肥大心肌细胞分析论文_优秀论文

1、 肥大心肌细胞分析论文【摘要】目的：观察压力超负荷性肥大心肌细胞表面AT1和AT2受体mRNA表达的动态变化.方法：构建压力超负荷性心肌肥大模型, 于不同时间点急性分离心肌细胞.采用RTPCR法观察肥大心肌细胞中AT1和AT2mRNA表达的动态变化.结果：随着大鼠心肌肥厚程度的逐渐加重, 于术后4wk起, AT1与AT2mRNA的表达水平较之假手术组均逐渐升高, 8wk时继续升高.主动脉缩窄12wk组AT1的表达水平与8wk组无显著性差异, 但AT2的表达水平从0.4380.088进一步升高至0.5800.066, 且差异有显著性（P【关键词】心肌细胞受体血管紧张素II1型受体血管紧张素II2

2、型0引言目前已发现细胞表面主要存在着血管紧张素（Ang）的两种受体, 即型受体（AT1）及型受体（AT2）.已知AT1介导了几乎所有Ang的生物学效应1, 而AT2的功能至今尚不完全清楚.目前认为, AT2与胚胎发育、细胞分化、凋亡等生物过程有关, 且在某些方面具有与AT1相拮抗的作用.AT2可以减轻或逆转心脏纤维化以及血管重塑2, 从而对抗AT1介导的促纤维化作用；AT2可以引起血管舒张3, 而这也与AT1引起的血管收缩效应相反.成年期AT2的表达水平低下, 在某些病理条件下,AT2及AT1的表达水平将会发生变化.由于这两型受体可能存在拮抗作用, 因而在不同疾病条件下二者表达水平的变化将会对

3、心脏的功能和结构起重要的调节作用.目前, 有关心肌肥大过程中心肌细胞上Ang受体动态变化的报道不多.我们以压力超负荷性肥大心肌细胞为实验对象, 观察在细胞肥大过程中其表面AT1和AT2受体mRNA表达的动态变化及与心肌肥大之间的相互关系, 以期进一步深入理解两型受体在心肌肥大发生中的作用及其机制.1材料和方法1.1材料雄性SD大鼠36只, 体质量220250g（西安交通大学实验动物中心).Ang, collagenase, protease及BSA（Sigma公司）.Trizol及Taq酶（Promega公司）, dNTPs及100bpDNALadder（华美生物工程公司）.引物由上海康成生物

4、技术有限公司合成.其它试剂均为进口或国产分析纯.1.2方法1.2.1压力超负荷性心肌肥大模型的构建将实验动物随机分为2组各18只, 腹主动脉缩窄组于左肾动脉上方小心分离长约3mm的腹主动脉, 套以内径为0.8mm的银夹造成缩窄；假手术组除不以银夹缩窄腹主动脉外, 其余操作同腹主动脉缩窄组.术后分别饲养4wk（6只）、8wk（6只）及12wk（6只）.1.2.2心肌细胞的分离及心肌肥大指数测定采用胶原酶Langendorff法对心脏进行逆行灌流,待灌流结束首先测取左心室质量(包括左心室游离壁和室间隔), 计算左心室质量与体质量比值(LV/BW).而后获取含有左心室游离壁和室间隔的肥大心肌细胞.由

5、于心肌细胞的体积和质量较成纤维细胞、微血管内皮细胞等大的多, 因而经50g温和离心1min后, 在置换上清液的同时梯度恢复溶液中Ca2+的浓度.此过程重复34次后, 基本去除所含非心肌细胞4.提取部分心肌细胞,使用目镜测微尺测量心肌细胞横径（TDM）.高倍镜下（1040）随机选取20个视野,计算其中杆状心肌细胞横径, 取其均值为该例左心室心肌细胞横径（LVTDM）.1.2.3RTPCR一步法提取细胞总RNA, 逆转录成cDNA, PCR扩增.条件为：94变性1min,退火1min.72延伸1min, 共30个循环, 而后于72再延伸5min.引物序列、产物长度如下所示.actin：正义链5CC

6、TGTACGCCAACACAGTGC3, 反义链5ATACTCCTGCTTGCTGATCC3, 211bp；AT1：正义链5CAGCCGTCATCTACCGAAAC3, 反义链5AGGAAAGGGAACACGAAGC3,142bp；AT2：正义链5ATCTGGCTGTGGCTGACTT3,反义链5AGCATATTTCTCAGGTGGG3, 362bp.以actin作为内参照, 用二者凝胶成像后的灰度值与actin相比, 代表其相对表达水平.统计学处理：数据以xs表示, GraphPadPrism统计软件分析, 不同时间点的LV/BW, LVTDM, AT1和AT2mRNA的表达变化分析采用双因

7、素方差分析, 各组间相互比较采用t检验, P2结果2.1左心室质量/体质量及心肌细胞横径大鼠腹主动脉缩窄术后4, 8, 12wk时LV/BW, LVTDM与其同时点假手术组相比均显著增高(P2.2RTPCR与假手术组相比, 随着大鼠心肌肥厚程度的加重, AT1与AT2mRNA的表达水平于术后4wk起逐渐升高, 8wk时继续升高.12wk组AT1mRNA的表达水平(0.5050.059)与8wk组(0.4680.094)比较虽有升高的趋势, 但无统计学意义；而AT2mRNA的表达水平从0.4380.088进一步升高至0.5800.066, 差异有显著性.各时段假手术组心肌细胞中AT1与AT2mR

8、NA的表达水平均无明显变化（P0.05, 图1,2).3讨论目前的资料表明, AT2受体的作用较为复杂有时甚至是相互矛盾的.研究结果提示AT2在细胞和组织中的作用与当时的特定环境密切相关5.因此, 分离并观察压力超负荷性肥大心肌细胞AT1与AT2表达的动态变化, 对于研究其在压力超负荷性心肌肥大过程中的作用是非常必要的.有关资料显示：正常成年大鼠心肌细胞AT2处于较低水平, 心肌肥厚时AT2表达增加, AT1表达增加或降低的幅度趋缓6；心肌梗死后AT2与AT1(主要是AT1)均明显上调7.我们的结果表明：正常情况下, 成年大鼠心肌细胞上AT1与AT2mRNA均处于较低水平.随着大鼠心肌肥厚程度

9、的加重, AT1mRNA的表达水平于术后4wk起逐渐升高.术后8wk明显升高, 在12wk继续保持较高水平, 但8wk组与12wk组相比无统计学差异.但AT2的表达水平从4wk起升高, 8wk时继续升高, 而12wk时进一步升高.结合此阶段大鼠心肌细胞的病理改变主要以肥大为主, 提示此时AngII可通过细胞膜上表达逐渐上调的AT1促进细胞的重塑.与表达上调并逐渐达到顶峰的AT1相比, AT2的上调幅度较大并有继续增高的趋势.但此时AT2受体将发挥何种作用, 目前尚无定论.有研究表明AT2对肥大的心肌细胞具有保护作用.心肌梗死后, 阻断AT1的同时活化的AT2在AT1阻断剂的治疗过程中发挥着重要

10、作用, 这表明AT1阻断剂的作用部分是由活化的AT2介导的8；在成年肥大的大鼠心脏中, 抑制AT2将使左室对AngII的促生长作用更为敏感9；而过度表达AT2将有助于保护心肌梗死重塑过程中转基因小鼠的左室功能10.但也有实验证实AT2对心功能也可有不利影响11-12,从而引起不断进展的泵功能衰竭、心律失常及心脏重塑.有关AT2在压力超负荷性肥大心肌细胞中的作用, 我们的初步研究结果表明：在肥大心肌细胞中, AngII通过AT2的介导促进TNF和IL1的生成及释放, 说明AT2与心肌重构过程中炎症的发生有关, 而这可以进一步引起心功能的失常和心衰的发生.总之, 我们的结果表明：压力超负荷性心肌细

11、胞的肥大过程伴随着细胞表面AT1与AT2表达的动态变化.AT2受体表达程度的增加可能与随后的心肌改建及心力衰竭的发生有关.【参考文献】1RegitzZagrosekV,FielitzJ,FleckE.MyocardialangiotensinreceptorsinhumanheartsJ.BasicResCardiol,1998,93(Suppl2):37-42.2WuL,IwaiM,NakagamiH,etal.EffectofangiotensinIItype1receptorblockadeoncardiacremodelinginangiotensinIItype2receptornu

12、llmiceJ.ArteriosclerThrombVascBiol,2002,22(1):49-54.3CareyRM,WangZQ,SiragyHM.Roleoftheangiotensintype2receptorintheregulationofbloodpressureandrenalfunctionJ.Hypertension,2000,35(1Pt2):155-163.4李予蓉,商立军,范风云.成熟心肌细胞的分离与培养方法J.第四军医大学学报,2000,21(6):s153.5SchneiderMD,LorellBH.AT2,judgmentday:Whichangiotensi

13、nreceptoristheculpritincardiachypertrophyJ.Circulation,2001,104:247-248.6OlivieroP,ChassagneC,KolarF,etal.EffectofpressureoverloadonangiotensinreceptorexpressionintheratheartduringearlypostnatallifeJ.JMolCellCardiol,2000,32(9):1631-1645.7ZhuYZ,ZhuYC,LiJ,etal.Effectsoflosartanonhaemodynamicparameters

14、andangiotensinreceptormRNAlevelsinratheartaftermyocardialinfarctionJ.JReninAngiotensinAldosteroneSyst,2000,1(3):257-262.8XuJ,CarreteroOA,LiuYH,etal.RoleofAT2receptorsinthecardioprotectiveeffectofAT1antagonistsinmiceJ.Hypertension,2002,40(3):244-250.9BartunekJ,WeinbergEO,TajimaM,etal.AngiotensinIItyp

15、e2receptorblockadeamplifiestheearlysignalsofcardiacgrowthresponsetoangiotensinIIinhypertrophiedheartsJ.Circulation,1999,99(1):22-25.10YangZ,BoveCM,FrenchBA,etal.AngiotensinIItype2receptoroverexpressionpreservesleftventricularfunctionaftermyocardialinfarctionJ.Circulation,2002,106(1):106-111.11YanX,PriceRL,NakayamaM,etal.VentricularspecificexpressionofangiotensinIItype2receptorscausesdilatedcardiomyopathyandheartfailurein