基因工程：第三章 基因工程载体

1、第三章 基因工程载体,1 概述 2 克隆载体 3 大肠杆菌表达载体,第一节 概述,载体（vector）是指将外源DNA或基因携带进入宿主细胞进行扩增或表达的工具。 按功能:克隆载体和表达载体，表达载体又分胞内表达和分泌表达载体。 克隆载体（cloning vector）：主要是对目的基因克隆，建立DNA文库和cDNA文库，其上有复制子即可； 表达载体（expression vector）：能使目的基因在宿主细胞中表达的一类载体。这类载体既有复制子，更要有强启动子；,按工作方式:质粒载体、噬菌体载体、粘粒载体、人工染色体载体等。 按受体细胞:原核细胞载体和真核细胞载体。,载体的功能 运送外源基因

2、高效转入受体细胞。 为外源基因提供复制能力或整合能力。 为外源基因的扩增或表达提供必要的条件。,第二节克隆载体,克隆载体(cloning vector)：是指用于扩增或保存外源DNA片段而设计的载体。 克隆载体的结构特征,克隆载体具备的条件,载体都能携带外源DNA片段(基因)进入受体细胞，或停留在细胞质中自我复制，或整合到染色体DNA上，随着染色体DNA的复制而同步复制。 载体都具有供外源基因插入的限制性核酸内切酶位点，即多克隆位点。 载体都具有合适的遗传标记基因。 载体都必须是安全的，不应含有对受体细胞有害的基因，并且不会任意转入除受体细胞以外的其他生物细胞，尤其是人的细胞。,载体本身的分子

3、量都比较小，可容纳较大的外源基因片段。 载体在细胞内的拷贝数要高，方便外源基因在细胞内大量扩增。 载体在细胞内稳定性要高，保证重组体稳定传代而不易丢失。 载体的特征都是充分掌握的，包括它的全部核苷酸序列。,一、质粒载体,质粒载体是以质粒DNA分子为基础构建而成的克隆载体,主要用于原核生物和动植物的基因转移以及建立基因文库和cDNA文库。,1.质粒(plasmid )的概念： 独立于染色体外能够进行自我复制的双链DNA分子。 天然DNA质粒具有3种构型：共价闭合环状(cccDNA)、开环(ocDNA)和线性(lDNA)构型。,Plasmid chromosome,ccc,2.质粒的生物学特性,(

4、1)质粒DNA分子可以持续稳定地处于染色体外地游离状态,但在一定地条件下又会可逆地整合到寄主染色体上,随着染色体地复制而复制。 (2)质粒DNA在添加真核复制信号和启动子后,可以构建出能在原核和真核细胞中均可复制的穿梭质粒，并在真核细胞中表达，因此这类载体在基因工程中应用广泛。,(3)质粒的拷贝数:是指每个宿主细胞内质粒的数量。根据每个宿主细胞中质粒拷贝数的多少，把质粒分为严紧型复制质粒(拷贝数少，为1-5个)与松弛型复制质粒(拷贝数多，可达10-200个拷贝)。因此，作为载体的质粒应该是松弛型的。 (4)质粒的不相容性(incompatibility,又称质粒的不亲和性)：两种不同质粒，不能

5、够在同一个寄主细胞系中稳定共存的现象。(亲缘关系密切的,野生型和其衍生质粒。),3.质粒载体的发展概况,第一阶段（1977年前）：天然质粒和重组质粒的利用，如pSC101, colE1, pCR, pBR313和pBR322。 第二阶段：增大载体容量(降低载体长度)，建立多克隆位点区和新的遗传标记基因,如pUC系列载体。 第三阶段：完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同要求，如M13mp系列载体，含T3，T7，sp6启动子载体，表达型载体及各种探针型载体。,4.标记基因,标记基因按其用途分为2类： 选择标记基因:用于鉴别目的载体的存在，将成功转化了载体的宿主挑选出来。 筛选标记基因:用于区别重

6、组质粒与非重组质粒，可将携带了外源DNA片段的重组质粒挑选出来。,4.1 选择标记基因,4.2 筛选标记基因,(1)-互补(-complementation) 是指-半乳糖苷酶基因(LacZ)上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的LacZ基因的突变体之间实现互补，从而产生具有-半乳糖苷酶学活性的蛋白，这种现象就称为-互补。,(2)插入失活(insertional inactivation) 在质粒pBR322的抗四环素基因上插入一个外源基因后，导致抗四环素基因失活，变成只对氨苄青霉素有抗性，这样就可通过对抗生素是双抗还是单抗来筛选是否有外源基因片段插入到载体中，这种筛选方法称

7、为插入失活。,抗药性标记选择(插入失活法),5 常用质粒克隆载体,5.1 pSC101质粒载体 一种严谨型复制控制的低拷贝数的大肠杆菌质粒载体。平均每个寄主细胞仅有12个拷贝；分子量9.09kb，编码有一个四环素抗性基因（tetr ）。有Hind 、EcoR、BamH 、Sal 、Xho 、Pvu、Sma 7种核酸内切限制酶。其中在Hind 、 BamH 、 Sal 3个位点克隆外源DNA，都会导致tetr 基因失活。 是第一个真核生物的克隆载体。,pBR322为4.36kb的环状双链DNA，其碱基序列已经全部清楚。是最早应用于基因工程的载体之一。把pBR322用限制性内切酶切去某片段，换上合

8、用的表达组件，就可以构建成工作所需的新载体。许多实用的质粒载体都是在pBR322的基础上改建而成。可见其原型质粒在使用上有优点。,5.2 pBR322,“pBR322”这个名字符合载体命名法的标准规则： “P”表示是一种质粒； “BR”表示最初构建它的实验室(BR代表了两个构建人的名字：Bolivar和Rodriguez) “322把该质粒和该实验室构建的其他质粒区分开来(另外还有pBR325，pBR327，pBR328,pBR322的结构来源,pBR322质粒载体的优点： (1)、具有较小的分子量； 它的分子量为4363bp。意味着可以很容易纯化质粒本身及其所携带的重组DNA分子。即使添加上

9、6kb的DNA链，重组的pBR322的大小仍在可操作的范围内(10kb)。 (2)、具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号。 pBR322 DNA分子中总共有24种核酸内切酶只具有单一的酶切识别位点。其中7种内切酶的识别位点在四环素抗性基因内部，2种识别位点在于这个基因的启动区内，所以9个限制酶切位点插入外源片断可以导致tetr 基因的失活；另外有3种限制酶在氨苄青霉素抗性基因有单一的识别位点，,pBR322,Amp,Tet,插入片段,Amp平板,Tet平板,抗药性标志的选择,(3)、具有较高的拷贝数。 通常在被转化过的大肠杆菌中有大约15个pBR322质粒分子；而且经过蛋白质合成抑制剂

10、（氯霉素扩增）之后每个细胞中可积累10003000个拷贝，这样，通过培养大肠杆菌就可以获得大量重组过的pBR 322质粒分子。,5.3 pUC质粒系列,pUC质粒在pBR322基础上改建的，其组成如下： 含有pBR322完整的Ampr基因和复制起始点。 含有大肠杆菌-半乳糖酶基因(lacZ)的启动子及其编码-肽链的DNA序列，即lacZ基因。 在lacZ基因中靠近5端的一段有MCS区段，但并不破坏该基因的功能。,pUC质粒载体的优点： 具有较小的相对分子质量和更高的拷贝数，平均每个细胞可达500-700个拷贝。 适用于组织化学方法检测重组体,有来自大肠杆菌lac操纵子的lacZ基因，所编码的-

11、肽链可参与-互补作用，在IPTG诱导和底物X-gal存在下，形成蓝色和白色菌落筛选重组体。 具有MCS区段，便于具有不同粘性末端的外源基因的插入。,5.4 T-载体,6 质粒克隆载体的用途,用于保存和扩增片段小于2kb的目的基因。 构建基因组文库和cDNA文库。 可用于目的基因的测序。 作为核酸杂交时探针的来源。,二、 噬菌体载体,噬菌体的研究历史，是同分子生物学、分子遗传学的创立和发展过程密切相关的。DNA复制机理的阐明、转录的终止作用、连接酶和解旋酶的发现、位点特异的重组作用、SOS修复机制等，均是以噬菌体为材料取得的重要研究成果。依据噬菌体的复制和生活周期等特点，已经构建了许多噬菌体载体

12、，并广泛用于基因克隆、基因文库的构建等，是基因工程中不可缺少的实验材料。,噬菌体是比细菌还小得多的微生物，和病毒侵犯真核细胞一样，噬菌体侵犯细菌，也可以认为它是细菌里的“寄生虫”。它本身是一种核蛋白，核心是一段DNA，结构上有一个蛋白质外壳和尾巴，尾巴上的微丝可以把噬菌体的DNA注入细菌内。,噬菌体侵犯细菌时，只是DNA侵入，然后利用细菌的酶来复制、转录、翻译。入侵E.coli后，可以按裂解或建立溶原两种生活方式生存和繁殖。 噬菌体在宿主内进行独立复制，在1个菌体内生长出100个左右的新噬菌体，并冲破（杀死）细菌释放出来，再度感染其它活菌，称为裂解。 噬菌体侵入菌体后，把自身DNA加进细菌DN

13、A里（整合），作为细菌基因的一部分，随菌的细胞分裂而增殖，这种生活状态称为溶原。,噬菌体的生活周期： 裂解侵入细菌-独立复制-裂解（冲破细胞膜）-再感染其他细菌。,噬菌体的生活周期：,噬菌体整个基因组分3部分: 左臂：从A到J长约20kb，其中的基因编码构成头部、尾部、尾丝对组装完整噬菌体所需要的蛋白质。 中段：长约20kb,是DNA整合和切出,溶原生长所需序列。 右臂：长约10kb,是调控区，控制溶菌和溶原生长最重要的调控基因和序列、以及DNA复制起始均在这区域内。 左右臂包含DNA复制、噬菌体结构蛋白合成、组装成熟噬菌体、溶菌生长所需全部序列；对溶菌生长来说，中段是非必需的。这一区段的缺失

14、，或在此区段中插入外源DNA，并不影响噬菌体的增殖，这就是噬菌体可作为基因载体的依据 。,噬菌体DNA的两个5末端为12bp的单链，两端序列互补成为天然的“粘性末端”。噬菌体DNA进入宿主菌体后，通过两个末端互补结合而形成粘性末端位点（cohesive end site，即粘性末端位点之意,简称cos位点）整个DNA分子环化。,5-CGGGGCGGCGACCTCG-3 3-GCCCCGCCGCTGGAGC-5 Cleavage Ligation (during packaging) (after infection) GGGCGGGCGACCTCG-3 5-CG + GC-5 3-GCCCCG

15、CCGCTGGA,The phage cos ends,Circular form,Linear form,1 -DNA载体的构建 1.1 缩短长度 野生型-DNA包装的上限为51kb，本身长度为48.5kb，只有当插入的外源DNA片段不大于2.5kb时，才能被包装成有感染力的噬菌体颗粒。因此缩短野生型-DNA的长度，可以提高装载量。其实野生型-DNA上约有40-50%的片段是复制和裂解所非必需的。,1.2 删除重复的酶切位点,野生型的-DNA链上有5个EcoRI位点和7个HindIII位点，不利于重组操作，必须删除至1 - 2个；同时，为了便于各种来源的DNA片段的克隆，还需要增加一些单一的

16、酶切位点；除了简单的切割外，还需要采用定点突变技术去除或增添酶位点。,1.3 加装选择标记,与质粒不同，野生型-DNA上缺少合适的选择标记，因此加装选择标记是-DNA克隆载体构建的重要内容 -DNA克隆载体上的选择标记主要有下列两类： 免疫功能类标记 颜色反应类标记,(1)加装选择标记imm434,imm434基因编码一种阻止-噬菌体进入溶菌循环的阻遏物。含有完整标记基因的-载体进入受体细胞后，建立溶原状态，细菌生长缓慢，形成浑浊斑；当外源DNA插入到标记基因中，基因灭活，-重组分子便进入溶菌循环，形成透明斑。,(2)加装选择标记lacZ,lacZ基因编码-半乳糖苷酶，能催化无色的X-gal生

17、成蓝色化合物。当外源基因插入到lacZ基因中，基因灭活，不能合成蓝色化合物；而空载体-DNA则产生蓝色透明斑。,1.4 构建琥珀密码子的突变体,琥珀型突变（sup)是指由CAG（Gln）向UAG（stop）的突变。 大肠杆菌的某些菌株含有特异性的校正基因，其编码产物校正tRNA能专一性地纠正这一突变。将野生型-DNA上D和E两个头部包装蛋白的基因中的CAG密码子突变成UAG。当这种-DNA进入一般的大肠杆菌菌株后，不能合成有活性的头部蛋白，也就不能被包装和裂解细菌，这样就可以阻止有害重组体的生物污染及扩散，而基因工程实验中使用的受体则是具有琥珀型突变体校正功能的菌株。,1.5 -DNA重组分子

18、的体外包装,-DNA重组分子需在体外人工包装成有感染力的噬菌体重组颗粒，方可高效导入受体细胞。以感染方式导入细胞的频率可达106108/gDNA，而以转染（translation）的方式导入的频率仅为103105/ gDNA。 用于体外包装的蛋白质可直接从感染了噬菌体的大肠杆菌中提取，现已商品化。这些包装蛋白通常分为相互互补的两部分：一部分缺少E组份，另一部分则缺少D组份。包装时，只有这两部分包装蛋白与重组-DNA分子混合后，包装才能有效进行，任何一种蛋白包装液被重组-DNA污染后，均不能被包装成有感染力的噬菌体颗粒，这也是基于安全而设计的。,1.6 -DNA及其重组分子的分离纯化,将大肠杆菌

19、在含有麦芽糖的培养基中培养至对数生长期 加入噬菌体或重组噬菌体的悬浮液，37培养1小时 用新鲜培养基稀释，继续培养4 -12小时。这时噬菌体颗粒密度已达1013 -1014 / L，大肠杆菌细胞已完全裂解 超速离心，沉淀噬菌体 苯酚抽提，释放-DNA 乙醇或异丙醇沉淀-DNA,2 -DNA载体的主要类型：,插入型载体（insertion vector）: 通过特定的酶切位点允许外源DNA片段插入的载体。 Charon2、Charon6、gt11 置换型载体(replacement vector,又称取代型载体):允许外源DNA片段替换非必需DNA片段的载体。 EMBL4、gem-11、Char

20、on40,3 -DNA作为载体的优点,-DNA可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌 -DNA载体的装载能力为25 kb，远远大于质粒的装载量 重组-DNA分子的筛选较为方便 重组-DNA分子的提取较为简便 -DNA载体适合克隆和扩增外源DNA片段，但不适合表达外源基因,三、人工染色体载体,人工染色体载体（artificial chromosome vector）:利用染色体的复制元件来驱动外源DNA片段复制的载体。 实际上是一种“穿梭”克隆载体，含有质粒克隆载体所必备的第一受体(大肠杆菌)源质粒复制起始位点(ori)，还含有第二受体(如酵母菌)染色体DNA着丝点、端粒和复制起始位点的序

21、列，以及合适的选择标记基因。,这样的克隆载体在第一受体细胞内可以按质粒复制形式进入高拷贝复制。这种克隆载体在体外与目的DNA片段重组后，转化第二受体细胞，可在转化的细胞内按染色体DNA复制的形式进行复制和传递。 筛选第一受体的克隆子，一般采用抗菌素抗性选择标记；而筛选第二受体的克隆子，常用与受体互补的营养缺陷型。与其他的克隆载体相比，人工染色体克隆载体的特点是能容纳长达1000kb甚至3000kb的外源DNA片段。,1.酵母人造染色体(Yeast Artificial Chromosomes YAC),YAC载体应含有下列元件： 酵母染色体的端粒序列 酵母染色体的复制子 酵母染色体的中心粒序列

22、 酵母系统的选择标记 大肠杆菌的复制子 大肠杆菌的选择标记 YAC载体的装载量为350 - 400 kb,2.细菌人造染色体(Bacterial Artificial Chromosomes BAC),细菌人造染色体通常是在大肠杆菌性因子F质粒的基础上构建的，其装载量范围在50 - 300 kb之间各种类型的pBACs在大肠杆菌受体菌只能维持单一拷贝,BACs主要适用于： 克隆大型基因簇（gene cluster）结构 构建动植物基因文库,第三节 大肠杆菌表达载体,表达载体(expression vector)： 在克隆载体基础上，为使插入的外源DNA片段有效转录翻译成多肽，装有强化外源基因表达的强启动子以及利于表达产物分泌、分离和纯化的元件，这种载体称为表达载体。,原核表达载体 1. 原核表达载体所需的主要元件 (1) 启动子；(2) SD顺序; (3) 筛选标记；(4) 其它调控基因 (5) 终止子 (6) 复制原点 (7)MCS,2. 原核表达载体的类型 (1) 融合型表达载体表达出融合蛋白； (2) 非融合型表达载体表达出完整蛋白； (3) 分泌型表达载体表达产物可跨膜分泌到胞间隙。,(1)、融合表达载体,融合基因(fusion gene):是指应用DNA体外重组技术,构建的一类