课题3　血红蛋白的提取和分离 (8).ppt

课题背景,蛋白质是生命活动不可缺少的物质。随着人类基因组计划的进展以及多种生物基因组测序工作的完成，人类跨入了后基因组和蛋白质组时代。对蛋白质的研究与应用，首先需要获得纯度较高的蛋白质。,因此，从复杂的细胞混合物中提取、分离高纯度的蛋白质是生物科学研究中经常要做的工作。,(一)蛋白质分离的原理：,根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同种类的蛋白质。,一、基础知识,（二）凝胶色谱法,2.凝胶：,大多数凝胶是由多糖类化合物（如葡聚糖或琼脂糖）构成的多孔小球体，内部有许多贯穿的通道。,根据被分离物质的蛋白质相对分子质量的大小，利用具有网状结构凝胶的分子筛作用，来进行分离蛋白质的有效方法。,1.概念：,（分配色谱法）,小蛋白质,大蛋白质,混合物上柱,洗脱,大分子流动快小分子流动慢,收集大分子,收集小分子,3.凝胶色谱法分离蛋白质的具体过程,4.凝胶色谱法的原理,相对分子量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢;相对分子量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。,进行体外实验时，如何保证蛋白质不会发生变性呢？,（三）缓冲溶液,抵制外界的酸和碱对溶液PH值的影响，维持PH基本不变。,1.作用:,2.缓冲溶液的配制:,通常由12种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同PH范围内使用的缓冲液。,3.在本课题中使用的缓冲液是:磷酸缓冲液,成分：磷酸二氢钠与磷酸氢二钠,如何鉴定凝胶色谱法分离得到的蛋白质是目的蛋白？,（四）电泳：,1.概念：,带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。,2.原理：,许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团会带上正电或负电。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。,3.类型:,琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳。,在凝胶中加入SDS，使蛋白质解聚成单链，与各种蛋白质形成蛋白质SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别使其迁移速度完全取决于分子的大小,由于琼脂糖本身不带电荷，各种分子在电场中迁移速度决定于所带电荷性质的差异及分子的大小、形状的不同,琼脂糖凝胶电泳,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（测定蛋白质的分子量）,3.类型:,聚丙烯酰胺凝胶电泳,在测定蛋白质分子量时常用十二烷基硫酸钠（SDS）聚丙烯酰胺凝胶电泳。聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂N,N-亚甲基双丙烯酰胺在引发剂和催化剂的作用下聚合交联成的具有三维网状结构的凝胶。,N,N-亚甲基双丙烯酰胺（形成交联）,丙烯酰胺和交联剂N,N-亚甲基双丙烯酰胺的交联共聚反应,蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。,1.原理：,SDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是单条肽链的分子量。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。,2.SDS作用机理:,用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量的方法,使用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量时，可选用一组已知分子量的标准蛋白同时进行电泳，根据已知分子量的标准蛋白的电泳区带位置，可以测定未知蛋白质的分子量。市场上有高分子量、次高分子量及低分子量的标准蛋白试剂出售。,二、实验操作,样品处理粗分离纯化纯度鉴定,蛋白质提取和分离步骤,血液有哪些成分？,（一）血红蛋白,每个肽链环绕一个亚铁血红素基团，此基团可携带一分子氧或一分子二氧化碳，血红蛋白因含有血红素而呈红色。,血红蛋白的特点：,血液100mL,重复洗涤3次，直至上清液没有黄色,(1)红细胞的洗涤:,1.样品处理及粗分离,目的？,注意：速度越高和时间越长，会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀，达不到分离的效果！,（二）操作过程,(2)血红蛋白的释放：加蒸馏水到原血液体积，再加40体积的甲苯，置于磁力搅拌器上充分搅拌10分钟（加速细胞破裂）,细胞破裂释放出血红蛋白。,(3)分离血红蛋白溶液：,过程：将搅拌好混合液转移到离心管内，以2000r/min的速度离心10min。试管中溶液层次：第1层（最上层）：甲苯层（无色透明）；第2层（中上层）：脂溶性物质沉淀层（白色）；第3层（中下层）：血红蛋白的水溶液层（红色)；第4层（最下层）：杂质沉淀层（暗红色）。分离：用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。,(4)透析：,过程：取1ml的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol/l的磷酸缓冲液中（pH为7.0），透析12小时。透析目的：除去样品中分子量较小的杂质。,1.凝胶色谱柱的制作,2.凝胶色谱柱的装填,3.样品的加入和洗脱,1.凝胶色谱柱的制作,打孔挖穴安管覆网纱包插管,2.纯化-凝胶色谱操作:,2.凝胶色谱柱的装填,50cm高,固定色谱柱配凝胶悬液装填色谱柱洗涤平衡,沸水浴加热,紧密不得有气泡,磷酸缓冲液(pH为7.0）,不能流干，避免露出凝胶颗粒,3.样品的加入和洗脱,1.调液面,2.加样3.再调液面,4.洗脱,5.收集,2.凝胶色谱操作:,（1）凝胶色谱柱的制作：,取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。底塞的制作：打孔挖出凹穴安装移液管头部覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端。注意事项：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。顶塞的制作：打孔安装玻璃管。组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体。安装其他附属结构。,（2）凝胶色谱柱的装填,凝胶的选择：A、材料：交联葡聚糖凝胶（G-75）。B、代表意义：“G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围。75表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5克。凝胶的前处理：配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。,凝胶色谱柱的装填方法：A、固定：将色谱柱装置固定在支架上。B、装填：将凝胶悬浮液一次性缓慢倒入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。注意：1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。2、装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。,（2）凝胶色谱柱的装填,洗涤平衡：装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在50cm高的操作压下，用300ml的20mmol/l的磷酸缓冲液（pH为7.0）充分洗涤平衡12小时。注意：1、液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。2、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。,50cm高,（2）凝胶色谱柱的装填,（3）样品加入与洗脱,调节缓冲液面：打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。滴加透析样品：吸管吸1ml样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。,注意：正确的加样操作是：1、不要触及并破坏凝胶面。2、贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁环绕移动。,样品渗入凝胶床：加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口洗脱：小心加入pH=7.0的20mmol/l的磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5ml收集一试管，连续收集。（在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）,（三）纯度鉴定：SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（选做）,鉴定血红蛋白纯度。,1.目的：,红色区带均匀一致地移动。,1.红细胞的洗涤：,洗涤次数不能过少；低速、短时离心。,3.色谱柱的装填：,装填尽量紧密，降低颗粒间隙；无气泡；洗脱液不能断流。,2.凝胶的预处理：,沸水浴法时间短，还能除去微生物和气泡。,4.色谱柱成功标志：,1.血液样品的处理,分层明显样品处理完成,2.凝胶色谱柱的装填,放一支与凝胶柱垂直的日光灯直接检查加入大分子有色物质如蓝色葡聚糖2000或红色葡聚糖，若色带均匀、狭窄、平整装填成功。,3.血红蛋白的分离,血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随洗脱液缓慢流出，分离成功。,四、结果分析与评价,三、操作提示,1.样品的处理及粗分离通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、分离血红蛋白溶液、透析等操作收集到血红蛋白溶液2.样品的纯化通过凝胶色谱法将相对分子质量较大的杂质蛋白除去3.纯度鉴定聚丙烯酰胺凝胶电泳,小结：你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？,血红蛋白的提取和分离,【课堂小结】,教学反馈,1凝胶色谱法是根据（）分离蛋白质的有效方法。A分子的大小B相对分子质量的大小C带电荷的多少D溶解度2缓冲液的作用是：在一定范围内，抵制外界的影响来维持（）基本不变。A温度BpHC渗透压D氧气浓度3电泳是指带电粒子在电场的作用下向着与其所带电荷（）的电极移动。A相同B相反C相对D相向4.哺乳动物和人的成熟的红细胞中的（）与氧气的运输有关。A血红蛋白B肌红蛋白C肌动蛋白D肌球蛋白,B,B,B,A,5血液由血浆和各种血细胞组成，其中（）的含量最多。A白细胞B血小板C红细胞D淋巴细胞6为防止血液凝固，在采血容器中要预先加入抗凝血剂（）。A.