【毕业学位论文】（Word原稿）节瘤拟杆菌早期鉴别诊断—PCR检测方法的建立与应用野生动植物保护与利用硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 节瘤拟杆菌早期鉴别诊断 测方法的 建立与应用 of a to of ,II in an of in I 摘 要 腐蹄病是危害反刍动物养殖业发展的重要疾病之一，瘤拟杆菌 (引起牛、羊、鹿等反刍动物腐蹄病的原发性病原菌，为指导疫苗预防需要建立 研究根据节瘤拟杆菌特有保守序列设计引物，利用聚合酶链式反应（ 立了一种简单区分该菌菌群的检测方法。（ 1）比对纤毛蛋白基因相关序列，依据 I， 计了可区分两大菌群的三条引物，其中上游引物共用，下游引物分别对两大菌群特异。（ 2）对可能影响 素进行了较详细的研究，选择了适宜 样离心分离细菌， 21%100 煮沸裂解细菌，离心取上清作模板；用 凝血样，温和裂解红细胞，离心沉淀细菌，以后操作同病样处理。对 3个因素 、引物、 3个水平， 9 个反应组合，选出最佳反应条件， 95 2 分钟； 94 35 秒， 60 30 40 秒 ,70 30 35 秒， 35 个循环； 70 5分钟。 253050物 50系）， 1U（ 30系）， 25系）， 应体系用带有 (敏度最高可检测 30个菌 /30 3）验证引物特异性试验：设计用鹿、牛、羊等健康群体的环境存在菌（鲜粪，圈泥及其 氧培养物）制备模板扩增，用鹿、牛、羊等健康血样制备基因组核酸作模板扩增，及以上模板同时掺入已知节瘤拟杆菌基因组核酸，观察到掺入的扩增阳性，未掺入的直接用上述模板扩增阴性，重复实验，结果一致，证明引物对节瘤 拟杆菌是特异的。（ 4） 有 16个临床病样扩增阳性，其余样品扩增阴性，重复 验，扩增结果一致。向阴性反应体系掺入节瘤拟杆菌基因组核酸，掺入扩增阳性； 20 份临床病样中 13 份直接 样培养物 1例与病样直接 样涂片镜检疑有 样 11 例与病样直接 性结果吻合，表明床病样检测发现采自趾叉皮炎的 16份病样与病样直接 叉皮炎是腐蹄病的初期感染症状，表明 测方法适宜腐蹄病的早期诊 断；用病样对应血清与纤毛抗原琼扩实验，健康动物存在该菌的抗体，表明通过检测血清抗体间接确定抗原的血清学方法受抗体产生消退延迟影响不能区分曾经感染和当前感染的菌型。此外发现制约样部位及病样处理直接影响 进一步验证扩增条带为目标菌序列片段，采用 瘤拟杆菌扩增产物和病样扩增阳性产物测序显示，扩增产物序列一致。 在保证病原采集质量，防止实验操作中交叉污染情况下，本实验建立的 次实验还可区分 I、 清群。可实现对临床初期感染病样中节瘤拟杆菌快速、灵敏、准确的直接检测。 关键词 ： 节瘤拟杆菌， 蹄病 is a of or is a he of to a of I in an of in on of of ,II of to ,to I CR as 0ul 1U 95 24 3560 30 400 30 35570 5of of by of to 00 as by To . CR of to be to CR of of in of in of in to be to be . to of NA t CR is . 0ul at 0 . in a 185or I 23or so;of I (+D or +H) in CR CR of in or EB 0 85303 13 of CR CR CR 13 CR is of is CR is to It a to of in an 录 第一章 引言 . 1 . 1 瘤拟杆菌检测方法研究进展 . 2 离鉴定 . 2 清学方法 . 2 分子生物学检测 . 3 本研究的内容和方法 . 4 第二章 实验材料和方法 . 5 . 5 . 5 . 5 . 5 . 6 . 6 样品采集及处理 . 6 测体系建立 . 7 . 8 . 9 第三章 试验结果 . 10 . 10 . 10 宜退火温度选定 . 10 . 10 敏度 . 10 物特异性 . 10 床病样检测 . 11 . 11 . 12 测结果 . 13 样 应的可重复性 . 14 . 14 . 15 第四章 讨论与结论 . 18 . 18 . 18 板制备方法 . 18 . 18 . 19 . 19 床病样检测 . 20 样的 . 21 . 21 . 22 参考文献 . 23 附 录 . 27 致 谢 . 33 作者简历 . 34 V 图表索引 表 1 环境样品不同处理的 果 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 不同方法 对临床样本的 检测结果 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 第二次临床病样诊断结果 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 临床病样 出率 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 测与临床病样涂片对应关系 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 临床病样直接或其培养物的 出率 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 临床病样 测方法的符合率 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 蹄病动物血清纤毛抗原琼脂扩实验 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 测阳性病样涂片中的疑似节瘤拟杆菌 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 退火温度探测电泳图片 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 退火温度探测电泳图片 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 验电泳图片 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 F 型的灵敏度实验 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 血样 应电泳图片 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 坏死杆梭菌等菌株 应电泳图片 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17 图 9 第二次病样直接 泳图 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 第二次病样直接 性病样掺入实验电泳 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 环境培养菌及阳性临床病样 应电泳图片 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11 病样 应电泳图片 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30 图 12 病样 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13 环 境 培 养 菌 应 电 泳 图片 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14 环境培养菌 应电泳图片 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15 环境培养菌掺入 酸 应电泳图片 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31 图 16 环境培养菌 应电泳图片 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17 病样 应 电 泳 图片 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18 病样 应电泳图片 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19 病样同时掺入 酸 应产物电泳图片 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32 图 20 病样 应产物掺 入 酸再扩增电泳图片 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33 图 21 厌氧运送后 氧培养物 物 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33 图 22 石蜡油密封 养物 物 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33 中国农业科学院硕士学位论文 引言 1 第一章 引言 究的意义及 目的 腐蹄病是由多种细菌联合感染引起的，以蹄部炎症为主要特征的高度接触性传染病，该病多发生在炎热潮湿的季节。目前从腐蹄病病样已分离出：节瘤拟杆菌、坏死梭杆菌、变形杆菌、螺旋体及其它化脓性细菌 22、 27、 28、 42、 52、 54、 56。进一步研究发现，节瘤拟杆菌可分泌弹性蛋白酶，在炎热潮湿条件下，反刍动物蹄部软化，这类弹性蛋白酶会分解软化蹄角质，造成蹄部浅表炎症，为其它细菌的侵入打开通道，因而确认节瘤拟杆菌是腐蹄病的原发性病菌 23、 24、55 。 节瘤拟杆菌 (引起牛、羊、鹿等反刍动 物腐蹄病的原发性病原菌，该菌于 1938年首先于患腐蹄病绵羊的病灶中发现，伯杰氏系统细菌学手册中， 属拟杆菌科（ 杆菌属 (光学显微镜下观察，细菌一端，两端或多处膨大若结瘤，平直或略弯曲的革兰氏阴性杆菌， 1 3 6织或培养呈多形态；活体呈翻转运动，电镜下可观察到周生纤毛。该菌为专性厌氧的革兰氏阴性杆菌，生长缓慢，需要有蹄粉的培养基上才可生长。在雨量中度、洼地放牧、气温适宜时，节瘤拟杆菌繁殖并分泌弹性蛋白水解酶水解软 化的蹄角质蛋白。菌株的毒力愈强，弹性蛋白酶的分泌能力愈强；引起羊、牛蹄部发病，发病初期出现趾叉皮炎，蹄冠红肿，进而蹄脓肿，动物表现为跛行，导致反刍动物生产力严重下降。节瘤拟杆菌离开动物组织后，不能在自然界长期生存，只能保持毒力数天；它仅存在于感染蹄，可在其中保持活力数月，易造成反复感染，这也是腐蹄病难以消灭的原因之一。节瘤拟杆菌与坏死梭杆菌协同作用可导致恶性腐蹄病，发病率、死亡率增高。对我国反刍动物腐蹄病流行病学初步调查表明，其发病率在 8% 20%，羊的发病率较高 。国内部分地区调查表明，在降水量中等偏高，低洼地放牧地区腐蹄病易发生，发病高峰集中在夏季和秋初；五月份气温回升，放牧牛、羊开始零散发病， 6月初开始大量发病，群发病率在 20 %以上，有的高达 80%； 9月份气温下降时，发病率也随之降低。节瘤拟杆菌存在多个血清型，在全世界范围内分布不一，一个动物群体内可能存在该菌的多个血清群。目前腐蹄病已成为危害反刍动物养殖业发展的重要疾病之一，世界许多畜牧业发达国家也将此病作为重要的传染病进行防治。 由于腐蹄病呈慢性经过，早期不易发现，滥用抗生素使病原菌产生耐药性，导致药物治疗 收效甚微；随着腐蹄病免疫防制研究的突破，针对腐蹄病主要流行型的全菌灭活苗和菌体亚单位疫苗已研制成功并推广使用，有效地控制了腐蹄病的流行。节瘤拟杆菌流行病学调查发现，不同地区流行不同血清型，同一地区不同时期出现不同的血清型，一个群体同时存在多个血清型，甚至一份病样中可分离到多个血清型 25、 38、 65。对病原体进一步研究发现，纤毛蛋白可发生变异，不同血清型的纤毛蛋白亚单位基因间可进行重组而产生新的血清型 38、 41、66 。目前控制反刍动物腐蹄病较有效的方法是疫苗免疫接种，由于腐蹄病病原 节瘤拟杆菌血清型 较多，各血清型之间交叉免疫差，使用主要流行型疫苗才能收到较好效果，因此各地中国农业科学院硕士学位论文 引言 2 区进行腐蹄病免疫接种前需要了解本地区的流行血清型。为快速确定某地区流行的菌型，提高疫苗预防效果，应建立节瘤拟杆菌快速特异的鉴别和分型方法。 瘤拟杆菌检测方法研究进展 离鉴定 采集病样，进行病原菌分离培养及分离菌株生理生化鉴定，是确诊 腐蹄病的 最基本方法，目前该方法仍是 腐蹄病病原学研究的常规技术。同时 分菌株的毒力需要依靠生物学方法鉴定。由于腐蹄病病原节瘤拟杆菌培养条件苛刻因而 分离较困难 ； 鉴定工作繁琐耗时，需要花费至 少两周的时间，才能确定细菌属种。同时病原分离鉴定不能进行流行型调查。目前病原分离鉴定临床意义不大。 清学方法 许多学者进行了节瘤拟杆菌血清学检测方法的探索。菌体外膜蛋白抗原、纤毛抗原检测血清中节瘤拟杆菌的抗体是腐蹄病病原流行型调查常用的血清学方法。国内外学者相继建立了 管凝集试验、琼脂扩散试验、对流免疫电泳、 方法检测发病群体中血清抗体 25、 32、 36、 46、 50、 58、 60、 61 。针对菌体不同抗原成分建立了 用杂交瘤技术 制备菌体不同抗原成分的单克隆抗体，可对分离菌株进行细致分型。 通过对菌体免疫保护性成分的研究发现，一种热不稳定血清型特异的表面抗原或 59，这种抗原具有凝集反应性质，易于脱落；结合菌体结构的显微观察，确定这种抗原是纤毛蛋白。研究发现各型菌株纤毛蛋白具有不同的抗原性，交叉反应较小，纤毛蛋白研究为节瘤拟杆菌的鉴定和分型奠定了基础。 K 凝集试验用于检测血清中节瘤拟杆菌抗体及血清分型，该方法特异性较强，但敏感性差 32，目前主要用于新分离菌株的血清分型。利用多个血清型节瘤拟杆菌标 准菌株制备抗原建立了琼脂扩散试验用于检测不同菌株的混合感染。对流免疫电泳较琼扩所需时间更短。采用节瘤拟杆菌的细胞质膜、脂多糖、外膜蛋白（ 理提取）、分泌性蛋白酶四种不同抗原成分建立 现外膜蛋白（ 理提取）为抗原的 鉴别发病群体是否被 属特异性较好 61； 9、 34特异性最强 ,但敏感性差，在动物人工感染两周，发展为蹄严重病变时，检出率可达 90%以上，但 能区分发病个体曾经感染 和当前感染产生的抗体。 血清学方法操作简便，在 于 且抗原、抗体制备技术较烦琐，在检测方法的特异性和灵敏度方面需要提高。 节瘤拟杆菌引起动物局部浅表损害，病程缓慢，机体抗体反应延迟，抗体产生量少，血清学检测抗体的方法在时间和敏感性上受到限制。该菌属严格厌氧菌，营养要求苛刻，部分培养基需要进口，价格昂贵；另外菌体生长缓慢，产生纤毛蛋白的量不稳定。制备纤毛分型抗原技术要求高，如纯度不够，血清学检测特异性就会降低。自然感染痊愈后，该菌可 在损伤部位存在数月，获得对某一菌型免疫力的个体，被该菌其它菌型感染的血清学检测常常呈现多个血清中国农业科学院硕士学位论文 引言 3 型；作为分型依据的纤毛抗原在自然状态下存在重组变异 38、 41、 65 ,为血清学方法确定当前主要流行血清型增加困难。因而建立病原菌节瘤拟杆菌的早期检测方法是非常必要的。 分子生物学检测 随着分子生物学技术的发展， 检测获得了进一步的发展，相继建立了单克隆抗体杂交技术、核酸探针杂交技术、 16S 于菌株鉴别、分型以及毒力菌株鉴定。 采用分 子生物学技术， 制备了 毛蛋白的单克隆抗体，采用术 对分离菌株开展细致的菌株分型 35、 50、 53、 63。 基因组和大量功能基因被分离和鉴定，尤其作为血清学分型依据的纤毛蛋白基因研究报道较多，并且已有大量的纤毛蛋白基因序列发布，为利用核酸技术进行 过比较 选特异性序列制备基因探针进行病原检测与分型。目前已有报道采用分泌性蛋白酶特定基因序列为核酸探 针，通过 交进行 45、 49、 57。 16S 因也用于探针制备对分离菌株进行基因分型。 根据不同菌株某一基因序列的比较，找出群特异性序列设计引物（引物序列保守），建立广泛用于 44、 47、 48、 57。依据病原菌种特异性的 16S 43 ，已用于直接检测病样中的 据病原外膜蛋白、16S 用 法扩 增片段并进行酶切片段长度多态性分析，发现分离菌株酶切图谱可分为有限的种类，该方法可用做菌株分型 33、 64。通过纤毛蛋白和相应基因序列比较分析，发现各血清型纤毛基因序列存在保守区 37、 51 ；依据保守区设计引物，建立多联组合 39、 40，将血清分型与基因分型结合起来，直接检测病样中的 确定血清型；其中以澳大利亚悉尼大学 P 等设计的血清群特异多联组合 30；美国林肯大学 设计的单管多联 物来 扩增不同血清型的纤毛蛋白基因可变区，结合反向斑点杂交技术进一步可确定每个菌群中存在的亚型67。 术优势还体现在对病样中存在的非目标菌无反应，不存在血清学检测时常见杂菌非特异性干扰问题，可用于 实验室对新分离菌株的鉴别和分型提供了一种快捷的方法，可快速检测生产纤毛抗原的转基因菌基因转移是否成功及转基因菌的遗传稳定性。 细菌核酸序列信息资源的积累，为利用菌种核酸序列鉴定与分型提供了广阔的途径。在诊断腐蹄病时，由于坏死梭杆菌能与节瘤拟杆菌协同感染引发恶性化脓性腐蹄 病，因此设计有节瘤拟杆菌与坏死梭杆菌单管多联 病原基因序列检测与血清学检测方法相比，基因序列的检测可避免蛋白表型发生变异的影响，选择病原基因序列的保守区设计引物建立 病样中存在的非目标菌无反应，不存在血清学检测时常见杂菌对目标菌检测的干扰，检测特异性强；另一方面，采用血清学方法对节瘤拟杆菌进行检测和分型，周期较长，而 术具有快速、特异、敏感等特点， 敏度高，可实现腐蹄病病原菌的鉴别诊断和早期检中国农业科学院硕士学位论文 引言 4 测，因此 采用 本研究的内容和方法 由于纤毛蛋白是菌体的主要保护性抗原，是血清型分群的依据，因而针对纤毛蛋白开展的工作较多，对纤毛蛋白亚单位核酸序列数据的比较分析 37、 51 研究，为多种目标设计的 前为止 检索 血清群 A、 B、 C、 D、 E、 F、 G、 H、 I、 M66归类来自不同菌株的纤毛蛋白基因序列被测序和注释，进入核酸数据库，丰富了纤毛序列的核酸序列 数据，为通过序列比较分析，准确设计保守性引物，开展 P 分别用 功进行了 3167，说明利用纤毛基因序列建立 在我国，建立在基因基础上的腐蹄病快速诊断尚未见报道。目前 、 B、 C、 D、 E、 F、 G、 H、 I、 血清群下又分出许多血清型，亚型，对不同地区开展流行型普 查，陆续发现新的血清型和亚型。由于各血清型纤毛蛋白的基因序列存在差异，因而要想快速、全面的了解某一地区流行的 清型，建立 试验拟用已知纤毛蛋白基因序列，经同源性序列比对，找出同源性高的序列并归类，设计每群的保守引物建立 行 清群流行病学调查，为实验室对新分离菌株的群确定提供了一种快捷的方法。 中国农业科学院硕士学位论文 实验材料和方法 5 第二章 实验材料和方法 料 株及环境菌群 节瘤拟杆菌（ 实验室保存）； 坏死梭杆菌 、 气荚膜梭菌 ，（本实验室保存），铜绿假单胞菌（购自中国医学微生物保藏中心），产气荚膜梭菌 源）、产气荚膜梭菌 源）（购自中国兽医药监察所），变形杆菌（购自中国医学微生物保藏中心）； 肠菌群、土壤菌群、水体菌群（从反刍动物新鲜粪便，圈泥，环境水体分离或培养得到）， 口腔菌群（人口腔分离或培养得到）。 样 鹿、牛、羊 剂与主要仪器： 改良 养基 :8g,酵母提取物 5g,精氨酸 胱氨酸 蛋白胨 10g,用 1调到 21灭菌 200 备用。 厌氧菌运送培养基： 脂 50馏水后，冷至 50加入 天青 125121灭菌 20 分钟，备用。 10 1 220 2 100: 100 2100: 100 0 1 10 750 5 ),200 上样缓冲液： 溴酚蓝 加双蒸水 10 500入已溶解的溴酚蓝溶液中，摇匀定容至 100 0度 10mg/ 50 2427 100容至 1L。 美公司）， ， 蛋白酶 K（ 冻 离心机， 534X 和 国农业科学院硕士学位论文 实验材料和方法 6 血细胞记数板， 厌氧罐（沈阳医疗器械厂）， 三恒多用电泳仪 北京市六一仪器厂 ), 凝胶紫外分析