植物组织培养考试复习题

植物组织培养绪论P1第一章植物组织培养的基本原理P3第二章植物组织培养的基本原理P6第三章植物器官和组织培养P11第四章胚胎培养及离体授粉P16第五章花药和花粉培养P20第六章植物细胞培养P24第八章原生质体培养P27第九章植物离体繁殖P30第十章无病毒苗木培育P33植物组织培养基本操作P3511绪论植物组织培养的概念植物组织培养是在无菌和人工控制的环境条件下，利用适当的培养基，对离体的植物器官、组织、细胞及原生质体进行培养，使其再生成细胞或完整植株的技术。由于培养的植物材料已脱离母体，又称为植物离体培养（PLANTCULTUREINVITRO。广义对植物的器官、组织、细胞及原生质体进行离体培养技术植物组织培养狭义对植物的组织（分生组织、表皮组织、薄壁组织等）及培养产生的愈伤组织进行离体培养。1无菌使培养器皿、器械、培养基和培养材料等处于无真菌、细菌、病毒等微生物的状态，以保证培养材料在培养器皿中正常生长和发育。2人工控制的环境条件对光照、温度、湿度、气体等条件进行人工控制，以满足植物培养材料在离体条件下的正常生长和发育。3外植体由活体（INVIVO植物体上提取下来的，接种在培养基上的无菌细胞、组织、器官等。（植物组织培养中，使用的各种器官、组织和细胞统称为外植体。）4愈伤组织外植体因受伤或在离体培养时，其未分化的细胞和已分化的细胞进行活跃的分裂增殖而形成的一种无特定结构和功能的组织。（在人工培养基上由外植体上形成的一团无序生长状态的薄壁细胞。）植物组织培养的特点植物组织培养的主要特点是采用微生物学的实验手段来操作植物离体的器官、组织和细胞。具体特点表现在1）组织培养的整个过程都是在无菌条件下进行的，外植体、培养基、接种环境都须经过无菌处理。2）组织培养在多数情况下是利用成分完全确定的人工培养基进行的，除少数特殊情况（进行营养缺陷型突变细胞的筛选）外，培养基中包含了植物生长所需的水分和一切大量元素、微量元素、有机物和植物激素，培养基的PH和渗透压也是人为设定的。因此，在组22织培养中的植物材料不需依靠自身的光合作用制造养分，而是处于完全的异养状态。3）组织培养的起始材料可以是植物的器官、组织，也可以是单个的细胞（如小孢子）和三倍体细胞（如胚乳）水平上，即使是去掉了细胞壁的细胞（原生质体）在组织培养条件下也能再生完整植株。4）组织培养物通过连续继代培养可以不断增殖，形成克隆（CLONE,也称无性繁殖系），或通过改变培养基成分，特别是其中的植物激素的种类和配比，而达到不同的实验目的，如茎芽增殖或生根。5）组织培养是在封闭的容器中进行的，容器内气体和环境条件可通过瓶塞或其他封口材料进行交换。容器内的相对湿度在通常情况下几乎是100。因此，组培苗叶片表面一般都无角质层或蜡质层，且气孔保卫细胞功能缺乏，气孔始终都是张开的。6）组织培养的环境温度、光照强度和时间等都是人为设定的，找出这些物理因素的最适参数对组培成功也很重要。植物组织培养的类型广义的组织培养依外植体不同，可分为1、器官培养（ORGANCULTURE）对植物体各部分器官及器官原基进行离体培养的方法。常用的植物器官有根、茎、叶、花、果实、种子2、组织培养（TISSUECULTURE）对植物体的各部分组织进行离体培养的方法。常用的组织有分生组织、形成层组织、薄壁组织、韧皮部组织等。茎尖分生组织培养愈伤组织培养3、细胞培养CELLCULTURE对植物单个细胞或较小细胞团进行离体培养的方法。常用的细胞有性细胞、叶肉细胞、根尖细胞、韧皮部细胞等。4、胚胎培养对植物成熟和未成熟胚以及具胚器官进行离体培养的方法。常用的材料有幼胚、成熟胚、胚乳、胚珠、子房等。5、原生质体培养PROTOPLASTCULTURE植物组织培养的研究任务植物组织培养的形成与发展植物组织培养的研究历史可以追溯到19世纪中期，其开拓和发展的理论基础是植物细胞的全能性，即植物的每个核细胞具有母体全部基因，在离体培养下，都有分化、发育成完整植株的潜在能力。33该领域的发展历史可分为开创、奠基和建立三个阶段。植物组织培养的形成于发展开创1、18381839年，德国科学家SCHLEIDE和SCHWANN发表了细胞学说，奠定了组织培养的理论基础。该学说的基本内容是一切生物都是由细胞构成的，细胞是生物体的基本单位，细胞只能是由细胞分裂而来。2、1902年，德国植物学家HABERLANDT根据细胞学说，提出单个细胞的植物细胞全能性（TOTIPOTENCY）理论。他提出高等植物的器官和组织，可以不断分割，直至单个细胞，这种单个细胞是具有潜在全能性的功能单位，即植物细胞具有全能性。他在论文中写道虽然经常观察到细胞的明显生长，但从未观察到细胞分裂。这位先驱者失败的原因是实验材料高度分化；培养基过于简单。3、1904年，HANNING最先成功地培养了萝卜和辣根菜的胚。发现离体胚可以充分发育成熟，并提早萌发形成小苗。1922年，美国学者KNUDSON采用胚培养法获得大量兰花幼苗。4、1922年，德国学者KOTTE和美国学者ROBBINS进行了豌豆、玉米、棉花的茎尖和根尖离体培养，发现离体培养只能进行有限的生长，未发现培养细胞有形态发生能力。5、1925年，LAIBACH培养亚麻种间杂交幼胚获得成功，证明了胚培养在植物远缘杂交中的可能性。植物组织培养的形成与发展奠基20世纪3050年代，影响立体培养材料生长和发育的一些重要物质，如天然提取物、B族维生素、生长素AUXIN、细胞分裂素CYTOKININ的发现，促使植物组织培养的研究迅速发展，特别是分裂素与生长素的比例控制器官分化（DIFFERENTIATION的激素模式的建立，使植物组织培养技术与理论体系得以形成。GAUTHERET1937,1938在他培养的柳树形成层的培养基中加入这些物质，使生长大大加快，随后，他用胡萝卜的小外植体培养也获得成功。1926年，植物生理学家WENT首先发现了可以促进子叶鞘生长的物质，1930年证实了这种物质是生长素吲哚乙酸。1937年，WHITE又发现了B族维生素和IAA对植物根离体生长的作用，并用3种B族维生素VB6、VB1及VB5，取代椰汁获得成功，建立了第一个由已知化合物组成的培养基。441933年，中国学者李继侗和沈同首次报道了利用天然提取物进行组织培养的研究。他们利用加有银杏胚乳提取物的培养基，成功培养了银杏的胚。1934年，WHITE用番茄根尖经继代培养400余天有的书上说，28年培养了1600代，建立起第一个活跃生长的无性繁殖系，从而使非胚器官的培养首先获得成功。1941年，VANOVERBEEK等将椰乳加入到培养基中，使曼佗罗的心形期胚离体培养成熟，并推测椰乳中含有促进细胞分裂和生长的生理活性物质。法国的NOBECOORT1937,1938培养胡萝卜根和马铃薯的块茎薄壁组织，细胞增殖获得成功。不久，WHITE1939报到了烟草中间杂种NICOTIANAGLAUCANLONGSDORFFI幼茎切段原形成层组织的培养，继代培养也获得成功。在WHITE和GAUTHERET工作中所确立的植物组织培养的基本方法，成为以后进行各种植物组织培养的基础技术，奠定了植物组织培养的基础。1943年WHITE发表了植物组织培养手册AHANDBOOKOFPLANTTISSUECULTURE的专著，使植物组织培养开始形成一门新兴的学科。四十年代，SKOOG和崔徵1948在烟草茎切段和髓培养以及器官形成的研究中，发现腺嘌呤或腺苷可以解除培养基中生长素对芽形成的抑制作用，而诱导形成芽，从而确定了腺嘌呤/生长素的比例是控制芽和根形成的主要条件之一。这一比例高时产生芽，比例低时产生根，相等时则不分化。1956年MILLER等发现了激动素，知道激动素可以代替腺嘌呤促进成芽，并且效果约可增加3万倍。确立了控制器官分化的激素模式为激动素/生长素的比例关系。这种器官发生的激素调空模式的建立为植物组织培养中完整植株的再生奠定了理论基础。1953年，MUIR利用往复式摇床的振荡，在液体培养基中进行了万寿菊和烟草愈伤组织的培养，获得了单细胞或密集细胞的悬浮液，并可继代增殖。这既是培养方法上的突破，也是HABERLANDT培养单细胞设想的实现。1958年，英国学者STEWARD和REINERT几乎同时在胡萝卜根组织的韧皮部单细胞悬浮培养中发现，体细胞在形态上可转变为与合子胚相似的结构，其发育过程也与合子胚类似。由于它是从体细胞分化而来，因而称为体细胞胚或胚状体。这一实验证实了HABERLANDT的细胞全能性理论。植物组织培养的形成于发展建立1958年，WICKSON和THIMANN发现，应用外源细胞分裂素可以打破顶端优势，促使休眠的侧芽启动生长，从而形成微型的多枝多芽小灌木丛状结构。551960年，MOREL提出了利用茎尖离体快速无性繁殖兰花属的方法，该方法繁殖系数极高，并能脱毒，国际上相继形成了“兰花工业”，并实现了试管苗产业化。1962年，MURASHINGE和SKOOG在烟草培养中筛选出至今仍被广泛使用的MS培养基。1960年，英国学者COCKING用真菌纤维素酶酶解分离番茄根和烟草叶片，获得了原生质体，开创了原生质体的培养。1971年，日本学者NAGATA和TAKEBE首次将烟草叶肉原生质体培养的再生植株。1985年，FUJIMURA获得了第一例禾谷类作物水稻原生质体培养的再生植株。1986年，SPANGENBERG获得了甘蓝型油菜单个原生质体培养的再生植株。1972年，CARLSON通过两个种的烟草原生质体融合培养，获得了第一个体细胞杂交的杂种植株。1974年，KAO利用聚乙二醇进行了大豆和烟草科间原生质体的融合。1953年，TULECKE首先培养银杏成熟花粉获得了愈伤组织。19641966年，印度科学家GUHA和MAHESWARI在曼陀罗花药培养中首次由花粉诱导得到了单倍体植株。1969年，KAUL发现三角叶薯蓣悬浮培养物可以生产薯蓣皂苷配基，其量为干重的15。目前，利用组织培养途径生产的次生产物有皂苷类、生物碱、甾醇类、醌类、氨基酸和蛋白质等。植物组织培养的形成与发展应用及展望1、植物离体快繁运用组织培养的途径，一个单株一年可以繁殖几万到几百万个植株。例如一株葡萄一年繁殖到3万多株，一株兰花一年繁殖到400万株。2、无病毒苗木培育针对病毒对农作物造成的严重危害，通过组织培养可以有效地培育出大量的无病毒种苗。已经取得成功的有马铃薯、草莓、香蕉、葡萄等等。3、次生代谢物的产生有些极其昂贵的生物制品，如抗癌首选药物紫杉醇等，可以用大规模培养植物细胞来直接生产。4、培育新品种或创制新品种1）培育远缘品种利用组织培养可以使难度很大的远缘杂交取得成功，从而育成一些罕见的新物种。比如辽宁果树研究所利用这种方法获得苹果与梨的杂交种。662）离体选择突变体采用组织培养可以直接诱变和筛选出具抗病、抗盐、高赖氨酸、高蛋白等优良性状的品种。中国林科院用逐步加大培养基中盐的浓度，直接获得耐盐的杨树株系。3）单倍体育种5、植物种质资源的离体保存6、人工种子意义1）结构完整、体积小、便于贮藏与运输，可直接播种和机械化操作。2）不受季节和环境限制，利于工厂化生产。3）利于繁殖周期长、自交不亲和、珍贵稀有的植物，也可大量繁殖无病毒材料4）可在人工种子中加入抗生素、菌肥、农药等成分，提高种子品质5）体细胞胚由无性繁殖体系产生，可固定杂种优势。7、基因工程的应用（1）培育的优质、高产的转基因大豆新品种，蛋白质含量比标准品种提高4548，产量提高1020。（2）将鱼的抗冻基因导入番茄，获得了耐寒、高产的转基因番茄。转基因抗盐马铃薯也获得成功第一章植物组织培养的基本原理第一节植物组织培养实验室一、实验室要求环境要求理想的植物组织培养实验室应该建立在安静、清洁、远离污染源的地方，最好在常年主风向的上风方向，尽量减少污染。规模化生产的实验室最好建在交通方便的地方，便于产品的运送。需考虑两个方面一、所从事实验的性质二、实验室规模实验室设置的基本原则科学、高效、经济和实用。二、实验室组成（一）基本实验室基本实验室包括准备室、无菌操作室、培养室、缓冲间，是植物组织培养实验所必须具备的基本条件。如进行工厂化生产，年产4万20万，需34间实验用房，总面积60平方米。实验室必须满足3个基本需要实验准备（培养基制备、器皿洗涤、培养基和培养器皿灭77菌）、无菌操作和控制培养。1、准备室功能进行一切与实验有关的准备工作器皿洗涤、培养基配制与分装、培养基和培养器皿的灭菌、培养材料的预处理等。要求20平方米左右。要求宽敞明亮、以便于放置多个实验台和相关设备，方便多人同时工作；同时要求通风条件好，便于气体交换；实验室地面应便于清洁，并应进行防滑处理。设备准备室应具备工作台、柜橱、水池、仪器、药品等。分类分体式研究性质实验室，可将准备室分解为药品贮藏室、培养基配制与洗涤室和灭菌室等，功能明确，便于管理，不适于大规模生产。通间式规模化实验室，设计成大的通间，试验操作的各个环节在同一房间内按程序完成。便于程序化操作与管理，减少各环节间的衔接时间，提高工作效率。还便于培养基配制、分装和灭菌的自动化操作程序设计，减少规模化生产的人工劳动，更便于无菌条件的控制和标准化操作体系的建立。2、无菌操作室功能也叫接种室，进行材料的离体无菌操作，是植物离体培养研究或生产中最关键的一步。要求房间一般不宜过大，1020平方米即可。要求封闭性好，干燥清洁，能较长时间保持无菌，因此不宜设在容易受潮的地方；为便于消毒处理，地面及内墙壁都应采用防水和耐腐蚀材料；地面要求平坦无缝，便于清洁；为了保持清洁，无菌室应防止空气对流。一般新建实验室的无菌室在使用之前应进行灭菌处理，处理方法是甲醛和高锰酸钾熏蒸，并需定期灭菌处理，还可用紫外线照射12H/周，或每次使用前照射1030MIN。设备无菌操作室安装有紫外灯和空调，工作台和搁架，还有超净工作台和整套灭菌接种仪器、药品等。3、培养室功能对接种到培养瓶等器皿中的植物离体材料进行控制条件下的培养，实验材料进行培养的场所。要求1020平方米左右。要求能够控制光照和温度，并保持相对的无菌环境。因此，培养室应保持清洁和适度干燥；为满足植物培养材料生长对气体的需要，还应安装排风窗88和换气扇等换气装置；为节省能源和空间，应配置适宜的培养架，并应安装日光灯照明。研究用实验室，通常可根据光照时间设置成长日照、中日照、短日照培养室，也可以根据温度设置成高温和低温培养室，每一个培养室的空间不宜过大，便于对条件的均匀控制。进行精细培养类型如细胞培养和原生质体培养，可采用光照培养箱或人工气候箱代替培养室。设备培养架、光照培养箱或人工气候箱、边台用于拍摄培养物生长状况，除湿机、显微镜、温湿度计、空调等。4、缓冲间功能进入无菌室前的缓冲场地，减少人体从外界带入的尘埃等污染物。人员在此换上工作服、拖鞋、口罩，才能进入无菌室和培养室。要求35平方米，在准备室外或无菌操作室外，应保持清洁无菌；备有鞋架和衣帽挂钩。设备12盏紫外灯对衣物进行灭菌、灭菌工作服、拖鞋、口罩。（二）辅助实验室根据研究或生产的需要而配套设置的专门实验室，主要用于细胞学观察和生理生化分析等。1、细胞学实验室功能对培养材料进行细胞学鉴定和研究，分为制片室和显微观察室。制片是获取显微观察数据的基础，制片室配备有切片机、磨刀机、温箱及样品处理和切片染色设备，通风橱和废液处理设施。显微观察室主要有显微镜和图像拍摄、处理设备。要求明亮、清洁、干燥、防止潮湿和灰尘污染。2、生化分析实验室培养细胞产物为主要目的实验室，应建立相应的分析化验实验室，随时对培养物成分进行取样检查。大型次生代谢物生产，还需有效分离实验室。第二节仪器设备和器皿用具一、基本设备配置99（一）常规设备1、天平植物组织培养实验室需要不同精度的天平。感量0001G的天平（分析天平）和感量00001G的天平（电子天平）用于称量微量元素和一些较高精确度的实验用品。感量001G和01G的天平，用于大量元素母液配制和一些用量较大的药品的称量。2、冰箱各种维生素和激素类药品以及培养基母液均需低温报存，某些试验还需植物材料进行低温处理，普通冰箱即可。3、酸度计用于测定培养基及其它溶液的PH，一般要求可测定PH范围114之间，精度001即可。4、离心机用于细胞、原生质体等活细胞分离，亦用于培养细胞的细胞器、核酸以及蛋白质的分离提取。根据分离物质不同配置不同类型的离心机。细胞、原生质体等活细胞的分离用低速离心机；核酸、蛋白质分离用高速冷冻离心机；规模化生产次生产物，还需选择大型离心分离系统。5、加热器用于培养基的配制。研究性实验室一般选用带磁力搅拌功能的加热器，规模化大型实验室用大功率加热和电动搅拌系统。6、其它纯水器、分装设备（二）灭菌设备维持相对的无菌环境是植物组织培养实验室的基本要求。1、高压灭菌锅用于培养基、玻璃器皿以及其它可高温灭菌用品的灭菌，根据规模大小有手提式、立式、卧式等不同规格。2、干热消毒柜1010用于金属工具如镊子、剪刀、解剖刀，以及玻璃器皿的灭菌。一般选用200左右的普通或远红外消毒柜。3、过滤灭菌器用于一些酶制剂、激素以及某些维生素等不能高压灭菌试剂的灭菌，主要有真空抽滤式和注射器式。4、紫外灯方便经济的控制无菌环境的装置，缓冲间、接种室和培养室必备。（三）无菌操作设备1、接种箱使用较早的最简单的无菌装置，主体为玻璃箱罩、入口有袖罩，内装紫外灯和日光灯，使用时对无菌室要求较高。2、净化工作台其操作台面是半开放区，具方便、操作舒适优点，通过过滤的空气连续不断吹出，大于003UM直径的微生物很难在工作台的操作空间停留，保持了较好的无菌环境。由于过滤器吸附微生物，使用一段时间后过滤网易堵塞，因此应定期更换。（四）培养设备指根据需要所选用的不同规格和控制精度的用于植物细胞、组织和器官培养的设施和设备。1、培养架目前植物组织培养实验室植株繁殖培养的通用设施。成本低、设计灵活、充分利用培养空间。一般有45层，层间间隔4050CM，光照强度可根据培养植物特性来确定，一般每架上配备24盏日光灯。2、培养箱细胞培养、原生质体培养等要求精确培养的实验，可用光照培养箱、CO2培养箱、湿度控制培养箱等培养。3、摇床进行液体培养时，为改善通气状况，可用振荡培养箱或摇床。11114、生物反应器进行植物细胞生产次生产物的实验室，还需生物反应器。（五）其他设备时间程序控制器、温度控制系统或空调、实体显微镜、倒置式生物显微镜及配套的摄影、录像和图像处理设备、电泳仪、萃取和层析设备、紫外分光光度计、高效液相色谱仪、气相色谱仪、酶联免疫测定系统。二、培养容器与用具（一）培养容器包括各种规格的培养皿、三角瓶、试管、培养瓶。一般分为玻璃容器一般用无色并不产生颜色折射的硼硅酸盐玻璃材质。塑料容器材质轻、不易破碎、制作方便，广泛使用。一般为聚丙烯、聚碳酸酯材料的培养容器（二）金属用具1、镊子植物组织解剖用小的尖头镊子，分株转移繁殖转接用枪型镊子，1622CM长。2、剪刀不锈钢医用弯头剪，做取材和切段转移繁殖，1422CM长。3、解剖刀进行组织切段，多用短柄可换刀片的医用不锈钢解剖刀。4、其他用具接种铲、接种针在花药培养、花粉培养中有用。三）塑料用具各种封口膜、盖、塑料盘及其它实验用具。第三节基本操作一、洗涤（一）重铬酸钾洗涤法饱和重铬酸钾洗液的配制方法是将43G重铬酸钾溶与1000ML蒸馏水（20可以达到饱和状态），制成重铬酸钾饱和水溶液。然后缓慢加入浓硫酸，最后使重铬酸钾饱和水溶液以浓1212硫酸比例达到11。在配制过程中，只能把浓硫酸缓慢加入进去，决不可把重铬酸钾水溶液加入浓硫酸中，因会产生大量热量而来不及扩散，从而引起浓硫酸溅出。洗涤方法一般用具用水洗净玻璃器皿，晾干后放入重铬酸钾洗涤液中，浸泡1夜，第二天取出，用自来水冲洗，然后用蒸馏水洗两次。干燥后备用。小的玻璃制品法吸管先用自来水冲洗，放在特制的防腐不锈钢网筒内，用重铬酸钾浸泡一夜，再将网筒放入虹吸式自动冲洗装置中，用自来水冲洗数十次，最后用蒸馏水冲洗，干燥后备用。（二）洗涤剂洗净法重铬酸钾洗液的最大缺点是铬离子会造成环境污染，因此，应尽量避免使用。普通无磷中性洗涤剂，是理想的选择。（三）超声波洗净法这是一种物理的洗净法，对环境无任何污染，而且对比较顽固的污垢也十分有效，但超声波发生器容量有限，因此，常用来清洗较小的玻璃仪器和器械。方法将玻璃制品放入超声波洗净器中，注入自来水，设定时间，然后进行处理，拿出用自来水冲净，蒸馏水冲洗。（四）玻璃器皿的清洗新购置的玻璃器皿带有游离的碱性物质，先用1的稀盐酸浸泡1夜，再用肥皂水洗净，清水冲洗，蒸馏水冲淋，烘干。已用过的培养器皿去掉培养基，洗涤剂溶液浸泡，刷子刷洗，自来水冲洗，蒸馏水冲洗。较脏的玻璃器皿洗衣粉或洗洁精刷洗，冲净，浸入洗涤液中，按上面方法洗涤，浸泡时间根据脏的程度定。被污染的玻璃器皿121高压蒸汽灭菌后，用洗涤剂刷掉污染物，冲洗，重铬酸钾洗涤液浸泡，2H后取出，自来水冲洗，蒸馏水冲淋。用过的吸管或滴管在洗涤液中浸泡2H以上，取出冲洗干净。洗净后的玻璃器皿应透明发亮，内外壁水膜均匀，不挂水珠。第二章植物组织培养的基本原理1313植物细胞全能性理论是植物组织培养的核心理论。离体细胞具有生命的特征属性，在全能性的基础上，提供合适的营养和环境条件，离体细胞经历脱分化和再分化过程第一节植物细胞全能性和细胞分化植物细胞的全能性（TOTIPOTENT植物细胞具有该植物体全部遗传的可能性，在一定条件下具有发育成完整植物体的潜在能力。原理生物体的每一个细胞都包含有该物种所特有的全套遗传物质，都有发育成为完整个体所必需的全部基因，从理论上讲，生物体的每一个活细胞都应该具有全能性。差异（1）受精卵的全能性最高（2）受精卵分化后的细胞中，体细胞的全能性比生殖细胞的低。潜在全能性的原因基因表达的选择性科学研究表明，处于离体状态的植物活细胞，在一定的营养物质、激素和其他外界条件的作用下，就可能表现出全能性，发育成完整的植株。人工条件下实现的这一过程，就是植物组织培养。分化植物体各个部分出现异质性的现象，可以在细胞水平、组织水平或器官水平上表现出来。细胞分化导致细胞形成不同结构，引起功能改变或潜在的发育方式改变的过程。细胞分化是组织分化和器官分化的基础，是离体培养再分化和植株再生得以实现的基础。第二节离体条件下植物器官的发生脱分化（DEDIFFERENTIATION将来自已分化组织的已停止分裂的细胞从植物体部分的抑制性影响下解脱出来，恢复细胞的分裂活性。再分化（REDIFFERENTIATION离体培养的植物细胞和组织可以由脱分化状态重新进行分化，形成另一种或几种类型的细胞、组织、器官，甚至形成完整植株，这个过程称为再分化。一、脱分化和再分化1414类型（1）细胞水平的再分化（2）组织水平的再分化（3）器官水平的再分化器官型和器官发生型（4）植株再生先芽后根、先根后芽、芽根同时二、影响细胞脱分化和再分化的因素（一）影响细胞脱分化的因素1、损伤2、生长调节剂3、光照4、细胞位置5、外植体的生理状态6、植物种类差异（二）影响细胞再分化的因素因素（同上）原因1、不同植物种类再分化能力差异很大2、对某些植物的植物再生条件还没有完全掌握三愈伤组织培养（一）愈伤组织形成、生长和保持1、愈伤组织的形成在脱分化过程中，大多数情况下形成愈伤组织。愈伤组织的结构往往是异质的，无明显极性，其形成过程可分为诱导期、分裂期和分化期。1）诱导期（启动期）是愈伤组织形成的起点。是指细胞准备进行分裂的时期。2）分裂期外植体的外层细胞出现了分裂，中间细胞常不分裂，故形成一个小芯。由于外层细胞迅速分裂使得这些细胞的体积缩小并逐渐恢复到分生组织状态，细胞进行脱分化。特征细胞分裂快，结构疏松，缺少有组织的结构，颜色浅而透明。3）分化期停止分裂的细胞发生生理代谢变化而形成由不同形态和功能的细胞组成的愈伤组织，在细胞分裂末期，细胞内开始发生一系列形态和生理变化，导致细胞在形态和生理功能上的分化，出现形态和功能各异的细胞。2、愈伤组织的生长诱导期后，外植体外层细胞开始出现分裂，在组织受伤表面形成一种创伤形成层，愈伤组织的细胞数目迅速增多。愈伤组织在生长过程中的生理生化变化1）在诱导期和分裂始期，每个分裂细胞中的RNA含量迅速增加，并达到一个高峰，但在继续分裂的过程中，RNA的含量减少。2）同工酶谱发生变化。3）连续继代培养可能改变次生物质的积累水平或能力。4）延长培养期可能使愈伤组织对生长素的需求发生变化，导致生长素的自给和自养，出现驯化现象1515愈伤组织的质地明显不同，有松脆和致密两种类型，但它们之间是可以相互转变的。一般加入较高浓度生长素，可使致密的愈伤组织变的松脆；而降低或去除生长素或加入高浓度的细胞分裂素，往往使愈伤组织变的致密。3、愈伤组织的保持大多数情况下，随继代培养代数的增加和培养时间的延长，愈伤组织表现出生长势下降、褐变、分化和形态发生能力逐渐降低甚至死亡或形态发生能力完全丧失。这种情况的发生主要是遗传和生理因素所致。前者包括染色体畸变、基因突变等；后者是细胞或组织内激素平衡的改变或细胞对外源生长物质的敏感性的改变。因生理因素导致的形态发生能力下降可通过改变培养条件而得以改善。由愈伤组织再分化的形态发生方式也有体细胞胚胎发生和器官发生两种，后者具体包括先芽后根；先根后芽；在愈伤组织不同部位形成芽和根，然后芽、根的维管束接通形成完整植株；仅形成芽或根。第三节植物体细胞胚胎发生体细胞胚胎发生植物离体培养细胞产生胚状体的过程。一、植物体细胞胚胎发生过程（一）体细胞胚胎发生过程不同种类的植物体细胞胚胎发生的主要发育阶段的划分是不一致的，但一般可分为胚性愈伤组织诱导、体细胞胚胎诱导、体细胞胚胎早期分化发育、体细胞胚胎成熟、体细胞胚胎萌发和成苗五个阶段。在双子叶植物上，体细胞胚胎发生经过原胚、球形胚、心形胚、鱼雷形胚和成熟胚阶段。在禾本科植物的成熟体细胞胚上，可以清楚看到胚特有的结构，即盾片、胚芽鞘和胚根等。（二）胚性和非胚性细胞或愈伤组织生理状态的差异胚性细胞与分生组织类似，通常较小，近圆形，具有较大的核和核仁并能高度染色，胞质浓厚。1616典型的胚性愈伤组织外表呈松脆颗粒状。与非胚性细胞或愈伤组织组织相比，DNA、RNA以及蛋白质的合成更为活跃，表现为含量和种类的增加、淀粉和可溶性糖含量增加、内源多胺含量升高、活性氧水平提高、同工酶谱和内源激素合成有明显变化等。（三）体细胞胚胎发生的基因表达机理（略）二、植物体细胞胚胎发生途径（一）体细胞胚胎发生的方式由外植体诱导体细胞胚胎发生的途径有两种直接途径和间接途径。直接途径从外植体某些部位的胚性细胞直接诱导分化出体细胞胚胎。这种“胚性细胞”是在胚胎发生之前就已决定了的。间接途径外植体先脱分化形成愈伤组织，在从愈伤组织的某些细胞，即重新决定为胚性细胞的细胞分化出体细胞胚胎，多数体细胞胚胎的形成是通过间接途径产生的。分两个阶段完成1）胚胎发生丛（EC）的形成愈伤组织中常含有两种类型的细胞，一种具有大液泡的细胞，通常失去胚胎发生潜能，在培养基中易散开；另一种液泡小、细胞质浓的小细胞，这种小细胞聚集为丛状。被称为EC。EC表面是高度分生组织化的细胞，一个EC表面可产生大量的胚状体。2）胚状体的发育EC通常在原培养基上不能使其表面的胚状体发育，但EC可以增殖、崩溃而不衰。EC崩溃是由于EC中心的细胞增加，并膨胀使EC崩溃，崩溃后分生性的表面细胞结合成群，又形成新的EC。EC在转入降低或去除生长素、降低还原氮的培养基后，才能完成胚状体发育。（二）体细胞胚胎的起源（略）三、植物体细胞胚胎发生的极性和生理隔离体细胞胚胎具有两个明显特点1、双极性2、与母体组织或外植体的维管束系统无直接联系，处于较为孤立的状态，即存在生理隔离。1717（一）体细胞胚胎发生的极性单个胚性细胞与合子胚一样，具有明显的极性，第一次分裂多为不均等分裂，顶细胞继续分裂形成多细胞原胚，基细胞进行少数几次分裂形成胚柄。（二）体细胞胚胎发生的生理隔离被子植物的胚囊减数分裂后，形成的大孢子与周围细胞处于分开的状态。在小孢子发生时，小孢子母细胞在减数分裂前期也与绒毡层的细胞间没有联系。在多数植物中都观察到，早期的胚性细胞与周围细胞还存在胞间连丝，但随着胚性细胞的发育，细胞壁加厚，胞间连丝消失或被堵塞。胚性细胞开始分裂，从二细胞原胚到多细胞原胚始终被厚壁包围，与周围细胞形成明显的界限。第四节、影响植物离体形态发生的因素植物离体培养中，外植体的基因型和生理状态、培养基、培养条件等是影响离体形态发生的主要因素。一、植物种类和基因型不同物种和同一物种不同基因型，其形态发生能力往往有巨大差异。二、培养材料的生理状态1、植物的发育年龄2、培养器官或组织类型1）种子、幼胚和下胚轴易形成胚状体，茎段、叶片比较困难；双子叶植物形态发生常用的外植体依次为叶、茎、胚轴、子叶等；单子叶植物特别是禾本科植物，细胞分裂旺盛的分生组织或器官，如叶基部、茎尖、幼胚、胚珠、幼花序轴等是极好的外植体。2）同一器官不同部位的组织，其再生器官能力也不同。3）外植体的大小对器官再生有影响。4）不同季节来源的外植体，其形态发生的能力也有差异。5）供体植物的生长环境也影响外植体的生理状态。3、培养时间和细胞倍性1818愈伤组织培养时间过长或继代培养次数太多，往往会推迟或降低形态发生的能力，所以一般均取处于旺盛生长期的愈伤组织材料来诱导器官的形成。但是对于某些植物的胚状体发生，往往需要愈伤组织培养较长时间或多次继代培养。细胞倍性也影响形态发生能力。高渗透压条件下，容易启动花粉粒单倍性细胞生长和分化，容易得到花粉胚状体，而花药壁来源的二倍体细胞的生长和分化都受到明显抑制。三、培养基1、植物营养1）一般认为，培养基中的铵态氮和K有利于胚状体形成，提高无机磷的含量可促进器官发生，不加还原氮有利于根的形成等。用于茎尖培养和芽诱导的培养基主要是MS及其修改的配方和B5培养基。2）碳水化合物种类及浓度对体胚发育有重要作用，缺糖或低糖常无法形成胚状体。3）其他物质如氨基酸、天然复合物常不同程度地促进器官和胚状体发生。2、物理性质固态或液态、渗透压以及PH等，对器官或胚状体的形成及发育也有明显影响。3、植物生长调节剂植物生长调节剂是影响植物离体形态发生的最关键因素。1）生长素植物离体形态发生过程中，生长素促进外植体生长、生根，并与细胞分裂素共同作用诱导不定芽分化及侧芽的萌发与生长。由于植物外植体中原来有的内源激素种类和浓度不同，需添加的激素种类及浓度也就不同。有些外植体诱导芽或无根苗形成时，需补加一定量的生长素，或与分裂素一起补加才显出作用。3、植物生长调节剂2）细胞分裂素促进分化和芽形成，抑制根发育与衰老。分裂素可促进也可抑制体胚发生，这主要取决于植物的种类及基因型。3）赤霉素促进茎的伸长，打破休眠，对芽的诱导和形成有促进作用。4）乙烯对芽的诱导和形成有促进或抑制作用，这与植物种类及处理时间有关。5）脱落酸增强胚性愈伤组织的形成和体胚发生，防止畸形胚形成，抑制体胚过早萌发，促进胚中贮藏成分。1919四、培养条件1、光1）光照强度不同植物及不同材料对光照强度要求不同。一般情况下，植物所需的光照强度为10005000LX。光照强度对培养物的增殖、器官分化、胚状体形成都有重大影响。2）光照长度一般情况下，植物每日所需的光照时间为1016小时。3）光质不同波长的光对细胞分裂和器官分化有影响。对苗再生最有利的光谱是蓝光区，根的发生则是红光区较有利。2、温度不同植物要求的最适温度不同。一般园艺植物的生长适温为文竹17，百合20，杜鹃25，石刁柏26，月季2527，葡萄28，番茄28。植物愈伤组织的培养愈伤组织培养是指将母体植株上的各个部分切下，形成外植体，接种到无菌的培养基上，进行愈伤组织诱导、生长和发育的一门技术。一般情况下，植物组织均能诱发形成愈伤组织，由外植体形成愈伤组织，标志着植物离体培养的开始。一愈伤组织的诱导（一）诱导原理1、细胞全能性植物每一细胞具有全套遗传信息，在特定环境下能进行表达，而产生一个独立完整的个体。只要有一个完整的膜系统和一个有生命力的核，即使已经是高度分化的植物细胞，也还保持恢复到分生状态的能力。其恢复能力取决于该细胞原来所处的部位和生理状态。2、脱分化现象一个已经停止分裂的成熟细胞转变为分生状态，并形成未分化的愈伤组织的现象。植物离体培养中的脱分化过程植物离体培养利用特定的条件，促进细胞脱分化，使原2020已分化并具有一定功能的细胞脱离原轨道，失去其原有状态和功能，而恢复到未分化的愈伤组织状态。3、诱导程度双子叶植物比单子叶植物容易幼年细胞组织比成年细胞组织容易二倍体细胞比单倍体细胞容易（二）诱导方法1、根据不同的培养目的，获取不同的外植体。植株茎的切段、叶、根、花和种子，或某些组织切成片或块状，均可接种到培养基上。接种时需考虑材料的一致性，来源、产地、大小、形状、生理部位。常选组织块较大的材料。2、操作程序获取外植体材料消毒处理修整除去坏死组织切成5MM的圆柱形或方形小块直放或倒放到培养基上每9CM培养基接种56块外植体培养。采用圆形的原因能得到外形简单结构相同的材料圆形的表面积大圆柱形的外植体有利于组织块与外界进行物质和气体交换；也使外植体表面促进愈伤组织形成的分泌物较多，诱导率增高。培养基MS培养基；激素IAA、NAA、2,4D、BA；椰子汁、番茄汁、酵母提取物。二、愈伤组织细胞的分化（一）诱导期诱导期是细胞正在准备分裂的时期。1、诱导期特征细胞质增加，出现活跃的原生质流动，贮藏物质淀粉等消失；随着组织的活化，细胞内核糖体增加并形成大量多聚核糖体；RNA迅速合成和累积；但细胞大小无多大变化。2、影响愈伤组织诱导的因素2121（1）植物种类、生理状况、外部因素不同，诱导期不同。（2）弱光下植株比强光下的植株外植体易于诱导分裂（3）二氧化碳抑制诱导分化（4）生长调节剂诱导细胞开始分裂（5）损伤剌激能加速脱分化进行，有时还是某些材料能否脱分化的决定条件。（6）离体培养后细胞变化（7）气体交换迅速增加；RNA出现；（8）蛋白质发生周期性变化；（9）酶水平变化。（二）分裂期分裂期是指细胞脱分化，细胞通过分裂不断增生子细胞而形成愈伤组织的过程。植物分裂期脱分化规律胡萝卜等脱分化较禾谷类容易茎叶较花器脱分化幼嫩茎组织比老组织较容易2、分裂期愈伤组织特征细胞数目增加、体积变小、核和核仁变大、RNA含量持续上升。从培养外植体的形态变化来看，表现为外层细胞迅速分裂。当细胞体积最小，细胞核和核仁最大，RNA含量最高时，标志着细胞处于分裂高峰时期。分化期主要变化为1、细胞分裂部位和方向发生改变2、分生组织瘤状结构和维管组织形成3、细胞体积不再减小4、出现各种类型细胞5、颜色变化三、愈伤组织的继代培养（一）培养基和培养条件1、培养基1）常用于愈伤组织继代培养的培养基有MS、N6。2）细胞分裂素/生长素比例控制器官发生的模式IAA/KT高，利于根形成；IAA/KT低，利于芽的分化；IAA/KT适中，则产生愈伤组织天然提取物椰乳，浓度10；番茄汁，浓度510；香蕉汁5，浓度10注意植物离体培养中，及时更换植物生长物质的种类和浓度，才能有效控制器官的分化。生长物质用量影响器官分化。IAA、IBA处理根比较壮，2,4D对生根不利。BA比KT2222诱导芽效果强，ZT作用窄。3）有机成分酪氨酸明显增强烟草组织的器官形成酰胺类促进器官形成水解酪蛋白、水解乳蛋白为多种氨基酸混合物腺嘌呤促进茎切段培养中芽的形成糖提供外植体能量，维持一定水势4）物理性质培养基形式、水势，对形态发生有明显影响诱导愈伤组织固态培养基；细胞和体细胞胚增值液态培养基，胚状体发育成苗固态培养基培养基PH值对芽分化有影响55602、培养条件1）光照愈伤组织培养中，某些植物诱导要求在黑暗中生长，大多数都需要光。有的葡萄品种对短日照敏感，烟草愈伤组织需要蓝光。2）温度一般2428，有些植物需要一定昼夜温差。（二）继代培养物的分化潜力1、生理因素多次继代后不加IAA也可达到同样生长量。不同培养物保持分化潜力不同。丧失分化能力的组织，加入腺嘌呤、酪蛋白、酵母汁后，可恢复一定分化能力。2、遗传因素继代培养中易出现染色体紊乱，分化能力丧失与倍性不稳定有关。三继代培养物的体细胞变异后生遗传变异即离体培养组织在培养中获得激素的自主性（有外源激素才能生长的组织，后期自身产生激素）。2323影响后生遗传变异产生的因素主要有1、组织自然倾向2、培养基化学成分和物理状态四、愈伤组织的形态发生概念极性植物细胞分化中的一个基本现象，指植物的器官、组织、甚至单个细胞在不同轴向上存在的某种形态结构以及生理生化上的梯度差异。细胞无性系植物离体培养中，任何形式的细胞培养所产生的植株，即称细胞无性系。植物愈伤组织离体培养中，脱分化形成无极性或无明显形态的愈伤组织块。当条件适合时，愈伤组织发生再分化而产生芽或根的分生组织，甚至体细胞胚，进而发育成苗或完整植株。愈伤组织的形态发生有以下两种情况一、不定芽和根的发生（器官发生）是愈伤组织培养物或细胞培养中常见的器官发生方式。（一）愈伤组织通过不定芽和根形成器官的阶段1、外植体脱分化愈伤组织2、愈伤组织瘤状结构3、瘤状结构器官原基（二）愈伤组织的器官发生顺序1、无芽的根或无根的芽愈伤组织仅有芽或根器官的分别形成，不能形成完整植株。2、先芽后根愈伤组织先形成芽，芽生长后，其基部发出根，进而形成小植株，是大多数植物的器官发生方式。如苹果、葡萄、柑橘、番茄、菊花、小麦、水稻3、先根后芽先形成根，再从根的基部分化出芽形成小植株，双子叶植物中普遍。如颠茄、枸杞、苜蓿4、分别形成芽和根愈伤组织邻近不同部位分别形成芽和根，两者结合起来形成一株小植株，类似根芽的天然嫁接。如胡萝卜、石刁柏二、体细胞胚的发生2424（一）胚状体的概念胚状体离体培养下没有经过受精过程，但经历了胚胎发育过程所形成的胚的类似物，统称为体细胞胚或胚状体。胚状体可以从花药或花粉培养、愈伤组织培养、离体器官培养、单细胞悬浮培养中产生。（二）胚状体的发育过程细胞分化持续细胞分裂增殖原胚期球形胚心形胚鱼雷形胚子叶期（三）胚状体的类别1、体细胞胚来源于根、茎、叶和它们的组织和细胞，经离体培养而发生的类胚结构，染色体组为两套，可发育成为正常植物体。2、生殖细胞胚来源于大小孢子细胞，经离体培养而形成的类胚结构，染色体为单套，可发育成单倍体植物体，经染色体加倍成为可育植物。3、三倍体胚来源于胚乳细胞的胚状体，具三套染色体组。三倍体植物具不育性。（四）胚状体形成植株的特征1、具有两极性细胞发育早期阶段，从其相反的两端分化出芽端与根端，而不定芽和不定根都是单向极性。2、胚状体的维管组织与外植体的维管组织无解剖结构上的联系，而不定芽和不定根往往总是与愈伤组织的维管组织相联系3、胚状体的维管组织的分布是独立的“”形，而不定芽和不定根的维管组织无此现象。（五）胚状体发生影响因素铵态氮对胚状体的发生有利，也可同时使用铵态氮和硝态氮赤霉素、细胞分裂素抑制胚状体发生生长素类对胚状体的发生有重要作用（六）胚状体形成植株的优点1、胚状体的数量比不定芽多2、胚状体可制成人工种子，便于运输和贮藏3、胚状体的有2525性后代遗传性更接近母体植株。四、愈伤组织培养的应用除茎尖分生组织培养和部分器官培养外，所有培养形式最终都要经历愈伤组织才能产生再生植株，愈伤组织也常是悬浮培养的细胞和原生质体的来源。外植体不经愈伤组织发育成器官两种情况1、外植体中已存在器官原基，进一步形成相应的组织器官进而再生植株，如茎尖、根尖分生组织培养。2、外植体某些部位的细胞，在重新分裂后，直接形成分生细胞团，然后由分生细胞团形成器官原基。（一）愈伤组织培养多种用途1、研究植物生长发育与分化的机制、遗传变异规律，对植物遗传育种有特殊意义2、大规模工厂化生产有用化合物，或用于细胞培养筛选工业、农业、医药生产上有用的无性系，或用于原生质体来源。实践证明，愈伤组织不仅是一种植物快繁的新手段，同时也是品种改良，种质资源保存和有用化合物生产的理想途径。（二）在园艺植物育种中的应用1、加快园艺植物新品种和良种繁育速度，迅速高效低成本2、培养无病毒苗木3、获得倍性不同植株，易染色体核内加倍育种有利用价值4、克服远缘杂交困难5、利于种质资源长期保存6、提供育种中间材料7、诱发和离体筛选突变体8、制造人工种子植物离体培养中的器官发生类型不定芽型诱导顶端分生组织产生不定芽，再生成植株的方式。顶芽、腋芽培养。多数植物培养采用。特点繁殖率高、遗传稳定性好器官型从器官外植体诱导不定芽，再生成植株的方式。茎、叶、花器、鳞片培养。特点繁殖速度慢，遗传性状较稳器官发生型从器官外植体诱导愈伤组织，经愈伤组织细胞的分化再生成植株的方式。特点繁殖速度快、遗传性状不稳定2626类胚体发生由植物体器官、组织和细胞培养而直接发生类胚结构，最后以胚状体成苗的方式。特点遗传性一致，体细胞发生数量大原球茎型兰属特有的器官发生方式，种子培养发生原球茎，原球茎直接长成植株。特点遗传较稳、繁殖率不高第三章植物器官和组织培养第一节植物器官和组织培养的基本程序1、无菌外植体的获得（一）茎尖、茎段、叶片的灭菌清水冲洗，吸干0102氯化汞浸泡210MIN，（70酒精浸泡数秒，10次氯酸钙浸泡1020MIN或2次氯酸钠浸泡1530MIN）灭菌水冲洗35次无菌滤纸吸干分割接种。（二）根、块茎、鳞茎的灭菌生长在土中，灭菌困难，以受损伤。灭菌前仔细清洗，加大灭菌剂浓度或延长灭菌时间。（三）花蕾的灭菌未开放的花蕾中的花药为花被包裹，处于无菌状态，采摘后可直接灭菌。70酒精浸泡1030S0102氯化汞浸泡310MIN，（或1次氯酸钠浸泡1020MIN）灭菌水冲洗35次无菌滤纸吸干分割接种。（四）果实和种子的灭菌表皮有茸毛或蜡质，需在灭菌剂中加入几滴土温80。果实70酒精浸泡数秒0102氯化汞浸泡310MIN，（或1次氯酸钠浸泡1020MIN）灭菌水冲洗35次无菌滤纸吸干分割接种。2、初代培养物的建立（一）无菌环境培养基、接种器械、超净工作台、接种室环境、抗生素物质（去除侵入组织内部的病2727菌。见表）（二）规范操作操作技术熟练、工作经验、操作者、进入超净工作台的物品表面。（三）条件合适培养基种类、激素种类和浓度、其他添加物、外植体来源、生长发育状态、培养条件。3、形态发生和植株再生建立的无菌培养物在适宜的离体环境中，生长发育（形态发生）形成完整的小植株。离体材料的形态发生的途径器官发生，体细胞胚胎发生器官发生芽或芽原基起源于培养组织中比较表层的细胞，即外起源。根原基发生在组织较深处，即内起源。两者之间一般没有什么联系，呈现单向极性。胚状体发生极大多数体细胞胚起源于单细胞，形成的胚状体具有双极性，在其发育的早期阶段，在方向相反的两端分化出茎端和根端，其维管组织与母体植物或外植体的维管组织通常没有联系。胚状体维管组织呈独立的Y形。4、外植体形态发生形成完整植株的途径（一）外植体愈伤组织完整植株。具体又可分为三种1、愈伤组织同时长芽和根植株。2、愈伤组织茎根植株。3、愈伤组织根芽植株。4、愈伤组织体细胞胚植株（二）外植体胚状体植株。可从以下几种培养物中产生1、器官上发生。2、愈伤组织上发生。3、游离单细胞发生。4、小孢子发生。诱导胚状体比诱导芽数量多、速度快、结构完整。5、培养产物的观察与记载（一）愈伤组织诱导率产生愈伤组织的外植体数/外植体总数100生长量培养一段时间