抗体制药的可行性

1、第六章 抗体制药 概述； 单克隆抗体； 基因工程抗体； 多功能抗体； 抗体工程。 抗体制药的可行性 第六章 抗体制药 抗体制药的可行性 第一节 概述 免疫学知识复习： 抗原（概念，抗原决定簇）； 抗体（概念）； 免疫球蛋白（结构，水解片段，抗原结合价； 功能）； 抗体研究的发展历史。 第六章 抗体制药 抗体制药的可行性 一 免疫学知识复习 1890年Behring和北里柴三郎发现白喉抗毒 素,建立了血清疗法,开创了抗体制药。 1937年Tiselius用电泳法将血清蛋白分离为 白蛋白、球蛋白，并证明抗体活性 主要存在于球蛋白组分。 第六章 抗体制药 抗体制药的可行性 （一）抗原 抗原（Anti

2、gen，Ag）：是指能刺激机体免疫系统， 诱导免疫应答，并能与应答产物如抗体或致敏淋 巴细胞发生特异性反应的物质。 一个完整的抗原应包括两方面的免疫性能： 免疫原性（immunogenicity）指诱导宿主产生免 疫应答的能力，具有这种能力的物质称为免疫原 （immunogen）； 免疫反应性（immunoreactivity）指抗原与抗体 或致敏淋巴细胞发生特异性结合的能力，亦称为 反应原性。 第六章 抗体制药 抗体制药的可行性 抗原决定簇 抗原决定簇（又称表位，epitope）：指抗原表面决 定其特异性的特定化学基团，是决定抗原反应性能呈 现高度特异性的物质基础； 一个抗原的表面可以有一种

3、或多种不同的抗原决定簇， 每一种抗原决定簇决定着相应的特异性； 抗原决定簇的分子很小，大体相当于相应抗体的结合 部位。一般由57个AA、单糖或核苷酸残基组成； 与抗体分子相结合的抗原决定簇的总数，称作抗原结 合价（antigenic valence）。 第六章 抗体制药 抗体制药的可行性 （二）抗体 抗体（antibody,Ab）：是高等动物体在抗 原的刺激下，由浆细胞所产生的一类能与 相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。 作为抗体，必须具备以下条件：A只有脊椎 动物（鱼类以上）的浆细胞才能产生；B必 须要有抗原物质的刺激；C能与相应的抗原 发生特异性的结合；D其化学本质是一类具 有免疫功能的

4、球蛋白。（周德庆微生物 学教程） 第六章 抗体制药 抗体制药的可行性 抗体是高等脊椎生物的免疫系统受到抗原 刺激后，由成熟的B淋巴细胞产生的能够与 该抗原发生特异结合的糖蛋白分子，它是 机体免疫系统中最重要的效应分子，具有 结合抗原、结合补体、中和毒素、介导细 胞毒、促进吞噬等功能，从而发挥抗感染、 抗肿瘤、免疫调节与监视等作用，因此， 抗体又称为免疫球蛋白。（王旻生物制 药技术） 第六章 抗体制药 抗体制药的可行性 抗体的产生：机体免疫系统受抗原刺激后， B淋巴细胞被活化增殖和分化为浆细胞，由 浆细胞合成和分泌的球蛋白； 免疫球蛋白（Ig） 指具有抗体活性或化学 结构与抗体相似的球蛋白。抗体

5、是免疫球 蛋白，而免疫球蛋白不一定都是抗体。抗 体是生物学和功能上的概念，免疫球蛋白 是结构和化学本质的名称。 第六章 抗体制药 抗体制药的可行性 （三）免疫球蛋白的结构 免疫球蛋白的基本结构 第六章 抗体制药 抗体制药的可行性 第六章 抗体制药 抗体制药的可行性 重链糖基化 ，轻链无糖基化； 其中高可变区（Hypervariable region, HV区） 或互补决定区（Complementary determining region, CDR）是抗原特异结合部位。 第六章 抗体制药 抗体制药的可行性 免疫球蛋白的水解片段 第六章 抗体制药 抗体制药的可行性 单体：由一个“Y”形分子组成的

6、Ig，IgG、 IgD和IgE都是以单体形式存在的 双体和三体：IgA在人的血清中以单体形式 存在，在分泌液中则以双体占优势。 五体：IgM 第六章 抗体制药 抗体制药的可行性 第六章 抗体制药 抗体制药的可行性 Ig的抗原结合价 抗原结合价（valency）即每一Ig分子上能与 抗原决定簇相结合部位的数目。 由一个轻链可变区和一个重链可变区可组 成一个抗原结合价。 Ig的单体是二价，双体四价，三体六价， IgM理论上是十价，但经测定只有五价。 第六章 抗体制药 抗体制药的可行性 免疫球蛋白的功能 第六章 抗体制药 抗体制药的可行性 1.免疫球蛋白V区的功能 主要是特异性识别、结合抗原。由于I

7、g有单体、二聚体和五聚体， 因此结合抗原表位的数目也不同。Ig结合抗原表位的个数称为抗原 结合价。 2.免疫球蛋白C区的功能 （1）激活补体 IgG13和IgM与相应抗原结合后，可因构型改变而使其CH2/CH3功 能区内的补体结合点暴露，从而导致补体传统途径激活。IgG4、 IgA和IgE与抗原结合后不能激活补体传统途径，但其凝聚物可激活 补体旁路途径。 第六章 抗体制药 抗体制药的可行性 （2）细胞亲嗜性 IgG与IgE抗体具有亲细胞特性，可通过其Fc段与表面具有相应受体的细胞结合，产 生不同的生物学作用。 （3）调理作用 IgG与细菌等颗粒性抗原结合后，可通过其Fc段与巨噬细胞和中性粒细胞

8、表面相应 IgGFc受体的结合而促进吞噬细胞对细菌等颗粒抗原的吞噬，此即抗体的调理吞噬 作用。 （4）抗体依赖细胞介导的细胞毒作用（ADCC） IgG与肿瘤或病毒感染的靶细胞结合后，可通过其Fc段与NK细胞、吞噬细胞和中性 粒细胞表面相应IgGFc受体的结合，增强NK细胞和触发吞噬细胞对靶细胞的杀伤破 坏作用，即产生ADCC效应。 （5）介导型超敏反应 IgE为亲细胞抗体，可通过其Fc段与肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面相应IgEFc受体结 合，而使上述免疫细胞处于致敏状态。当相同变应原再次进入机体与致敏靶细胞 表面特异性IgE结合时，即可使之脱颗粒，释放组胺等生物活性介质引起型超敏 反应。 第六章

9、 抗体制药 抗体制药的可行性 二 抗体研究的发展 多克隆抗体阶段； 单克隆抗体阶段； 基因工程方法制备抗体阶段。 第六章 抗体制药 抗体制药的可行性 多克隆抗体阶段 第一代抗体：以1890年Behring发现白喉抗毒素为代 表； 特点：用抗原免疫动物获得多克隆抗体； 多克隆抗体：将某种天然抗原经各种途径免疫动物， 成熟的B细胞克隆受到抗原刺激后，便产生抗体并将 之分泌到血清和体液中，这种抗体实际是一种混合 物，因此又称多克隆抗体； 病原微生物含有多种抗原决定簇的抗原物质，因此 这些抗体制剂也是多种抗体的混合物。 第六章 抗体制药 抗体制药的可行性 传统传统抗血清抗血清 抗抗 原原 免免 疫疫

10、所有抗所有抗体体混合混合 1 2 34 BALB/ c 1234 1 2 34 第六章 抗体制药 抗体制药的可行性 单克隆抗体阶段 多克隆抗体的不均一性，限制了对抗体结构和功能的 进一步研究和应用； 第二代抗体或细胞工程抗体：以1975年Kohler和 Milstein创建杂交瘤技术制备单克隆抗体为代表； 单克隆抗体与多克隆抗体最主要的区别是单克隆抗体 为单一种B细胞所产生的一种均一的免疫球蛋白分子； 单克隆抗体的制备技术是杂交瘤技术（hybredoma technique）。 第六章 抗体制药 抗体制药的可行性 1 2 3 4 m m m m 1 2 3 4 1234 单单抗抗 细细胞融合胞

11、融合 取出脾細胞取出脾細胞 + 癌細胞癌細胞 各抗各抗体体分分开开 第六章 抗体制药 抗体制药的可行性 基因工程抗体（21） 第三代抗体：以1994年Winter以基因工程 方法制备抗体为代表； 单克隆抗体的缺陷：单克隆抗体多是由鼠 B细胞与鼠骨髓瘤细胞经细胞融合形成的杂 交瘤细胞分泌的，具有鼠源性，进入人体 后会引起人抗抗体反应（HAMA反应）。 第六章 抗体制药 抗体制药的可行性 基因工程抗体（22） 基因工程抗体：将抗体的基因按不同需要 进行改造和重组，然后导入适当的受体细 胞中进行表达； 两个条件： 抗体基因结构和功能的研究； DNA重组技术的应用。 随后，以DNA重组技术对抗体分子进

12、行改 造从而满足人们不同需要的抗体工程技术 诞生。 第六章 抗体制药 抗体制药的可行性 第二节 单克隆抗体 概述； 单克隆抗体的生产流程： 抗原与动物免疫； 细胞融合与杂交瘤细胞的选择性培养； 筛选阳性克隆与克隆化； 杂交瘤细胞与抗体性状的鉴定 ； 单克隆抗体的大量制备； 单克隆抗体的纯化； 单克隆抗体的特点； 单克隆抗体的应用。 第六章 抗体制药 抗体制药的可行性 一 概述 参与体内免疫反应的来自骨髓的两类细胞： B淋巴细胞，有合成一种抗体的遗传基因； T淋巴细胞，帮助淋巴细胞产生抗体。 有上百万种不同的B淋巴细胞系，含遗传基因不 同的B淋巴细胞合成不同的抗体； 当机体受抗原刺激时，抗原分子

13、上的许多决定簇 分别激活各个具有不同基因的B细胞，被激活的B 细胞分裂增殖，并合成多种抗体。 第六章 抗体制药 抗体制药的可行性 第六章 抗体制药 抗体制药的可行性 制造专一抗体制造专一抗体 的的B细胞细胞 ？不能体外生长？不能体外生长 骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞 可在体外可在体外 生长繁殖生长繁殖 合成专一抗体；合成专一抗体； 体外生长繁殖体外生长繁殖 第六章 抗体制药 抗体制药的可行性 单克隆抗体：是将抗体产生细胞与具有无 限增殖能力的骨髓瘤细胞相融合，通过有 限稀释法及克隆化使杂交瘤细胞成为纯一 的单克隆细胞系而产生的；由于这种抗体 是针对一个抗原决定簇的抗体，又是单一 的B淋巴细胞产生的，故

14、称为单克隆抗体。 第六章 抗体制药 抗体制药的可行性 抗体生产全部用杂交瘤和CHO细胞系。 杂交瘤细胞：从小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞 的融合细胞中分离获得杂交瘤细胞系，有 SP2/O、J558L和NSO等。能在无血清培养 基中高密度悬浮生长，容易转染和生长， 能进行糖基化等加工修饰，大量分泌和高 效表达。不同的启动子在骨髓瘤细胞中都 能发挥很好的作用。 第六章 抗体制药 抗体制药的可行性 二 单克隆抗体的生产流程 第六章 抗体制药 抗体制药的可行性 鼠源单克隆抗体是用动物鼠来生产的，先 制备鼠杂交瘤细胞系，然后在体内或体外 生产抗体； 杂交瘤细胞系的制备工艺包括免疫动物、 亲本细胞的制备、细胞融合

15、、培养筛选与 鉴定、克隆化等过程。 第六章 抗体制药 抗体制药的可行性 （一）抗原与动物免疫 制备用于免疫的适当抗原： 化学方法合成，如精制的地高辛； 病原微生物、肿瘤细胞等； 但在多数情况下抗原物质只能得到部分纯化， 甚至是极不纯的混合物，再通过克隆化选出 最适当的单克隆抗体。 第六章 抗体制药 抗体制药的可行性 免疫动物 因免疫动物品系和骨髓瘤细胞在种系发生上距离 越远，产生的杂交瘤越不稳定、故一般采用与骨 髓瘤供体同一品系的动物进行免疫； 目前常用的骨髓瘤细胞系来自BALBc小鼠和Lou 大鼠，因此免疫动物最常用的也是BALBc小鼠； 在选择动物时应考虑到动物品系的免疫应答基因 对抗原免

16、疫应答的影响，是否能产生良好的免疫 应答。常用的骨髓瘤细胞系及其来源见表4一1。 第六章 抗体制药 抗体制药的可行性 免疫方法 免疫方法 体内免疫法体外免疫法 腹腔免疫脾内免疫 第六章 抗体制药 抗体制药的可行性 体内免疫法：适用于免疫原性强、抗原量 较多时应用，一般用812周龄的雌性鼠； 颗粒性抗原（如细菌、细胞抗原）； 可溶性抗原。 体外免疫法：用于不能采用体内免疫的情 况下，如制备人源性单克隆抗体；免疫源 性极弱，易引起免疫抑制； 优点：需抗原量少，免疫期短，干扰因素少； 缺点：融合后产生的杂交瘤细胞不够稳定； 免疫的方法见课本P146。 第六章 抗体制药 抗体制药的可行性 （二）细胞融

17、合与杂交瘤细胞 的选择性培养 细胞融合的方法： 脾细胞（1108）与骨髓瘤细胞（2107 3107）混合，在聚乙二醇（PEG）诱导下融 合时间2分钟内，然后用培养液将融合液缓慢 稀释； PEG相对分子量4000，浓度为4050%为佳。 二甲基亚砜增加融合率。（注：二者对细胞有 毒性，必须严格控制它们和细胞的接触时间）。 第六章 抗体制药 抗体制药的可行性 瘤细胞瘤细胞脾细胞脾细胞 第六章 抗体制药 抗体制药的可行性 杂交瘤细胞的选择性培养 选择性培养：培养基为HAT培养液。次黄嘌呤(H) 氨甲喋呤(A)胸腺嘧啶(T)配制； A阻断DNA合成的主要途径，瘤瘤融合细胞和 瘤细胞因不能合成DNA而死

18、亡； 骨髓瘤细胞都是次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 （HGPRT）缺乏株，脾细胞内却有这种酶，因此 脾一瘤融合的杂交瘤细胞可利用HGPRT，用次黄 嘌呤（H）和T合成DNA，使杂交瘤细胞得以生长。 第六章 抗体制药 抗体制药的可行性 选择性培养的方法 将融合的细胞悬浮于HAT的培养液，加入到 96孔板内培养，根据情况每23d换液一次 （部分换液）。7d内用HAT培养液，杀死瘤 瘤细胞； 7至14天改用HT培养液； 14天后改用普通的RPMI1640完全培养液； 注：大量瘤细胞死亡后，单个或少数杂交 瘤细胞不易存活，需加入饲养细胞（可能 提供刺激因子等）。 第六章 抗体制药 抗体制药的可行性 第六

19、章 抗体制药 抗体制药的可行性 （三）筛选阳性克隆与克隆化 筛选阳性克隆筛选阳性克隆 检测方法检测方法 免疫酶技术：免疫酶技术： 适于可溶性抗适于可溶性抗 原及颗粒性抗原及颗粒性抗 原的检测原的检测 免疫荧光技术免疫荧光技术 ：适于细胞抗适于细胞抗 原的抗体检测原的抗体检测 放射免疫技术放射免疫技术 ：适于可溶性适于可溶性 抗原及颗粒性抗原及颗粒性 抗原的检测抗原的检测 课本中图43。 此图用的是间接法测抗体，原理是此图用的是间接法测抗体，原理是 用酶标记的抗体以检测已于固相用酶标记的抗体以检测已于固相 结合的受检抗体，故称为间接法。结合的受检抗体，故称为间接法。 （1）特异性抗原与固相载体连

20、接，形成固相抗）特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗 原：洗涤除去未结合的抗原及杂质。原：洗涤除去未结合的抗原及杂质。 （2）加稀释的受检血清（或加受检样品）：样）加稀释的受检血清（或加受检样品）：样 品中的特异抗体与抗原结合，形成固相抗品中的特异抗体与抗原结合，形成固相抗 原抗体复合物。经洗涤后，固相载体上只原抗体复合物。经洗涤后，固相载体上只 留下特异性抗体。其他免疫球蛋白及血清留下特异性抗体。其他免疫球蛋白及血清 中的杂质由于不能与固相抗原结合，在洗中的杂质由于不能与固相抗原结合，在洗 涤过程被洗去。涤过程被洗去。 （3）加酶标抗抗体：与固相复合物中的抗体结）加酶标抗抗体：与固相复合物中

21、的抗体结 合，从而使该抗体间接地标记上酶。洗涤合，从而使该抗体间接地标记上酶。洗涤 后，固相载体上的酶量就代表特异性抗体后，固相载体上的酶量就代表特异性抗体 的量。的量。 （4）加底物显色：颜色深度代表标本中受检抗）加底物显色：颜色深度代表标本中受检抗 体的量。体的量。 抗体制药的可行性 第六章 抗体制药 抗体制药的可行性 克隆化 克隆化：是指单个细胞通过无性繁殖而获得细胞 集团的整个培养过程，这种细胞集团的每个细胞 的生物学特性和功能完全相同； 刚融合获得的杂交瘤细胞不稳定，染色体易丢失， 因此应尽早进行克隆化； 一般经过大约3次的克隆化，才能达到100孔内 均为抗体阳性细胞克隆； 常用的克

22、隆化方法： 有限稀释法（P148）； 软琼脂法（P148） 。 第六章 抗体制药 抗体制药的可行性 （四）杂交瘤细胞与抗体性状的 鉴定 杂交瘤细胞鉴定： 染色体分析：是鉴定的客观指标，了解分泌抗 体的能力； 单抗进行Ig类和亚类鉴定； 亲和力、特异性、纯度、分子量测定。 第六章 抗体制药 抗体制药的可行性 （五）单克隆抗体的大量制备 体外培养法：可获得10g/ml抗体； 体内诱生法：可获得520mg/ml抗体（目前多采 用此法）； 体外培养法：与动物细胞大规模培养方法基本一 致； 体内诱生法的具体方法：小鼠腹腔注射0.5ml降植 烷（或液体石蜡）12周后接种杂交瘤细 胞生成腹水后抽取（一般是接

23、种杂交瘤细胞 后712d ）离心去细胞沉淀取上清液冻 存。 第六章 抗体制药 抗体制药的可行性 （六）单克隆抗体的纯化 依单抗IgG类和亚类不同，选各种不同的纯化方法； 根据用途不同，选不同的纯化方法； 体内诱生法单克隆抗体的纯化方法： 离心（1000g离心5min去除红细胞、纤维蛋白凝块 及脂质等；20000g离心30min去小颗粒物质） 上清液超滤（除细菌、之原体等）盐析（回收 抗体）； 分离 凝胶过滤用于IgG 和IgM单抗纯化； 阴离子交换层析IgG单抗纯化； 亲和层析 IgG单抗纯化。 第六章 抗体制药 抗体制药的可行性 第六章 抗体制药 抗体制药的可行性 （七）单克隆抗体的特点 优

24、点： 具有特异性高、亲和力强、效价高、血清交叉 反应少，应用于临床的抗肿瘤、抗感染、解毒、 抗器官移植排斥反应等。 缺点： 有鼠源性，对人体有较强的免疫原性 （immunogenicity）；半衰期短，靶向吸收差， 全抗体分子量大，很难通过血管进入细胞，特 别是肿瘤等部位含量低，降低了疗效。生产复 杂，价格昂贵。 第六章 抗体制药 抗体制药的可行性 （八）单克隆抗体的应用 单克隆抗体作为抗体制剂，在临床上主要用于疾病的 诊断和治疗。 第六章 抗体制药 抗体制药的可行性 检测与某些疾病有关的抗原，辅助临床诊 断； 用放射性核素标记单克隆抗体进行肿瘤显 像，做免疫定位诊断； 临床治疗，如针对T淋巴

25、细胞共有的分化抗 原CD3（cluster of differentiation,CD3）； 作为免疫抑制剂对器官移植免疫排斥有抑 制作用。 第六章 抗体制药 抗体制药的可行性 以单克隆抗体作为载体的药物对肿瘤进 行定向治疗。但是，临床应用的实践证 明，免疫导向疗法并没有成功，其障碍 有： 鼠源性抗体，应用于人体内可产生人抗鼠 抗体体（human antimouse antibody,HAMA），加速了排斥反应，在人 体内的半衰期只有56小时； 完整的抗体分子的相对分子质量过大，难 以穿透实体肿瘤组织。 第六章 抗体制药 抗体制药的可行性 基于上述原因，需从二个方面对单克隆抗 体加以改造： 降

26、低单克隆抗体的免疫原性； 降低单克隆抗体的相对分子质量。可以利用基 因工程技术制备出基因工程抗体，即可达到上 述两个目的。 第六章 抗体制药 抗体制药的可行性 第三节 基因工程抗体 目标： 降低鼠源性单克隆抗体分子的免疫原性人源化； 降低抗体的相对分子质量增加组织的透过性。 可行性： V区中， CRD区是抗体和抗原特异结合的关键部位， C区决定了Ig分子的异种抗原性C区用人的Ig分 子的C区置换，保留CDR区结构； 特异性结合抗原功能是Ig最主要功能只克隆出 V区，并使其表达。 类型类型基本结构基本结构相对相对M 思路思路 人人-鼠嵌鼠嵌 合抗体合抗体 人人IgC-鼠鼠 IgV 150 000

27、 Hs,Ls基因基因+ Hr,Lr基因，共基因，共 转染骨髓瘤细胞并表达转染骨髓瘤细胞并表达 改形抗改形抗 体体 鼠鼠CDR替替 换人换人CDR 150 000 鼠源鼠源CDR区替换人源区替换人源CDR区区 Fab抗体抗体 完整完整L链和链和 Fd 50 000 Fab片段间仍有铰链区与二硫片段间仍有铰链区与二硫 键，为键，为Fab双体，具有完整的双体，具有完整的 双价抗体活性，保持抗体分双价抗体活性，保持抗体分 子的立体构型，在人体仍很子的立体构型，在人体仍很 稳定稳定 Fv（抗（抗 体可变体可变 区片段）区片段） VH和和VL25 000 水解的水解的Fab片段，除了主峰外片段，除了主峰外

28、 还有一较小峰，具有完整抗还有一较小峰，具有完整抗 体相似的结合能力体相似的结合能力 抗体制药的可行性 第六章 抗体制药 抗体制药的可行性 免疫球蛋白的基本结构 类型类型基本基本 结构结构 相对相对 M 思路思路 单链抗体单链抗体 （scFv） VH-多多 肽肽-VL 27 000 由一段弹性连接肽把由一段弹性连接肽把VH和和VL相相 连连， ，是具有抗原结合特异性的最 是具有抗原结合特异性的最 小功能结构单位，小功能结构单位，在肿瘤导向治在肿瘤导向治 疗和体内显像疗和体内显像,以及其他免疫诊以及其他免疫诊 断和防治中有广泛前景断和防治中有广泛前景 单域抗体单域抗体 VH或或 VL 12 50

29、0 VH和和VL是具有结合抗原特异性的是具有结合抗原特异性的 小抗体片段，为研究抗体的抗原小抗体片段，为研究抗体的抗原 结合位点提供很好的模型结合位点提供很好的模型 最小识别最小识别 单位单位 （MRU） 一个一个 CDR 2 000 比比VH和和VL更小的更小的CDR区基因编码区基因编码 蛋白能模拟抗体结合活性，是抗蛋白能模拟抗体结合活性，是抗 体结合抗原的最小片段。体结合抗原的最小片段。 抗体制药的可行性 第六章 抗体制药 抗体制药的可行性 第四节 多功能抗体 双功能抗体； 多功能抗体； 抗体融合蛋白。 第六章 抗体制药 抗体制药的可行性 双功能抗体 双功能抗体（双特异性单链抗体,bispecific single- chainFvs,bisFvs）：指将一种抗体分子与另一种功 能分子如毒素、酶或另一