基于叶绿体DNA+PCRRFLP分析柿及其近缘种亲缘关系

1、园艺学报，（）： 2014411224742480 http: / www. ahs. ac. cn acta horticulturae sinica e-mail: 收稿日期：20140724；修回日期：20141031 基金项目：国家十二五农村领域科技计划课题（2013bad14d0502） 基于叶绿体dna pcr-rflp分析柿及其近缘种亲缘关系 梁晋军，梁玉琴，傅建敏* （国家林业局泡桐研究开发中心，中国林业科学研究院经济林研究开发中心，郑州 450003） 摘 要：应用5对叶绿体dna（cpdna）特异引物对柿及其近缘的8个种共32个基因型

2、的cpdna进行pcr扩增。采用7种限制性内切酶对其扩增产物酶切位点变异分析表明，在供试柿属植物中存在丰富的种间多态性，但供试22个柿种内基因型未检测到变异位点。应用ntsys中upgma法聚类和主坐标分析表明：柿与金枣柿最近缘，其次分别是油柿、云南野毛柿、浙江柿和君迁子，而与美洲柿和乌柿相距较远。野柿（浙江）为柿的变种，聚类结果也表明野柿（浙江）与柿有一定差异。 关键词：柿；cpdna；pcr-rflp；遗传多样性；亲缘关系 中图分类号：s 665.2 文献标志码：a 文章编号：0513-353x（2014）12-2474-07 genetic relationships of diospy

3、ros kaki and related diospyros species using chloroplast dna pcr-rflp markers liang jin-jun，liang yu-qin，and fu jian-min* （china paulownia research center，non-timber forest research and development center，chinese academy of forestry，zhengzhou 450003，china） abstract：five special primer pairs of chlor

4、oplast genome were used to amplified chloroplast dna （cpdna）regions in 8 diospyros species including 32 genotypes. the products were digested by seven restriction enzymes. the results showed high interspecific cpdna variations within the genus diospyros. twenty-two d. kaki genotypes were detected no

5、 visually variation in this study. d. kaki had closely relationship withjinzaoshi，followed by d. oleifera，d. artrotricha，d. lotus and d. glaucifolia，but distant from d. virginiana and d. cathayensis in diagram based on the upgma cluster analysis by ntsyspc 2.10e program. wild persimmon（zhejiang）is a

6、 variety varietas of persimmon. the result showed that wild persimmon（zhejiang）is not closely similar to d. kaki. key words：diospyros kaki；cpdna；pcr-rflp；genetic diversity；genetic relationship 柿（diospyros kaki thunb.）品种多数为六倍体，2n = 6x = 90，但也有少量九倍体，2n = 9x = 135（zhuang et al.，1990）。前人已经通过各种分子标记对柿及其近缘

7、种亲缘关系进行研究，但结果差异较大。yuri和shozo（1994）通过对柿及其近缘种叶绿体dna（cpdna）和线粒体dna（mtdna） * 通信作者 author for correspondence（e-mail：） 12期 梁晋军等：基于叶绿体dna pcr-rflp分析柿及其近缘种亲缘关系 2475 的rflp分析，发现老鸦柿与柿最近缘；keizo等（1998）对柿属植物cpdna pcr-rflp分析的结果表明柿与美洲柿最近缘；hu等（2008）、guo和luo（2011）分别用cpdna pcr-rflp和ssr分析表明柿与君迁子最近缘；keizo等（

8、2008）用nrdna的its区和cpdna matk序列分析的结果表明柿与油柿最近缘。此外，hu等（2008）和tang等（2014）分别用cpdna pcr-rflp和its，matk序列变异分析证明金枣柿为一个新种。 由于柿倍性复杂，其核基因组结构和序列也是复杂多变，从核基因组开发分子标记有一定难度，相较于核基因，叶绿体基因组结构和序列非常保守，所以叶绿体基因组能很好地用于种间甚至种内系统进化和亲缘关系的研究（randall et al.，1998）。目前，基于cpdna的pcr-rflp的分子标记已广泛用于遗传多样性、系统进化和植物种类鉴定等研究（claudia et al.，2004

9、；pharmawati et al.，2004；bao et al.，2005）。本研究中通过对4个柿近缘种（君迁子、浙江柿、金枣柿和油柿）cpdna全基因组测序结果对比分析，找出变异较大的4个区段（trnh-matk、rpob-petn、trns-trnfm和ndha）和1个功能基因（rbcl）片段，并设计特异引物对32份柿属植物的5个cpdna区域进行pcr-rflp分析，以期为柿及其近缘种亲缘关系提供有效证据。 1 材料与方法 1.1 材料 试材为柿及其近缘种共8种，1个变种32个基因型（表1）。乌柿、美洲柿和油柿于2014年采自陕西杨陵国家柿种质资源圃，其余于2013年采自国家林业局泡

10、桐研究开发中心柿种质资源圃。 1.2 cpdna区域选择与引物设计 2013年6月采用kerstin等（2008）改良的蔗糖密度梯度离心分离法提取4个柿近缘种（金枣柿、君迁子、浙江柿和油柿）的叶绿体总dna；超声波随机打断dna，电泳回收所需大小片段，加上接头进行文库制备；最后用illumina-miseq测序仪完成规定数据的测序。采用calera assembler组装软件对测序结果进行组装。使用dogma软件对基因进行注释，最后经过人工校正，用clustalx对4个全基因组序列进行对比，找出差异较大的4个区段（trnh-matk、rpob-petn、trns-trnfm和ndha）和差异较

11、小的1个功能基因（rbcl）片段。 针对所选5个区段上、下游，利用primer 5.0软件设计特异引物（表2），并用oligo7.0软件对引物进行评价，选出最优特异引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。 1.3 dna提取、pcr扩增和限制性酶切 1.3.1 dna提取和pcr扩增 2013年6月采用ctab法（doyle & doyle，1987）从柿幼嫩叶片中提取植物总dna，2014年4月进行补充试验。 2014年4月试材dna在bio-red公司pcr仪上进行pcr扩增。反应总体积为25 l，内含1 pcr缓冲液（含1.5 mmol l-1 mg2+），250 mol l-1

12、dntp，10 mmol l-1 tris-hcl，50 mmol l-1 kcl，0.2 mol l-1 primers，1.25 u taq dna polymerase，dna 40 ng。pcr程序为94 预热3 min，1个循环；94 变性45 s，52.7 56 退火1 min（表2），72 延伸1 min 15 s 2 min 30 s，35个循环；最后72 延伸5 min，4 保温。pcr产物通过gelred染色的2.0%琼脂糖凝胶电泳检测。bio-red公司凝胶成像系统观察并记录谱带。 2476 园 艺 学 报 41卷 表1 试验材料 table 1 the material

13、s in this study 学名 scientific name 倍性水平ploidy level 编号 code 种/品种名 specie/cultivar name 脱涩类型astringent type 来源 source diospyros lotus 2n = 2x = 30 1 君迁子（雌）date plum（female） 陕西 shaanxi 2n = 2x = 30 2 君迁子（雄）date plum（male） 陕西 shaanxi d. glaucifolia 2n = 2x = 30 3 浙江柿chekiang persimmon 浙江 zhejiang d. ka

14、ki thunb. var. silvestris 2n = 6x = 90 4 野柿（浙江）wild persimmon（zhejiang） 浙江 zhejiang d. oleifera 2n = 2x = 30 5 油柿oily persimmon 浙江 zhejiang d. virginiana l. 2n = 6x = 90 6 美洲柿（雌）common persimmon（female） 美国 usa 2n = 6x = 90 7 美洲柿（雄）common persimmon（male） 美国 usa d. sp. 2n = 2x = 30 8 金枣柿jinzaoshi 浙江 z

15、hejiang d. cathayensis 2n = 6x = 90 9 乌柿woolly-flowered persimmon 陕西 shaanxi d. artrotricha 2n = 2x = 30 10 云南野毛柿yunnan yemaoshi 云南 yunnan d. kaki thunb. 2n = 6x = 90 11 富有fuyuu pcna 日本 japan 12 次郎jirou pcna 日本 japan 13 晚御所oku-gosho pcna 日本 japan 14 阳丰youhou pcna 日本 japan 15 禅寺丸zenjimaru pvna 日本 jap

16、an 16 湖南鸟柿hunan niaoshi pca 湖南 hunan 17 黑柿blank persimmon pca 日本 japan 18 斤柿jin persimmon pca 日本 japan 19 正月 akagaki pvna 日本 japan 20 甜宝盖baogai tianshi pcna 湖北 hubei 21 秋焰qiuyan pcna 湖北 hubei 22 罗田甜柿luotian tianshi pcna 湖北 hubei 23 磨盘柿 mopanshi pca 河北 hebei 24 长安怀抱月changan huaibaoyue pca 陕西 shaanxi

17、25 台湾正柿taiwan zhengshi pca 台湾 taiwan 26 牛头柿niutoushi pca 福建 fujian 27 野柿1号 wild persimmon 1 湖南 hunan 28 野柿2号 wild persimmon 2 湖北 hubei 29 野柿3号 wild persimmon 3 湖北 hubei 30 野柿4号 wild persimmon 4 江苏 jiangsu 31 野柿5号 wild persimmon 5 湖北 hubei 2n = 9x = 135 32 平核无hiratanenashi pva 日本 japan 注：pcna：完全甜柿；pc

18、a：完全涩柿；pvna：不完全甜柿；pva：不完全涩柿；：未知。 note：pcna：pollination-constant and non-astringent；pca：pollination constant astringent；pvna：pollination variant non-astringent；pva：pollination variant astringent；：unknown. 表2 cpdna特异引物序列及扩增条件 table 2 cpdna the sequence and amplification conditions of cpdna special pri

19、mer pairs in this study 区域 region 正向引物 squence forward（53） 反向引物 sequence reverse（53） 退火温度/ annealing temperature 片段长度/bp fragment lengthtrnh-matk attcttcgtcgccgtagtaaa ggcggatttggtatttgga 55 2 200 rpob-petn aaagttcttccgtcaagc tccccatactacgagtgaaa 52.7 2 000 trns-trnfm gctatcaaccactcagccatct gaggtcac

20、gggttcaaatc 56 1 000 ndha attcagtttgataacctgctac tttggctatcgtcttgttcta 53 1 500 rbcl ggagggatttatgtcaccac ttgtattcggctcaatcctt 55 1 500 12期 梁晋军等：基于叶绿体dna pcr-rflp分析柿及其近缘种亲缘关系 2477 1.3.2 酶切反应 应用apo、hinf、taq、mse、mbo、ava和dra 7种限制性内切酶（购自neb公司）对扩增出的cpdna片段进行酶切。酶切反应体积为15 l，内含6 l pcr产物，2 4 u限制性内切酶和1 限制性内切酶

21、反应缓冲液，酶切时间为10 h，除taq反应温度为65 外，其余均为37 。酶切产物通过gelred染色的2.5%琼脂糖凝胶电泳检测。bio-red凝胶成像系统观察并记录谱带。 根据扩增片段酶切产物的琼脂糖电泳图谱上条带的有或无标记为1或0，建成原始矩阵。应用ntsys 2.10，依据upgma（unweighted pair group method arithmetic averages）法进行聚类分析。 2 结果与分析 2.1 柿及其近缘种cpdna pcr-rflp的多态性 设计的5对特异引物均能在供试32份柿及其近缘种中扩增出一条谱带，通过2%琼脂糖凝胶电泳，检测出扩增产物无明显长度

22、差异。 5个pcr扩增后的产物经过apo、hinf、taq、mse、mbo、ava和dra 7种限制性内切酶酶切，35对特异引物/限制性内切酶组合中有22对（62.9%）检测到明显的种间差异，共获得181个片段，其中105个片段（58%）呈现多态性。在rpob-petn、trns-trnfm、ndha、rbcl区域均未检测到ava的酶切位点，trnh-matk、rpob-petn、ndha区域与其余6种限制性内切酶组合均存在丰富的种间多态性，说明本试验所选区域种间存在较大变异；而rbcl区域仅有一个酶切组合存在多态性，说明在关键功能基因片段（rbcl）处柿近缘种存在较少变异，以此反推所选近缘种

23、均与柿亲缘关系较近。在所有35对酶切组合中未检测到22个柿种内试材有酶切位点差异，表明柿种内叶绿体基因组十分保守。 由图1可以看出，依据trnh-matk/dra、rpob-petn/mbo两种区域/酶切组合可明确将8个种，1个变种，分为9组：1和2：君迁子；3：浙江柿；4：野柿（浙江）；5：油柿；6和7：美洲柿；8：金枣柿；16：乌柿；10：云南野毛柿；11 15：柿品种。在22对多态性酶切组合中，仅trns-trnfm/apo组合能检测出君迁子（1和2）的雌雄位点变异（图1，d）；仅trnh-matk/dra（图1，a）组合能检测出柿变种野柿（浙江）与柿位点变异（图1，a中4与11 15）

24、。ndha/mbo（图1，c）组合可能有存在柿种内些微长度差异（未记录新条带），尚待进一步验证。 材料16 32全部为无差异位点柿种内品种，未单独列出。 2.2 柿及其近缘种间的亲缘关系 根据所得到酶切位点变异数据建成的原始矩阵，利用ntsys-pc version 2.10软件计算sm相似指数，upgma法进行聚类（图2），柿种内22个品种无差异归为柿种下；同时进行8个种种间主坐标分析（图3），雌雄（君迁子和美洲柿）归为一种，柿种内22个品种和1个变种野柿（浙江）归为柿种下。在图2和图3中，六倍体柿与同为多倍体的美洲柿和乌柿相似性最差，分布位置最远，表明柿与乌柿和美洲柿亲缘关系相对较远，尽管

25、柿与乌柿、美洲柿倍性相同，但cpdna序列变异较大，表明两者有不同的起源祖先，这与前人研究结果（nakasuka et al.，2002；choi et al.，2003；guo & luo，2006；guo et al.，2006；hu et al.，2008）一致；柿与金枣柿、油柿和云南野毛柿聚为一类，且柿与二倍体金枣柿相似度最高，亲缘关系最近，该结果与hu等（2008）和guo等（2011）关于柿与君迁子最近缘的结果不同。 2478 园 艺 学 报 41卷 图1 部分柿及其近缘种cpdna pcr产物经限制性内切酶酶切后2.5%琼脂糖凝胶电泳图谱 1 16见表1，ma为dl2000，mb

26、为50 bp ladder。 fig. 1 restriction patterns of amplified and digested products of chloroplast genomic dna from diospyros spp. 116 refer to the numbers list in table 1. ma：dl2000；mb：50 bp ladder. 图2 pcr-rflp分析的upgma聚类图 fig. 2 dendrogram of all genotypes from the upgma cluster analysis based on pcr-rfl

27、p data 12期 梁晋军等：基于叶绿体dna pcr-rflp分析柿及其近缘种亲缘关系 2479 图3 柿属植物种间pcr-rflp主坐标分析散点图 fig. 3 diagram showing the relationships among species based on principal coordinates analysis by pcr-rflp 3 讨论 前人通过ty1-copia反转录转座子southern杂交（nakasuka et al.，2002）；检测dna重复位点序列同源性（choi et al.，2003）；srap、irap、remap（guo & luo，

28、2006；guo et al.，2006）；cpdna pcr-rflp多态性分析（hu et al.，2008）均表明美洲柿与柿亲缘关系较远，本试验结果与之一致。但keizo等（1998）通过对东南亚部分柿属植物包括24个种的限制性内切酶酶切研究，用邻接法分析表明柿与美洲柿、君迁子聚成一组，导致结果不完全相同的原因是所选材料和扩增区段不同。 有研究用cpdna pcr-rflp和ssr分析表明柿与君迁子亲缘关系最近（hu et al.，2008；guo & luo，2011）；而本试验结果表明柿与君迁子、浙江柿亲缘关系较远，柿与金枣柿、油柿、云南野毛柿聚为一类，亲缘关系较与君迁子和浙江柿更近

29、（图2，图3），导致两种不同结果最可能的原因是选用扩增区域和限制性内切酶的不同。keizo等（2008）通过用nrdna its区和cpdna matk序列分析表明柿与油柿最近缘，这与本试验中柿与金枣柿、油柿、云南野毛柿聚为一类的结果（图2）相一致，就柿与油柿的叶片表观形态而言，柿也与油柿相近。本试验结果表明柿种内无酶切位点差异与前人（yuri & shozo，1994；keizo et al.，1998；hu et al.，2008）用同一方法得到的结果一致。 金枣柿曾被学术界认定为柿的一个二倍体品种（杨勇 等，1999），后经hu等（2008）和tang等（2014）分别用cpdna pc

30、r-rflp和its，matk序列变异分析证明金枣柿为一个新种。本试验中柿与金枣柿能完全分开，支持金枣柿为一新种的结论。 references bao y，lu b r，ge s. 2005. identification of genomic constitutions of oryza species with the b and c genomes by the pcr-rflp method. genetic resources and crop evolution，52：6976. choi y a，tao r，keizo y，sugiura a. 2003. genomic dis

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