菌种保存、传代、使用、销毁标准操作规程

1、菌种管理制度1、目的建立菌种保存、传代、使用、销毁标准操作规程，规范微生物学检定用菌种的管理，最大限度降低2、3、变异率，确保菌种的溯源性与稳定性，从而确保微生物学检验结果的准确可靠。适用范围本规程适用于检定用菌种的管理，包括菌种的购买、保存、传代、使用及销 毁等。定义标准菌株是指由中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保藏管理中心提供的冷冻干燥菌。传代用菌种是指用标准菌株制备的采用特定保存方法长期固定保存的菌种，用于传代及制备工作用菌 种。工作用菌种是指用标准菌株或传代用菌种接种至普通琼脂斜面培养后，作为日常工作使用的菌种。的冷冻干燥菌种为第0代。4、职责部门主管负责菌种的申购、接收、保存分发

2、。4.2微生物检验员负责种的确认、传代、使用及销毁。5、规程程,经审批后，向中检所菌种保藏中心或省（市）药检所购买冻干菌种（标准菌株）或传代用菌种，购买时,需确定菌种的代数，以便控制传代代数。5.2以及每一支的完整性,编号（无编号者按检定同时将菌种的所有信息，填写在标准菌株库存记录上，内容包括：名称、数量、须完成转种。5.3种的保存5.3.1工作用菌种的保存工作用菌种采用斜面低温保存法。将菌种接种在适宜的琼脂斜面培养基上，待菌生长充 分以后，转移至48C冰箱中保存。此法仅用于工作用菌种的短期保存，并应随时检查其 污染杂菌和变异等 情况，发现异常情况，经应灭活处理后销毁。保存时间根据菌种种类而

3、不同，细菌：每个月转种一次；酵母532传代用菌种的保存采用甘油冷冻管保藏法或液体石蜡保存法。5.3.2.1甘油冷冻管保存法并通过接种用无菌接种环轻轻刮取经冷冻复溶增菌后并接种至平板或琼脂斜面的菌苔,环与试管壁之间的轻轻摩擦而使细菌充分扩散到预先装入试管中的无菌纯化水中，调整菌液浓度，使其等同 于10号比浊管，向已制备好的菌悬液中加入等体积的无菌甘油（浓度20%）,即为10%甘油菌悬液，轻轻振 摇，使内容物充分混合，分装于无菌小试管，在30C冷冻条件下保存。此甘油冷冻管为第2代(G2)o可以每隔2年转种一代。使用时，取出一支放至室温，转种增菌培养或接种至琼脂斜面复苏，挑取纯菌落传代或工作用。此种

4、方法主要适用于需氧细菌和酵母菌的保藏(如大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门)o5.322液体石蜡保存法5.3.2.2.1无菌液体石蜡的制备：选用优质化学纯液体石蜡，将液体石蜡分装加塞，用牛皮纸包好，在121C灭菌30分钟，置40C恒温箱中蒸发水分，经无菌检查后备用。在适宜条件下培5.3.2.2.2液体石蜡管的制备：将菌种穿刺接种于半固体高层培养基中,养结束后，在层流台下用无菌吸管吸取上述无菌液体石蜡至培养好的菌种管内，并使石蜡高出菌种表面约1cm使菌体与空气隔绝，并将试管直立，置于20C冷冻或28C冰箱中保存。此法主要适用于霉菌、厌氧5.3.3各菌种的保存方法、条件及期限，见下表表1传

5、代用菌种保存方法、保存温度、保存期限保存方法保存温度保存期限大肠埃希菌CMCC(B)44102金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003铜绿假单胞菌(CMCC B) 10104)甘油冷冻管-30C枯草芽抱杆菌CMCC侣)63501乙型副伤寒沙门菌CMCC侣)50094白色念珠菌CMCC(F)98001黑曲霉菌CMCC(F)98003液体石蜡管2-8C5.4种的处理和保藏5.4.1标准株的复苏、确认、传代5.4.1.1 标准株的复苏75%酒精及75%酒精棉球。5.4.1.1.1物品及试剂：接种针、酒精灯、移液管、5.4.1.1.2培养基改良马丁琼脂培养基：用于黑曲霉复苏、复壮;液体硫乙醇酸盐培养基：

6、用于生抱梭菌复苏、复壮；营养肉汤培养基：用于金黄色葡萄球菌、枯草芽 鞄杆菌、大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、短小芽鞄杆菌、铜绿假单胞菌复苏、复壮；改良马丁培养 基：用于白色念珠菌复苏、复壮5.4.1.1.3标准菌株的复苏操作步骤：以下操作均在生物安全柜内进行。a) 在安甑的外表面用75%的酒精擦拭并让其自然风干。b) 用一小砂轮在安甑的上部划一条线，用手轻轻将安甑掰开(开启安甑时必须小心，因为 安甑遇热时可能会破裂)。c)以无菌方法用一无菌吸管从已准备好的上述液体培养基中移取0.5-0.8 ml到安咅瓦中。d)轻轻地旋转安甑以使冻干菌种和液体培养基充分混合并完全溶解。e)f)根据安甑上所标明的不

7、同菌种类型而将其培养于相应的温度（细菌培养温度3035C，用无菌吸管将安甑内菌液全部转接到相应的液体培养基。g)h)空气隔绝，并将试管直立，封存于冻存管，置于-20 C冷冻或28C冰箱中保存。制备10支，按顺序进行编号，最后一支做为质控管进行质量控制，即进行相应的确认。其余作为储备管。将上述制备好的冻存管逐支粘贴标签。内容包括：菌种名称、菌种代号、编号、代次、制备日期、制备人、贮存条件、有效期至等。i)储备菌种管制备成功，储存于-30C,有效期为两年。5.4.1.2标准菌株的确认a)用无菌接种环取上述培养物接种到胰酪大豆月东琼脂（TSA）培养基（细菌）或沙氏葡萄糖琼脂培养基（真菌和酵母菌）平板

8、上，或相应的宜于该菌生长的鉴别培养基平板上。b)然后在3035C下培养3天（细菌）；2025C下培养5天（真菌和酵母菌）。c)培养后，首先观察其是否具有典型的菌落形态，然后挑取生长旺盛的单一的纯菌落，划线于平皿培养基，每种菌划4个平皿，以便收集较多的生长旺盛的典型单菌落，进行保存和鉴定。d)鉴定时作革兰氏染色、镜检，观察其染色特性及形态特征。必要时再做生化实验以进步鉴定该菌种。培养1824小时；真菌培养温度2328弋，培养35天。观察是否浑浊，浑浊说明菌种复苏生长;若不浑浊，细菌应延长培养时间至7天，真菌应延长培养时间至14天，若仍未浑浊，灭菌处理。若黑曲霉为菌悬液,则先放置室温待菌悬液融化后

9、用无菌吸管吸取管内液体12滴滴在改良马丁琼脂斜面上，用吸管涂布均匀，置2328C培养57天，斜面正面为黑褐色厚绒状，色泽均一,不应有杂色,斜面侧面无色，接近菌层培养基略带黄色。确认后用含有0.05% （ ml/ml）的吐温80的0.9%无菌氯化钠溶液洗脱到无菌试管中。取经复苏后的上述细菌菌液8-10ml至液体培养基中按f）项操作对菌种进行复壮。以无菌技术向复壮后的菌种中加入100ml20%的无菌甘油混匀，12ml/管，分装于冻存管。每个菌种制备10支，按顺序 进行编号，最后一支做为质控管进行质量控制，即进行相应的确认，其余作为储备管在30C冷冻条件下保存。黑曲霉按g）项下方法进行复壮，制成复壮

10、后的 抱子悬液20mlo以无菌技术向复壮后的菌种菌悬液中12ml/管加石蜡高出菌种表面约1cm使菌体与e)f)若在该平板上发现有其它菌落生长，则说明操作有污染或菌种不纯，应将此被污染了的培养物灭活处理，并寻找原因。应根据其原因采取措施重新分离挑选纯菌落。g)541.3种的传代各菌种的复活、划线用培养基、培养条件，见菌种复活、划线用培养基、培养条件（附件2）。54131标准菌株的传代a）按菌种说明书要求复溶菌粉，转种于适宜的增菌培养基内，称第1代（G1）,复壮后转接至平板上，并在适当温度下培养适当时间，分离单个纯种菌落，此为第2代（G2）。b)作为保存菌种（G2）,也称传代用菌种，同时挑取纯菌落

11、转接斜面菌种数支，作为工作用菌种，此为第3代（W3）。c)d)将第2代（G2）菌种管冷冻保存，将工作用菌（W3）于适当温度下培养适当时间后用于日常检验。 取一支冷冻保存的第2代（G2）菌种转种于平板和斜面培养基上。平板上的菌种制成 冷冻保存管第3代（G3）；斜面培养基的菌种经适当温度下培养适当时间后用作工作用菌种，此仍为第3代（W3）。e)将第3代菌种（G3）冷冻或低温保存，将生长、转种后的第2代（G2）菌种经高温灭活处理后丢弃。f)按上述规程操作，直至G4转为W5为止，需重新开启冷冻干燥菌种，重复上述规程操作，保存和使用g)当工作用菌种代数小于5时，在规定保存期限内，可直接用上一代工作用菌种

12、转接下一代工作用菌种。5.4.1.3.2传代用菌的传代将购回无异常的传代用菌种（一般为第3代），根据日常检验工作的需要量，挑取纯 菌落转接斜面菌 种数支，作为工作用菌种（为第4代），同时，结合菌种的代数和最长保存期限，挑取纯菌落制成浓菌悬液u5.3.2 的方法制备甘油冷冻管或液体石蜡管数支，作为传代用菌种（仍为第3代）。5.4.1.3.2.1传代用菌的传代操作步骤从冰箱冷藏室（2-80 中取出菌种斜面后，应温室放置约30mino将装有新鲜配制的培养基和传代菌种一并移入生物安全柜内,打开紫外灯照射1小时。关闭紫外灯。酒精灯，左手握住菌种斜面，将管口靠近火焰上方，右手拿接种环,将接种环烧红约30s

13、,5.4.1.3.21作用菌种的传代当工作用菌种代数小于5时，可直接用上一代工作用菌种转接下一代工作用菌种。取在冰箱48C保存的工作用菌种用普通琼脂斜面传代，并将新传代的培养物替代原有的菌种，作为工作用种。细菌每1个月传代一次；酵母菌每2个月传代一次；霉菌及芽胞每3个月传代一次。当超过5代，须用传代用菌种传代。5.4.4注意事项：传代时注意无菌操作，使菌株不死亡，不污染、不丢失。同时实验人员也要采取有效的预防措施进行自我保护，如工作时必须穿工作服，佩带无菌手套，实验完成以后消毒实验进行的区域、实验仪器和器具。如发生意外，如菌种泄漏或人员受伤，微生物学检验人员应立即向部门主管报告以便及时进行处理

14、。5.4.5传代后，按检定菌种的编号原则编号，并在每一支菌种管上贴上标签，标签内容包括：名称、编号、代数、传代日期、操作人、有效期。交部门主管统一保管。同时及时填写菌种传代记录（附表2) o5.5检定菌种的编号采用字母加数字表示：英文缩写字母一代次一传代日期一顺序号（C.a）、黑曲霉菌（A.n）、乙型副伤寒沙门菌（S.p）代数用一位带有下标数字的字母表示：传代用菌种 用G表示；工作用菌种用W表示；如G3表示传代用菌种第3代；W3表示工作用菌种第3代。2015 年 1 月 12传代日期用6位数字表示：年份取最后两位数，月、日分别用两位数。女口： 日传代的第一支大肠埃希菌作为传代用菌种的编号为E.

15、C-G3-120112-01 o 5.6检定菌种的保管 5.6.1检定菌种设专人加双锁保管，并对所保存的菌种建立检定菌种保存、领用登记台账（附表3) o 5.6.2检定菌种的定期检查与鉴定 在菌种的保存期间，工作日应每天检查保存菌种冰箱的温度、必要时检查菌种管的塞子是否松动，是否染杂菌等，并及时填写检定菌种观察记录（附表4）,如有异常应及时 处理。菌种在保存期内均应根据菌种的特性（工作用菌种每转种两代一次、传代用菌种每 三个月一次）检查其菌落性状、革兰染色、显微镜下菌体形态，必要时检查生化特性等项目，若发现与原菌 种变异较大，应重新分离、纯化、鉴定、再加以保存，并做好检定菌种鉴定记录（附表5）

16、 o 5.6.3所保管的菌种，不能随意转让其他单位和个人，需要时应有单位证明和批准手续方可供应。5.7检定菌种的使用5.7.1微生物学检验人员根据检验需要，需到部门主管领取工作用菌种或传代用菌种，同时填写检定菌种保存、领用登记台账。5.7.2微生物学检验人员从部门主管领取工作用菌种或传代用菌种，用于日常检验或验证试验，使用后及时 填写检定菌种使用登记台账（附表6）,以便追踪菌种使用历史。5.7.3菌液的制备：将新鲜的斜面菌种培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1 ml含菌数为10100cfu/ml浓菌液放冰箱可保存一周。45分钟湿热灭活处理：a新一代菌种的菌悬液，置于04C冰箱冷藏，用于阳性对

17、照实验，使用期24h,5.8 .检定菌种（废弃）的销毁5.8.1下列情况的菌种或培养物或被污染的器具等，必须采用121C、制备成功后的上一代菌种;b、使用完后的菌种和带有标准菌株的器具和培养物;c、超过有效期的菌种;d、凡被污染、变异、可疑等异常情况菌种;e、其他应废弃的菌种。5.8.2废弃菌种的销毁由微生物检验员提出申请，交部门主管批准后,督，并填写废弃菌种（物品）销毁处理记录（附表7） o进行灭活处理，并有其他人在场监&相关文件:初始污染菌检查标准操作规程、纯化水检测标准操作规程、7、注意事项：中国药典标准操作规程等。者氏林准符hind SUuubinJ八）配制牛1、微生物检验人员最好生物

18、相关专业,要经过培训，取证上岗。细芮埶X憎血|8.2、船买菌种要保留相关证明，最好让药检所数量所开个证明，说明购买菌种的名称、 等，把这个证明附在菌种接受记录后。8.3、菌种的传代、使用在阳性操作间，为保护99 8.4、是细菌:可参照麦氏标准管进行估算。从孵育824小时的非选择性培养基上，为接种，一般将浊度调整至麦氏比浊标准管化取35个菌落，直接用肉汤或盐制成悬液丿10号对应浓度，然后稀释。用前混匀。有效期为今n21 M6个月。应用时,駅）灯麦氏比浊管配制方法：0.048MBaCL2 （1.17%W/VBaCL2 ； ?屮0）、0.36NH2SO/1%V/V）将二液混合，置螺口试管 目测或使用比浊仪即可。中，放室温暗处保存号管对应的菌浓度为30X108cfu/ml,稀释一般用无菌生理盐水（0.9%氯化钠溶液）&附表附表1检定菌接收记录 附表2：检定菌种传代记录 附表3：检定菌种保存、领用登记台账 附表4：检定菌种观察记录 附表5：检定菌种鉴定记录 附表6：检定菌种使用登记台账 附表7：废弃菌种（物品）销毁处理记录附表1:检定菌接收记录:鉴疋困种接收记录文件编号：BJ-QR-WJ013-A1接收日期名称及编号数量代数来源检查情况保