异（），见表。，时浓度最高（），见表。能抑制，诱导的系膜细胞分泌，且随其浓度的增加，这种抑制作用增强，当浓度达斗时抑制作用最强，但这时浓度仍明显高于正常对照组（）。单纯组与正常对照组相比无显著性意义（），见表。：田山司、屠图。（）不同作用时间对系膜细胞

14、活性影响（。）如如日如如 向目凸皇、量】图不同浓度的对系膜细胞活性影响（ ）田田函田盆、岜图对系膜细胞活性影响（）（）；，（卜。）（）（“）（）；（）（）；（肛）表不同浓度对系膜细胞分泌蛋白的影响（）】（）（对照）蛋白（）士土术土土半卓与对照组相比较，表，（）不同作用时间对系膜细胞分泌蛋白影响（）与对照组比，】组 开始差异具有显著性（）；与 组比较，】表对系膜细胞分泌蛋白的影响（）不同处理因素血清培养液（对照组） 十”蛋白（） 与 组相比，； “组与对照组相比。讨论哺乳动物中有，：，三种异构体，糖尿病时，肾脏中。增加最显著。的受体（邛）分为，型。其中，型受体（）和型受体（耶一）属于丝氨酸苏氨酸

15、蛋白激激酶受体（）家族，型受体促进与其型受体结合。邛一先以高亲和力与，结合，再与邛结合形成异二聚体，邓一将近膜的丝氨酸和甘氨酸残基磷酸化，从而激活信号转导。激活的导致肾纤维化的转导信号有：一、通过激活启动基因表达；二、活化的受体激活活化蛋白激酶（），再激活，启动，三条主要的信号通路。研究发现。，高血糖、肾小球毛细血管血压升高、非酶糖基化产物、血管紧张素等因素均可通过使活性升高进而导致。水平升高。而且研究证实。”，。增加许多细胞外基质蛋白的合成，包括型胶原，型胶原，和弹性硬蛋白，并且减少降解细胞外基质蛋白的蛋白酶的生成。因此，是进展中的核心因子。是四大通路之一，目前研究的结论不一。 研究表明，。

16、可激活系膜细胞内及通路，但没有激活，而的激活是依赖性的。 在肿瘤细胞的研究表明，可激活导致合成。对人系膜细胞的研究发现，。可激活导致胶原蛋白合成”。等副的研究提示，基因在早期和发病过程中持续增高，但基因的激活需要的参与，而且基因又选择性激活，提示通路在的持续发展过程中发挥作用。本研究在国内首次发现，。可迅速诱导系膜细胞内活化，在。刺激后活性明显上调，达到高峰，后几乎恢复到正常水平，而后活性再次上调，至时其活性仍高于正常水平。我们认为，出现这样的实验结果可能是：。使活化，而活化后的很可能再通过其他机制引起系膜细胞自身的。生成增加，而使系膜细胞本身的持续活化。研究还发现，随着。浓度的增加，的活性逐

17、渐增加。本研究证实了，刺激系膜细胞分泌成时间依赖效应和剂量依赖效应。能抑制上述效应，并随其浓度增加，抑制作用增强，但不能使其恢复至对照组水平，说明，引起的增加的作用中，不是唯一的通路。这一结论与之前有关通路的研究相吻合：叫的研究发现，也可通过细胞外信号调节蛋白激酶（）及导致应答元件结合蛋白（）丝氨酸磷酸化，从而结合基因的位点使表达。本研究以体外实验的方法从酶的活性和产物两个水平，从正反两个方向证实了通路在，诱导的系膜细胞过度分泌中有一定的调控作用。有效阻断和调节该信号通路将可能成为治疗糖尿病肾病新的切人点。结论，可使肾小球系膜细胞蛋白分泌增加，且呈剂量依赖效应和时间依赖效应。通路参与了。引起的系膜细胞过度分泌，阻断通路可使分泌明显减少。以上结果证实了通路在，诱导的系膜细胞过度分泌中有