【毕业学位论文】（Word原稿）玉米黄早四基因组细菌人工染色体文库的构建生物化学与分子生物学硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 硕士学位论文 玉米黄早四基因组细菌人工染色体文库的构建 of i of i 中国农业科学院硕士学位论文 摘要 2 摘 要 玉米是我国主要的粮食作物之一，随着社会的发展和环境的变化，我国玉米生产受各种逆境胁迫如盐碱、干旱、低温、病虫害的影响日趋严重，而我国目前现有大多数玉米品种对逆境胁迫适应性不强。因此，培育新的具有优良抗逆性的玉米品种尤为关键 . 目前我国传统杂交育种进展缓慢，鲜有优良品种出现。而随着转基因技术的飞速发展，基因工程辅助育种取得了传统、常规育种难以达到的效果和效益，并且应用日益广泛。因此，利用基因工程手段，分离玉米抗逆相关基因，并转化为优良的抗逆品种是改善我国玉米育种与生产现状的有效途径。 黄早四是我国育种界公认的最优秀的中早熟玉米自交系，它具有配合力高、植株紧凑以及综合农艺性状好的突出特点，因而被广泛利用。黄早四的育种利用率最高，其改良系数目超过了国内外任何一个自交系，用其组配的玉米杂交种数目和累计推广面积超过了任何一个国内育成及国外引进的亲本系。黄早四的选育成功对我国玉米育种和生产做出了巨大的贡献。 本研究以优良玉米自交系黄早四为材料构建了基于其基因组的细菌人工染色体文库。该文库以单克隆形式保存，包含约 153,600 个克隆子。通过对随机选取的 300 个 隆插入片段的分析表明：该文库平均插入片段约 92组率 98%，空载率 2%。该文库细胞器污染少，稳定性好，覆盖了玉米基因组的 。在此基础上，本研究 将 隆制备成高密度膜， 采用抗逆相关的 探针 标记对 高密度膜进行菌落原位杂交的方法对 该文库进行了初步筛选， 初步 得到了 一些 阳性克 隆 ，这些结果有待于进一步分析和研究 。 本研究 通过对重要玉米品种黄早四的 库的构建， 为我国主要玉米品种的基因组研究以及抗逆相关基因的分离搭建了一个技术平台 ，并对抗逆基因的分离作了初步的探索。这对我国的玉米优良品种的培育和玉米生产有着非常重要的意义。 关键词 玉米， 黄早四 ， 细菌人工染色体文库 ， 抗逆基因中国农业科学院硕士学位论文 is of in of of of is by as of in to So it is to of By in in By of t So it is an to to of i is as in It As a it i to We a in on of i is a 53,600 by 00 28% % is It .6 on we by of AC i, a of on we a is of 中国农业科学院硕士学位论文 目录 4 目 录 摘 要 . 2 . 3 目 录 . 4 英文缩略表 . 6 第一章 绪论 . 7 国玉米育种与生产的发展情况 . 7 国玉米育种生产概况及所面临问题 . 7 物技术在玉米育种工作中的应用 . 8 米优良自交系黄早四 . 8 早四在玉米育种与生产中的重要地位 . 9 因工程方法分离基因 . 10 菌人工染色体文库的研究进展 . 11 片段基因组文库的发展 . 11 库的发展 . 13 库的常用分析方法 . 16 库的应用 . 16 题意义及技术路线 . 19 题意义 . 19 术路线 . 20 第二章 材料与方法 . 21 验材料 . 21 试材料 . 21 体与菌株 . 21 要实验试剂及配制方法 . 22 验仪器 . 28 验方法 . 29 纯度、高分子量细胞核 制备 . 29 片段 获得 . 30 片段 载体的连接与转化 . 32 大批量转化、挑菌、存储 . 33 库的保存与复制 . 33 库的检测 . 34 插入片段的检测 . 34 隆稳定性的检测 . 35 其它细胞器对 库污染状况的检测 . 35 库的杂交 检测 . 37 交探针的制备 . 37 密度杂交膜的制备 . 38 密度膜菌落原位裂解 . 39 中国农业科学院硕士学位论文 目录 5 密度膜与探针的杂交 . 39 性克隆的鉴别 . 39 第三章 结果与分析 . 40 效 库构建技术体系的建立 . 40 米黄早四高质量大片段 制备 . 40 分酶切用量的确定和大量酶切 . 40 片段 析袋回收后的浓度检测 . 41 接产物的转化 . 42 库插入片段大小的检测 . 43 定性检测 . 43 测 否有细胞器污染 . 45 库的杂交 检测 . 46 交探针的制备 . 46 交探针与高密度膜的杂交 . 46 第四章 讨论 . 47 库的构建 . 47 分子量 块的制备 . 47 块 酶切 . 47 切产物的回收 . 47 接及转化 . 47 库的保存 . 48 库的鉴定 . 48 库插入片段大小检测 . 48 定性检测 . 48 染的检测 . 48 库的覆盖率 . 48 库 的杂交 检测 . 49 第五章 全文结论 . 50 米黄早四 库的构建 . 50 库的杂交检测 . 50 参考文献 . 51 致 谢 . 55 中国农业科学院硕士学位论文 英文缩略表 6 英文缩略表 英文缩写 英文全称 中文名称 菌人工染色体 血清白蛋白 蒸去离子水 甲基 甲 酰胺 氧核搪核苷三磷酸 硫苏糖醇 EB 化乙锭 二胺四乙酸 HB 浆缓冲液 NA 分子量 丙基硫代 熔点 乙二醇 冲 电 场 凝胶 电泳 甲基磺酞氟 二烷基硫酸钠 准柠檬酸盐溶液 43 吲哚 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 7 第一章 绪论 国玉米育种与生产的发展情况 国玉米育种生产概况及所面临问题 我国是世界三大 “玉米带 ”之一，玉米产量和消费量都仅次于美国，居世界第二位。玉米是我国的第二大粮食作物。 1949 年我国玉米种植面积 为 1, 总产量为 1,吨，单产为 2005 年种植面积为 2,641 万 总产量为 13,450 万吨，单产为5,100kg/过了小麦，仅次于水稻，居第二位 1。 现代玉米育种的主流是杂交优势育种，基本途径是先选育纯合的亲本自交系，再将亲本自交系杂交，选育出杂种优势强的杂交种。 玉米最主要的特征是天然异花传粉，天然授粉群体的田间组成处于高度的异质状态，个体基因型处于高度的杂合状态，这决定了在玉米天然授粉的群体中，株间表现型比较的意义不大，必须通过一定 的基因型选择过程才能正确地决定取舍；同时由于个体基因型高度杂合，造成表型选择不可靠，必须对大量个体做测交或后代鉴定才能确认表型是否真实遗传 2。由于这些特点，造成了玉米育种的以下两个特殊性： 1) 育种过程较长：它包含分离筛选自交系和组配鉴定杂交种两个步骤。要使众多杂合的基因位点经过自交分离和选择获得大多数有利基因位点达到纯合或基本纯合的的自交系，通常需要 6。要对杂交种的生产力和适应性做出较为准确的鉴定，一般需要 3。 2) 从大量材料中分离筛选：由于优异的自交系和突出的杂交组合出现的频率都极低，因此几乎没 有例外，任何一个成功的玉米育种工作都是从丰富的原始材料或种质库中分离大量的自交系，又组配大量的杂交组合进行试验，最后只选出个别优异的杂交种投入生产利用。概括地说，利用丰富的种质资源分离大量的自交系，配制大量的杂交组合，经认真的鉴定筛选，育成少数优异的自交系和强优势的杂交种， 是 国内外玉米育种的共同经验 3。 我国玉米主产区的种质分为瑞德黄马牙 (唐四平头、旅大红骨、兰卡斯特 (金皇后、获嘉白马牙和其他七大类群 4。我国玉米主产区大面积使用的种质基础基本 是以唐四平头、旅大红骨、兰卡斯特、瑞德黄马牙这四个类群为主。其组配模式为 :唐四平头 兰卡斯特 ， 兰卡斯特 旅大红骨 ， 唐四平头 瑞德黄马牙 ， 旅大红骨 瑞德黄马牙，占我国玉米种质的 80%，这也就造成了现有自交系遗传基础狭窄 5。 鉴于以上玉米常规育种中存在的问题，近 10 年来我国玉米单产虽有提高，但幅度不大，效果不明显，品种的抗逆性不全面， 新的优良品种不多， 且遗传基础狭窄和遗传单一化的问中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 8 题日益严重 6。 物技术在玉米育种工作中的应用 随着现代生物技术的迅速发展，植物转基因技术方兴未艾。植物转基因技 术是指利用重组 术、细胞培养技术或种质系统转化技术将目的基因导入植物基因组并能在后代中稳定遗传同时赋予植物新的农艺性状，如抗虫、抗病、抗逆、高产、优质等的植物。植物基因工程育种与其它育种途径相比具有能够定向地培育新品种、创造新类型等优点。常规育种由于受有性杂交亲和性的制约，影响外来基因型广泛利用，而生物技术具有这方面的优势，它可以打破物种界限、克服有性杂交障碍，快速有效地创造遗传变异，大大缩短新品种育成年限 等 。 玉米转基因技术 7主要有： 1) 载体转化技术 玉米主要是农杆菌 粒介导的转化系统。 2) 接导入转化技术 包括基因枪法、 、电击法、超声波法等。 3) 种质转化技术 包括花粉管通道法、子房注射法等。 90 年代中期，转基因技术在玉米育种中得到广泛的应用。自 1992 年起，转基因玉米包括转 因抗螟玉米，转 m 基因抗除草剂玉米和转 因耐除草剂玉米已在美国玉米带大量种植并取得增产效益 8。我国也进行了玉米转基因抗虫的研究，取得了一定的成果 910。随着转基因技术的日趋进步，基因工程辅助育种成为了一种高效、省时的育种方法。 因此，针对我国玉米现状，利用基因工程手段，分离玉米抗逆、高产相 关基因，并利用以上方法转化为优良的玉米品种，丰富我国玉米的种质资源，不失为改善我国玉米育种与生产现状的有效途径。抗逆、高产等优良性状的基因的获得是整个途径得以进行的前提条件，这其中有两个关键所在： 1) 选择何种玉米材料作为目的基因来源：所选玉米材料本身需要有优秀的农艺性状和抗逆性，且 应 在我国玉米育种中 占 有重要地位，具有很强的代表性 。 2) 基因工程方法分离基因：通过最有效的、最实用的基因工程技术进行目的基因的分离，并鉴定基因功能，以便用于转基因操作。 米优良自交系黄早四 自交系选育是玉米育种的重要环节 。 优良自交系的育成是选配优良杂交 种 的基础 11。在我国杂交种的亲本自交系中，自 330、获白、 黄早四这四个骨干自交系占有突出的地位，俗称四大自交系 12。四大自交系组成的杂交种播种面积在 1 万 上的占杂交种面积的 50%左右。近年来，为了改变玉米种质基础狭窄的状况，我国育种工作者 做 了大量工作，利用多种种质材料选育新系。在第三轮全国玉米区试参试品种中，四大系比重已明显减少，仅为第一轮的 1/3， 但 是 还没有出现能够替代 黄早四的优良系。 黄早四是由北京市农林科学院作物所与中国农业科学院作物所于 1975 年共同选育的优良自交系 13，是我国育种界公认的最优秀的中早熟玉米自交系。它具有配合力高、植株紧凑中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 9 以及综合农艺性状好的突出特点，因而被广泛利用。黄早四的育种利用率 是最 高 的 ，其改良系数目超过了国内外任何一个自交系，用其组配的玉米杂交种数目和累计推广面积超过了任何一个国内育成及国外引进的亲本系 14。黄早四的选育成功极大地促进了我国玉米育种和生产的发展，成为我国玉米育种和种子生产中最重要的骨干材料之一，它具有以下突出特点： 1) 配合力高 选育期间的大量测配以及后来的试验证明黄早四的一般配合力高而稳定。如 黄早四与 796、黄 141 等系组配，均表现高产量。黄早四 罗系 3 则是特殊配合力高的一个突出组合 ； 2) 抗病性强 黄早四高抗小斑病，较抗大斑病，因为另一亲本为高抗、抗或轻感大小斑病，所以其杂交种均表现抗病性 ； 3) 综合穗部性状好 黄早四的穗型短粗，呈圆锥形，具有较多的行数、较高的出籽率和较好的结实性，又具有一定的双穗性 ； 4) 叶片上冲、株型紧凑 黄早四具有叶片挺立、叶片数多的株型，且遗传传递力强。黄早四叶片数多、出叶速度快，有利于迅速建成较大的营养面积 ； 5) 生育期适中，适应性广 黄早四属于中早熟类 型，中熟、中晚熟系与之组配的杂交种适于套种或春播；中早熟、早熟系与之组配的杂交种适于夏播。因此，黄早四在春夏播玉米区均可应用。 早四在玉米育种与生产中的重要地位 1) 使我国玉米生产发生了更新换代的变化 据不完全统计，由黄早四组配的杂交种，经省市以上审定委员会审定的就有 42 个，未审定但已应用的有 9 个，没有统计面积的还有 17 个，从 1982 年到 1993 年这些杂交种的累计推广面积达到 亩。从东北吉林到西南四川都有黄早四的杂交种，特别是黄淮海流域的山东、河北、河南、江苏、安徽、陕西这一玉米主产区，黄早 四的杂交种更是主宰了玉米生产，使这些地区的玉米生产发生了更新换代的变化，玉米产量有了很大的提高。从黄早四组合历年种植情况看， 1982 年起就超过 1,000 万亩，以后逐年发展， 1986 年至今历年种植面积均在 5,000 万亩以上，占全国玉米杂交种的 20%可见其在我国玉米生产中的重要性。 2) 开创了紧凑型玉米育种和生产的新局面 黄早四杂交种的大面积成功推广证明了采用紧凑型玉米杂交种，增加种植密度，提高叶面 积 指数，充分扩大光能利用效率，是进一步提高玉米产量的有效途径。有力地推动了我国玉米育种和栽培科学的发展。 3) 丰 富了我国玉米的种质来源 黄早四的选育及其一系列衍生改良系的利用使唐四平头成为我国重要的种质来源之一。 鉴于玉米优良自交系黄早四自身的优良特性以及在我国玉米育种中的重要地位，对其进行基因组学研究，分离其中的优良基因有 着 重大的意义。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 10 因工程方法 分离基因 目前，克隆基因的途径有 2 种：正向遗传学 (反向遗传学 (径。前者是依据目的基因所表现的功能为基础，通过鉴定其产物或某种表型突变而进行的；后者则着眼于基因本身，通过特定的序列或在基因组中 的位置进行。 传统的功能克隆 (于前者范畴，它是根据已知基因的产物反推其核苷酸序列，再据此序列设计探针或引物从 库或基因组文库中筛选克隆 (如玉米组蛋白脱乙酰酶 因的分离 )15，也可以制备产物抗体，从表达载体构建的 库中筛选相应克隆，进而分离目的基因。另外，还有近年来发展十分迅速的表型克隆 (16，例如差别筛选法、扣除杂交技术、 异显示技术、代表性差示分析、抑制性扣除杂交等 17-21。 表 型克隆技术都普遍存在着依赖于 术、重复性较差、假阳性率高、对实验材料要求较高、材料间不能存在过多的差异、结果不便确证等缺点。事实上，上述方法在多数情况下， 由于基因表达产物不清楚，是很难进行相关基因分离的。因此，在大部分基因产物的结构功能未知的情况下，人们不得不从另外的角度去寻求突破。 近年来，反向遗传学的建立，为分离未知产物的基因提供了越来越多的策略和思路。如最常用的基因克隆技术有图位克隆（ 22、转座子标签 (23技术就 是基于反向遗传学原理发展起来的。 转座子标签技术是利用转座子从一个基因座转到另一个基因座引起的插入突变，使插入位置的功能基因失活并诱导产生突变型，从而可以检测突变基因的位置并分离该基因。利用转座子标签技术对尚未发现转座子的植物进行基因克隆时，需要将异源的转座子导入该植物，但由于转座子在不同的植物中转座的频率和活性相差很大，并且需要筛选大量的个体来鉴定转座子突变个体，植物基因组中多拷贝基因的存在还会限制转座子标签技术的应用，因而转座子标签技术的应用范围是十分有限的 24。 图 1. 图位克隆示意图 25 位克隆法，又称定位克隆 (首先由剑桥大学提出，是分离基因的非常有效的方法之一。它是根据功能基因在基因组中都有稳定的基因座，在利用分子标记技术对目的基因进行精细定位的基础上，用与目的基因紧密连锁的分子标记筛选基因组文库，进而构建目的基因区域的物理图谱，再利用所构建的物理图谱通过染色体步移（ 国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 11 步逼近目的基因或利用染色体登陆、跳步和连接等方法最终找到包含目的基因的克隆，并通过遗传转化试验验 证目的基因的功能 (图 1)。 比较而言，图位克隆技术随着相关配套技术的日渐成熟，已成为分离基因的常规方法，并在分离不同的植物发育基因中得到了广泛的应用。 菌人工染色体文库的研究进展 片段基因组文库的发展 大片段基因组文库先后出现了 噬菌体 载体 、 体、 体、 体、 体、 体（表 1）。 表 of 体类型 宿主 载体容量 优缺点 参考文献 噬菌体载体 大肠杆菌 17入片段太小，但具有创造性 1974 体 大肠杆菌 30入片段偏小，限制其应用 1979 体 酵母 350 1000入片段很大，但稳定性差，嵌合率高，转化效率低 1987 体 大肠杆菌 100 300入片段不如 但稳定性好，嵌合率低，转化效率高 1992 体 大肠杆菌 100 300体自身偏大，使文库构建效率偏低 1994 体 大肠杆菌 /农杆菌 100 300借助农杆菌转化植物 1996 体 大肠杆菌 /农杆菌 100借助农杆菌转化植物，转化宿主细胞效率偏低 G， 1999 噬菌体是构建基因组文库中最早使用的克隆载体，其插入片段虽然仅为 20右，但此创造性的工作已为构建大片段文库奠定了基础。 库是以柯斯质粒为载体构建的文库，是一类由人工构建的含有 列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。可容纳 45外源片段，这比 噬菌体载体及质粒载体的最大克隆能力都要强。所以 统已被广泛地应用于植物遗传研究中，以及基因克隆的工作中，而且有些载体经过改造后可以直接转化植物。但是， 库由于其插入片段较小，对于遗传图谱并不密集的高等植物的基因克隆在染色体步移中步移次数太多，因此限制了它的应用。 最早发展起来的真正意义上的人工染色体。在成功分离出复制启动区序列元件26、端粒 27和中心粒 28等几个保持染色体稳定性所必需的作用元件后，人们将它们连于同一线性载体中并引入芽生酵母 细胞中，构建成第一条人工染色体 29。随着酵母高效转化体系的中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 12 建立 30及大片段 冲场电泳的引进， 获得了能够克隆大片段 统，并证明该系统能够用于构建完整的基因组文库。 体系统的插入片段理论上可达2右，能够覆盖完整的基因组。 作为克隆载体系统， 库最大的优点就是可以容纳很大的插入片段，如人的 00物的一般为 100右。然而 统存在着比较严重的缺陷，如嵌合体比例高 31、稳定性差 32、插入片段回收困难 33和转化效率低 34等，这些缺点严重限制了 统的应用。 库 35是在细菌寄主体系基础上发展起来的克隆体系， 隆虽然没有 隆的容载量大，但其有很多优越性 (图 2)： 1) 通过电击的方法将大质粒转化 胞比酵母原生质体转化效率高 10，这样就减少了文库构建所需的 。对于原料有限的 说，这点至关重要； 2) 尽管 体是单拷贝，但其在大肠杆菌中的产量足以应用传统的杂交方法进行文库的筛选； 3) 线性的，由于线性的 剪切力非常敏感，所以从 分离完整 的分困难，而含有插入片段的 象一个大的 ，这极大的减少了对 行操作时可能带来的损伤，而且通过脉冲电泳、 色大大提高了对克隆结构分析的速度 36； 4) 体在大肠杆菌中复制稳定，一般保持低拷贝（ 1 /细胞），因此减少了质粒所携带 段的重组，使外源片段保持稳定 37； 5) 隆中几