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文档简介
1、硝酸还原酶活力的测定1、 试剂:(1)亚硝态氮标准溶液称取1 g分析纯NaNO2溶于无离子水并定容至1000mL,然后再吸取1mL定容至1000mL,即为1g/mL亚硝态氮的标准液。(2)0.1mol/L pH 7.5的磷酸缓冲液称取30.0905 g Na2HPO412H2O与2.4965 g NaH2PO42H2O,加无离子水溶解后定容至1000mL。(3)10 g/L磺胺溶液称取1.00 g磺胺溶于100mL 3mol/L HCl中(取25mL浓盐酸加无离子水定容至100mL,即为3mol/L HCl)。(4)0.2 g/L萘基乙烯胺溶液称取0.0200 g 萘基乙烯胺溶于100mL无离
2、子水中,贮于棕色瓶中。(5)0.1mol/L KNO3溶液称取2.5275 g KNO3 溶于250mL 0.1mol/L pH 7.5的磷酸缓冲液。(6)0.025mol/L pH 8.7的磷酸缓冲液称取8.864 g Na2HPO412H2O和0.057 g K2HPO43H2O,溶于1000mL无离子水中。(7)提取缓冲液称取0.1211 g半胱氨酸和0.0372 gEDTA,溶于100mL 0.025mol/L pH 8.7的磷酸缓冲液。(8)2 mg/mL NADH溶液称取2 mg NADH溶于1mL 0.1mol/L pH7.5的磷酸缓冲液(临用前配制)。2 实验步骤(1) 标准曲
3、线制作取7支15mL干净的试管按表1顺序加入试剂,配成每管含02.0g亚硝态氮的系列标准溶液,摇匀后在25下保温30 min,然后在540nm下比色测定,以每管中亚硝态氮的量(g)为横坐标(x),吸光度值(y)为纵坐标绘制标准曲线或建立回归方程。试剂管号1234567亚硝酸钠标准液/mL00.20.40.81.21.62.0蒸馏水/mL2.01.81.61.20.80.40.010g/L磺胺/mL44444440.2g/L萘基乙烯胺/mL4444444每管含亚硝态氮量/g00.20.40.81.21.62.0(2) 硝酸还原酶活力测定1. 酶液提取取10mL藻液,在4500r/min离心15分
4、钟,去掉上清液,加4mL酶提取液,超声波破碎10min,4,4000r/min离心15min,上清液即为粗酶提取液2. 酶反应 取粗酶液0.4mL加入10mL试管中,再加入1.2mL 0.1mol/L KNO3磷酸缓冲液和0.4mL NADH溶液,在25水浴中准确保温30 min。在对照管中不加NADH溶液,而以0.4mL 0.1mol/L pH 7.5的磷酸缓冲液代替。保温结束后立即加入1mL磺胺溶液终止酶反应。3. 显色与测定在各管中加入1mL萘基乙烯胺溶液,显色15 min后于4000 r/min下离心5min,取上清液在540nm下比色测定。根据从标准曲线查得的或由回归方程计算出反应液中所产生的亚硝态氮量(g),计算样品硝酸还原酶活力。3 结果处理及计算样品硝酸还原酶活力g/(gh)=X为反应液中酶催化产生的亚硝态氮量(
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