《动物细胞培养HXY》PPT课件

第四章动物细胞培养,1,动物的细胞和组织培养：从动物体内取出组织或细胞，模拟机体内生理条件，在体外建立无菌、适温和一定营养条件等，使之生长和生存，并维持其结构和功能的技术。,2,4.1培养细胞的生物学特征,4.1.1体外培养细胞的分型按生长方式分为3型：贴壁型细胞:附着在某一固相支持物表面才能生长的细胞。悬浮型细胞:不必附着于固相支持物表面，在悬浮状态下即可生长的细胞。半贴壁型细胞,3,（一）贴附型细胞：大多数培养细胞贴附生长，属于贴壁依赖性细胞贴附:是大多数有机体细胞在体内生存和生长发育的基本存在方式结果:基于贴附特性，使细胞与细胞之间相互结合形成组织，有机体的绝大多数细胞必须贴附于一固相表面才能生存和生长。培养时：这些细胞被放到体外环境中以后,同样需要贴附于某一固相表面才能生存和生长，因而属于贴附型细胞贴附(锚定或锚着)依赖型(性)细胞,细胞在体内、外的贴附方式存在差异体内：贴附是全方位,外形具有复杂的立体特征体外：多数情况，细胞只有一个附着平面，外形一般与体内时明显不同贴附的固相表面：玻璃、聚苯乙烯塑料按照培养细胞的主要形态，可分为四大类型,1、成纤维细胞型：,名称：成纤维细胞来源：由中胚层间充质组织起源的组织真正的成纤维细胞：心肌，平滑肌，成骨细胞，血管内皮形态：似体内成纤维细胞的形态，胞体梭形或不规则三角形，胞质向外伸出23个长短不等的突起，中有卵圆形核生长特点：排列成放射状，漩涡状，并不紧靠连成片，细胞-细胞接触易断开而单独行动，游离的单独的成纤维样细胞，常有几个伸长的细胞突起,2、上皮细胞型,名称：仅形态上似体内，实际上不完全相同来源：来源于外胚层、内胚层细胞,如：皮肤及其衍生物,消化道，乳腺，肺泡,上皮性肿瘤形态：类似体内的上皮细胞，扁平，不规则多角形，中有圆形核生长特点：易相连成片，相靠紧密相连成薄层铺石状生长时呈膜状移动，很少脱离细胞群而单个活动,3、游走细胞型：呈散在生长，一般不连成片，胞质常突起，呈活跃游走或变形运动，方向不规则。此型细胞不稳定，有时难以和其他细胞相区别。4、多形型细胞：有一些细胞，如神经细胞难以确定其规律和稳定的形态，可统归于此类。,（二）悬浮型细胞：见于少数特殊的细胞，如某些类型的癌细胞及白血病细胞。胞体圆形，不贴于支持物上，呈悬浮生长。这类细胞容易大量繁殖。来源：血，脾或骨髓，血中白细胞癌肿细胞特点：在悬浮中生长良好，细胞圆形、单个或小细胞团优点：生存空间大，提供数量大，传代方便(不需消化)，易于收获，可获得稳定状态缺点：纯化不方便，不能通过离心将死、活细胞分离,4.1.2培养细胞的生长特点1.贴附贴壁伸展影响因素：钙离子机械、物理因素生物因素,13,细胞贴壁过程,15,2.接触抑制细胞接触停止移动正常细胞成单层生长肿瘤细胞无接触抑制，可以堆积生长。接触抑制可作为区分正常细胞与癌细胞的标志之一,16,3.密度抑制细胞增殖，密度加大，培养液营养成分消耗，细胞代谢物增多，导致发生密度抑制，细胞分裂停止,4.1.3培养细胞的生长和增殖过程,（一）单个细胞的生长过程（二）细胞系的生长过程（三）每代细胞的生长过程,（一）单个细胞的生长过程,细胞周期：一个母细胞分裂结束后形成的细胞到下一次再分裂结束形成两个子细胞的时期。,（二）细胞系的生长过程,培养细胞的生命期：是指细胞在培养中持续增殖和生长的时间。包括原代培养期、传代期及衰退期。,细胞的生长曲线,1原代培养期：从体内取出组织,接种培养到第一次传代阶段（初代培养）特点：1-4周、细胞呈活跃的移动、可见细胞分裂、形态结构和功能活动上与体内原组织相似性大、多呈二倍体核型细胞群是异质的，细胞克隆形成率很低，即细胞独立生存性差。,2传代期：初代培养细胞一经传代后便改称做细胞系。在全生命期中此期的持续时间最长。在培养条件较好情况下，细胞增殖旺盛，并能维持二倍体核型，呈二倍体核型的细胞称二倍体细胞系。为保持二倍体细胞性质，细胞应在初代培养期或传代后早期冻存。一般情况下当传代1050次左右，细胞增殖逐渐缓慢，以至完全停止，细胞进入第三期。,3衰退期：此期细胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；细胞形态轮廓增强，最后衰退凋亡。在细胞生命期阶段，少数情况下，在以上三期任何一点，由于某种因素的影响，细胞可能发生自发转化。转化的标志之一是细胞可能获得永生性或恶性性。,细胞永生性也称不死性，即细胞获持久性增殖能力，这样的细胞群体称无限细胞系，也称连续细胞系。无限细胞系的形成主要发生在第二期末，或第三期初阶段。细胞获不死性后，核型大多变成异倍体。细胞转化亦可用人工方法诱发，转化后的细胞也可能具有恶性性质。,（三）每代细胞的生长过程,所谓细胞的“一代”是指从细胞接种到分离再培养的一段时间。这已成为培养工作中的一种习惯说法，它与细胞倍增一代非同一含义。如某一细胞系为第153代细胞，即指该细胞系已传代153次。它与细胞世代或倍增不同；在细胞一代中，细胞能倍增36次。,细胞传一代后，一般要经过以下三个阶段：潜伏期指数生长期停止期,26,1潜伏期,游离:悬浮,胞质回缩,全部细胞变为圆球形吸附:贴附底物,一般24小时内贴壁潜伏:可有运动活动,基本无增殖,少见分裂相,2指数生长期：细胞增值最旺盛的阶段，细胞分裂相增多。细胞活力最旺盛的阶段，培养物中细胞数量呈指数增长,细胞群体均一，是理想的实验用细胞,接触抑制：细胞运动停止密度抑制：细胞终止分裂,3停止期：细胞数量达饱和密度后，细胞停止增殖，进入停止期，也称平台期。停滞期细胞虽不增殖，但仍有代谢活动，继而培养液中营养渐趋耗尽，代谢产物积累、pH降低。此时需做分离培养即传代，否则细胞会中毒，发生形态改变，重则从底物脱落死亡,潜伏期,指数生长期,停止期,4.1.4培养细胞的遗传学特征,（一）染色质与染色体：正常细胞：二倍体细胞发生转化：多倍体或异倍体（二）细胞性别女性：Barr小体男性：Y小体,4.1.5体内外细胞的差异及培养细胞的分化,经多次传代增殖后，培养细胞将失去原有的组织结构和细胞形态，分化逐渐减弱或不显。形态与功能逐渐单一化，细胞衰老或死亡，或发生转化，获得不死性或恶性性。,4.2细胞培养液,4.2.1细胞培养常用液体1.水三蒸水、纯水2.平衡盐溶液（BSS）由生理盐水发展而来，由无机盐和葡萄糖配制而成。可维持渗透压、调节pH值、供给细胞生存所需的能量和无机离子。主要用于合成培养基的基础液和洗涤组织、细胞等。Hanks液和Earle液是常用的BSS基础溶液。,33,34,3.消化液胰蛋白酶EDTA-Na溶液胶原酶4.消化酶抑制液：用于终止消化酶的作用血清大豆胰酶抑制剂,35,5.培养基pH调整液：常用的有：3.7、5.6、7.4的NaHCO3溶液和HEPES溶液（二羟乙基哌嗪乙烷磺酸）等。6.抗生素液：青霉素、链霉素、卡那霉素、庆大霉素7.谷氨酰胺补充液：谷氨酰胺在合成培养基中必须添加，它不稳定，需及时补充。,36,4.2.2培养基1.培养基的基本要求按照来源分：天然培养基合成培养基无血清培养基,37,1.天然培养基,天然培养基：直接取自动物体液或从组织中提取的天然成分作培养液，但成分复杂，来源有限。（1）血清：血浆去除纤维蛋白所得。营养丰富，其中溶有多种物质，如无机盐离子、蛋白质及氨基酸、糖类（如葡萄糖等）、脂类、激素、固醇、抗体、维生素等。血清由于营养丰富，且含有多种细胞生长因子、促贴附因子及其多活性物质，能使细胞顺利增殖生长，应用最广。缺点是组成复杂，使培养结果不稳定。常用新生犊牛血清和胎牛血清。,38,（2）胚胎提取液：鸡胚、牛胚提取液，能促进细胞生长。来源有限。不常用。（3）水解乳白蛋白：是乳白蛋白经蛋白酶和肽酶水解后的产物，含丰富氨基酸。用Hanks液配制成0.5%溶液，与合成培养基按比例混合使用。多用于细胞系和原代细胞的培养。（4）胶原：胶原是从动物真皮或大鼠尾腱中提取的，具改善细胞表面特性促使其附着生长的作用。,39,2.合成培养基,合成培养基是用化学物质人工模拟合成，种类相当多。合成培养基成分已知，便于对实验条件的控制。但与天然培养基相比，有些天然的未知成分尚无法用已知的化学成分所替代，因此，细胞培养中使用的基础合成培养基还必须加入一定量的天然培养基成分，以克服合成培养基的不足。最普遍的作法是加入小牛血清，称为完全培养基。基本培养基，如109培养液、DMEM、TC199、RPMI-1640、MEM培养液等。,40,合成培养基的组成：（1）氨基酸：氨基酸是细胞合成蛋白质的基本成分，12种必须氨基酸必须由培养液提供。需加一定量的谷氨酰胺。（2）维生素：包括水溶性和脂溶性两类。一般由血清供应。（3）无机离子：包括大量和微量无机离子，通常也可由血清提供。（4）碳源：以葡萄糖为主。（5）其他：嘌呤、嘧啶、辅酶及抗氧化剂等。,41,动物血清成分复杂，各种生物大小分子混合在一起，有些成分至今尚未明确，后期对培养产物的分离、提纯以及检测会造成一定困难。另外高质量的动物血清来源有限，成本高，限制了它的大量使用。,3.无血清培养基,42,无血清培养基不加动物血清，一般由基础培养液和替代血清的添加成分（细胞生长有效因子，激素等）两部分组成。可保证实验结果的准确性和稳定性。但成本较高，针对性较强，一种无血清培养基只适用于某一类细胞的培养。主要用于：研究细胞生长因子、单克隆抗体的制备、以及细胞分泌产物研究,43,（1）基础培养液根据不同培养细胞选择合适的合成培养基作为基础培养基。常用DMEM和F12以1：1比例混合作为基础培养基，用NaHCO3或HEPES溶液调整pH。,44,（2）补充成分激素和生长因子：激素有胰岛素、生长激素和多种生长因子如表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、增殖刺激因子、类胰岛素生长因子等。主要是刺激生长，维持细胞功能的作用。结合蛋白和转运蛋白：主要是转铁蛋白（增强细胞摄取培养基中铁的能力，可螯合痕量有害金属离子）和白蛋白（参与运载一些脂类、金属离子等，也有螯合过量微量元素的作用）两种蛋白。,45,贴壁和铺展因子：帮助细胞贴壁和铺展。如纤黏蛋白、血清铺展因子、胶原等。微量元素和低分子量营养因子：硒元素、丁二胺、亚油酸等。酶抑制剂：常用大豆胰酶抑制剂。,46,47,影响动物细胞培养的因素,（1）温度：哺乳动物最适温度36.50.5；对低温耐受性比高温强。（2）pH：7.27.4之间。低于6.8或高于7.6细胞生长受到影响，甚至死亡。偏酸性耐受较强，偏碱性很快死亡。（3）气体：O2；CO2，还可调节pH。（4）渗透压：不同细胞要求不同。,48,4.3细胞的基本培养技术,定义动物细胞培养：就是将动物组织或细胞从机体中取出，分散成单个细胞，给予必要的生长条件，模拟体内的生长环境，使其在体外继续生长和增殖的技术。体外培养可分为原代培养和传代培养。,49,动物细胞体外培养的特点:,大多数须附着在固体或半固体的表面才能生长。对于营养要求苛刻，除氨基酸、维生素、盐类、葡萄糖或半乳糖外，还需要血清。对培养环境极其敏感，包括pH、溶解氧、温度、剪切力等都需严格监控。生长缓慢，培养时间长，培养代价大污染问题难以控制。,动物细胞的培养过程,幼龄动物,取动物器官和组织,剪碎组织,胰蛋白酶处理,细胞培养,单个细胞,动物细胞培养技术是动物细胞工程技术的基础,转入培养液中进行原代培养,4.3.1原代培养原代培养：从机体取出后立即培养的细胞为原代细胞。特点：原代细胞刚刚离体，生物学特性未发生大变化，仍具有二倍体遗传特性，最接近和反应生物体内生长特性，是药物检测、细胞分化的很好实验工具。原代细胞通常由多种细胞组成（异质性），细胞独立生存性差,53,过程,组织取材,组织细胞的分离,培养,机械法,消化法,动物胚胎或幼龄动物的组织、器官,细胞悬液,胰蛋白酶,1代细胞,原代培养,传代培养,无限传代,单个细胞,加培养液,动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤维等蛋白质，将细胞网络起来形成具有一定弹性和韧性的组织和器官。,（分解弹性纤维）,（一）组织取材1.鸡胚组织：用于病毒与疫苗研究,56,2.鼠胚组织：与人最相近的哺乳动物组织，取材方便，易于培养。,57,机械法分离胚胎,3.皮肤和粘膜：多来源于手术，需严格消毒以消灭细菌霉菌。4.血细胞：静脉取血、指尖或耳垂取血。加肝素抗凝剂防止凝血。5.内脏和实体瘤：主要源于外科手术和活检组织。,59,60,（二）组织细胞的分离有机械法和消化法两大类1.机械法：离心分离法：适用于细胞悬液组织。500-1000rpm离心5-10min。切割分离法：用剪刀剪切成1mm3左右的小块。机械分散法：挤压和研磨，适用于纤维含量少的组织。,61,（二）组织细胞的分离2.消化法：可使组织疏松，细胞分开，细胞容易生长，成活率高。胰蛋白酶消化法：适于消化细胞间质较少的软组织，对传代细胞也适用。使用浓度一般为0.1%-0.5%，用不含钙、镁离子的BSS配制，PH8-9。血清有抑制其活性作用。胰蛋白酶消化法有热(37)和冷(4)两种处理。,63,胶原酶消化法：胶原酶是由细菌中提取出的酶，适用于消化纤维组织、上皮组织或胶原成分的组织。可用含钙、镁离子的BSS配制或溶于含血清的培养液中。使用浓度一般为0.1-0.3mg/mL，37温育。优点：消化缓和、无需机械振荡缺点：价格昂贵可与胰蛋白酶混用,64,其他消化酶消化法：链霉蛋白酶、黏蛋白酶、透明质酸酶等。螯合剂消化法：常用螯合剂有柠檬酸钠、EDTA-Na2等。可用不含钙、镁离子的BSS配制成0.02%溶液。EDTA适于消化传代细胞，不受血清抑制，消化后需彻底清洗。,65,（三）培养方法1.组织块培养法：简便，成功率较低,2.单层细胞培养法:将解离得到的细胞用培养液配制成一定密度的细胞悬液，接种培养。3.悬浮细胞培养法：指细胞悬浮在培养液中生长增殖的培养方法。少数动物细胞（血液和淋巴组织细胞等非贴壁动物细胞）可悬浮生长，采集组织分散、过滤、离心、纯化、漂洗后接种培养。,4.3.2传代培养传代培养：从原代培养的细胞继续转接培养称为传代培养。动物细胞培养类型:非贴壁培养：也叫悬浮培养。用于血液白细胞、淋巴组织细胞、某些肿瘤细胞、杂交瘤细胞、转化细胞系等的培养，可在培养液中悬浮生长。贴壁培养：大多数动物细胞需贴附于带适量正电荷的固体或半固体表面进行培养。,67,68,贴壁生长细胞的传代（消化法）：要求细胞覆盖80%以上吸出旧的培养液。用不含钙、镁离子的BSS溶液清洗。加入0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA混合液解离细胞。2-5min检查，如有细胞间隙变大，加入蛋白酶抑制剂或血清培养液终止消化。离心，弃上清液，加入Hanks液漂洗两次。吸管轻轻吹打，加入新鲜培养液，制成悬液，计数并调整其密度。重新接种培养。,2.半悬浮生长细胞的传代消化法或直接吹打法3.悬浮生长细胞传代离心法：培养物转移到离心管，1000r/min离心。弃上清液，沉淀细胞加新培养液混匀传代。,4.3.3常用培养技术1.悬滴培养：又称植块悬滴培养法，1907年由哈里森首创。即将组织或器官植块接种在一张盖玻片上，滴上一滴培养液，然后翻转盖玻片使植块及营养液悬挂于盖玻片下，再置于一凹形载玻片上，最后用熔蜡密封后放于培养箱中培养。优点：1）容易换片。2）培养物在培养过程中，不需移动位置，有利于组织分化。,72,2.培养瓶培养：指将培养对象直接接种于培养瓶内培养。1923年，卡雷尔（Carrel）设计了卡氏瓶。采用的材料对细胞无毒，透明,悬浮细胞培养瓶,滚动培养瓶,贴壁细胞培养瓶,盖玻片+培养瓶培养法：先以盖玻片为生长表面，将拟培养细胞或组织接种于盖玻片上，然后放进培养瓶中进行培养。优点：1）可以避免培养瓶表面粗糙等原因对培养物的影响2）可以方便显微观察、染色等操作，以及永久保存3）增加了培养瓶培养面积。,3.旋转管培养：盖尔（Gey，1933年）、刘易斯（Lewis，1934年）建立该方法。特点：是培养中组织块或细胞交替地与培养液和空气直接接触，有利于物质交换和细胞生长。缺点：不易在显微镜下观察。,77,78,4.克隆培养法：又称单细胞分离培养法，就是将细胞悬液中获得的单个细胞用于培养，使之重新繁殖成一个新的细胞群体的培养技术。,细胞株:由细胞系进一步克隆化，而获得的由单一细胞形成的细胞群体。,初代细胞和有限细胞系的克隆培养比较困难，无限细胞系、转化细胞系和肿瘤细胞等则比较容易,提高克隆形成率的措施：合理安排接种的密度（10个细胞/ml）使用克隆培养基（Ham12K培养液）使用同源细胞的条件培养液在培养中加入胎牛血清或其他添加剂、激素和生长因子将祖细胞接种到饲养细胞层或其他可适应的生长基质表面,79,条件培养液：已经培养过某种细胞的培养液（内含该细胞分泌的活性物质，包括少量生长因子）与一定比例新鲜培养液混合的培养液。可促进与支持其他种细胞的生长。饲养细胞：也称滋养细胞，是一层经过射线照射或裂霉素C作用后失去分裂能力，供其他细胞附着的细胞层。能促进克隆细胞的生长，利于克隆的形成。,80,克隆培养技术：1.稀释铺板法2.饲养层克隆法3.胶原膜板或血纤维蛋白膜层板克隆法4.琼脂克隆法5.多孔塑料培养板单细胞克隆法,81,82,5.细胞同步化培养：用自然的或人工的方法获得细胞周期同步化的细胞群体。,筛选同步化细胞,诱导同步化细胞,M期细胞震荡脱落法,离心洗脱法,梯度沉降法,血清饥饿法,异亮氨酸营养缺乏法,DNA合成抑制剂阻断法,秋水仙素阻断法,6.动物细胞的大规模培养,分批式操作,流加式操作,半连续式操作,连续式操作,灌流式操作,优点：操作简单，培养周期短，污染和细胞突变的风险小。缺点：费用高，每一次收液后，都要进行一系列新的接种放大的准备工作，此期间生产停工。而且收液率低.,优点：生产效率高，可反复长期培养，反复收获产品。,优点：反应器的培养状态可以达到恒定，细胞在稳定的状态下生长。缺点：开放式操作，容易造成污染。细胞容易发生变异，且对设备等要求高。,优点：培养状态恒定，细胞在稳定的状态下生长。产量高等.,6.动物细胞的大规模培养,4.4细胞系和细胞株的建立,85,细胞系：原代培养物开始第一次传代培养后的细胞称为细胞系。分为有限细胞系、无限细胞系。细胞株:由细胞系进一步克隆化，而获得的由单一细胞形成的细胞群体。,二倍体细胞：细胞群染色体数目与原供体二倍细胞染色体数相同或基本相同（2n细胞占75或80以上）的细胞群。如仅数目相同，而核型不同的即染色体形态有改变者为假二倍体。为保持二倍体细胞能长期被利用，一般在初代或25代即大量冻存作为原种。遗传缺陷细胞：从有先天遗传缺陷者取材（主要为成纤维细胞）培养的细胞，或用人工方法诱发突变的细胞，都属遗传缺陷细胞。这类细胞可能具有二倍体核型，也可呈异倍体。,86,肿瘤细胞系或株：是现有细胞系中最多的一类，我国已建细胞系主要为这类细胞。肿瘤细胞系多由癌瘤建成，多呈类上皮型细胞，常已传几十代或百代以上，并具有不死性和异体接种致瘤性。,87,细胞系或细胞株的命名,HeLa：为供体患者的姓名（来源于宫颈癌）CHO：中国地鼠卵巢细胞（ChineseHamsterOvary）宫-743：宫颈癌上皮细胞，1974年3月建立NIH3T3：美国国立卫生研究院（NationalInstituteofHealth）建立；每3天传代，每次接种3105细胞mL。,细胞系或株的鉴定、管理和使用,ATCC入库细胞要求检测项目如下：培养简历：组织来源日期、物种、组织起源、性别、年龄、供体正常或异常健康状态、细胞已传代数等冻存液：培养基和防冻液名称细胞活力：融解前后细胞接种存活率和生长特性培养液：培养基种类和名称（一般要求不含抗生素）、