【毕业学位论文】（Word原稿）荒漠沙蜥皮肤及皮肤感受器中β-Catenin基因的克隆与定位

兰州大学硕士研究生学位论文 荒漠沙蜥皮肤及皮肤感受器中 因的克隆与定位 1 第一章 前 言 漠沙蜥简介 荒漠沙蜥（ 为鬣蜥科沙蜥属的爬行动物 1。 沙蜥属共有 41 种，是欧亚大陆和稀疏草原常见蜥蜴， 其中我国 就 有 18 种，主要分布于 我国 西北的干旱荒漠 地区 2。 荒漠沙蜥进化出了一系列适应性特征 ， 从而适应干旱环境（ 降水 少 、多风沙尘、 昼夜温差大、 地表多沙 以及 缺少地表水 等 ） 。 不饮水，直接从食物中获得，直肠能够再吸收即将排 出 的粪便中的水 ，排泄尿酸 。皮肤鳞片上具有皮肤感受器， 具有 感知刺激或 吸收 辐射热的功能 3。 爪锐利，趾具栉缘， 有 利于挖沙 并 在沙地行走 。 头大而平，顶眼发达 。 主要食物为各类小昆虫，如蚂蚁，鼠妇 、 瓢虫 等 。 营 卵胎生 ， 夏季活动频繁 (双峰期模式 )，冬季主要在洞穴内冬眠，仅在阳光照射强烈时 才 出来活动（单峰中日模式） 4。 漠沙蜥皮肤及皮肤感受器显微结构 荒漠沙蜥的皮肤由表皮和真皮组成，体表具有鳞片，覆瓦状排列，表皮浅层富含两种角蛋白： 。 这两种角蛋白具有不同的分子量，氨基酸组成，二级构象等 。 角蛋白形成柔软易弯曲的支架层，并且允许鳞片蛋白 保持一定的 柔韧 性 ， 防止水分散失 从 而形成 渗透 屏障。相反， 角蛋白则形成较坚硬的层 次 ，从而使鳞片能够承受 一定的机械 力 5 荒漠沙蜥的真皮 较厚，是由 浅层疏松结缔组织层和深层致密结缔组织层 共同构成 。 真皮浅层中 发现 有 真皮小体结构 3。 在 铰链 区，真皮层较薄 。 另外， 真皮层还含有色素细胞，神经末梢 以 及血管结构。 止期 表皮显微结构 有鳞目爬行类 的表皮具有交替循环脱落 现象 9， 称为 蜕皮周期 （ ，蜕皮周期 由 休止期和蜕皮期 两个时期 共同 组成 。 （1）荒漠沙蜥表皮 处于休止期时主要 包括 6 层结构： 角皮层、 层、 间层和基底层 3。 角皮层和 皮层 是 位于鳞片最外面的薄层 10。 紧接角皮层下面的一层均匀角质化结构 11。 在蜥蜴鳞片的内表面和绞合兰州大学硕士研究生学位论文 荒漠沙蜥皮肤及皮肤感受器中 因的克隆与定位 2 区， 层细胞轮廓不明显，角皮层与 者共同形成蜥蜴鳞片表面的网窝状纹饰。 中层：一般位于 薄的富含 脂类成分的无细胞结构层。 常规染色不着色，苏丹染色呈鲜艳橙色，推测中层富含脂类物质 3。 于中层之下，富含 角蛋白 细丝（中间丝）组成，在表皮细胞中 又 被称为细胞角蛋白 。 蜥 体保持一定的柔韧性。 中间层和基底层： 这两层一起构成生发层， 属于 活细胞层 。 中间层是 由扁平或梭形细胞构成， 基底层由单层立方状细胞 构 成，细胞核 位于细胞的中央部位 。使用 色后， 基底 层细胞核呈 淡蓝色 ，细胞质则是嗜伊红的粉红色。 （ 2）蜕皮期的荒漠沙蜥表皮结构 荒漠沙蜥的表皮更新是一个渐进式的过程，此过程伴随着表皮周期性的产生和损失。 人提出， 蜥蜴尾巴的再生可以诱发其表皮进入蜕皮周期 10。处于蜕皮时期的表皮，主要分为两部分 ： 外表皮 代 和内表皮 代 。 蜕皮期时，外表皮会出现腔隙组织和透明层 。 当荒漠沙蜥发生蜕皮 后 ，进入静止期，荒漠沙蜥会再次形成一个成层样上皮细胞组成表皮。该表皮主要有 5 层结构组成，包括 层、 发层 （图 。 蜕皮周期 分为 两个时期 ，静止期是 ，这个时期细分为 ： 后 1a），完全静止期（ 1b），前 1c）。蜕皮期包括多个时相： 表皮代（ 外 至 内依次为外角皮层（ 外 o)、外中层（ 外 o）、腔隙组织（ 透明 层（ 内表皮代（ 次为内角皮层（ 、 内 i）、内中层（ 内 i）。 图 有鳞目爬行类 蜕皮过程中鳞片表皮组织学 变化 示意图 5。 发层； 底层。 in of of . 兰州大学硕士研究生学位论文 荒漠沙蜥皮肤及皮肤感受器中 因的克隆与定位 3 真皮结构 荒漠沙蜥的真皮位于表皮基底层细胞下方，包括浅层疏松结缔组织层和深层致密结缔组织层， 位于 鳞片下的 疏松结缔组织较厚， 而 在鳞片 铰链 区（ 则 较薄， 此区域 含有 色素细胞， 毛细血管，其他结缔组织细胞以及游离的神经末梢。 真皮浅层含有 大量 的色素细胞， 色素 细胞伸出的树状突起 向外 伸向表皮，并于表皮基膜 处终止 3。蜥蜴是变温动物，需要通过吸取外界温度来提高自身体温 ， 真皮内大量的色素细胞产生的黑色素不仅可以吸收辐射热，还可以使蜥蜴的皮肤呈现保护色，逃避天敌 15。另外 ， 真皮富含血管和神经，具有营养和感受外界刺激的作用 。 肤感受器结构 和功能研究 荒漠沙蜥皮肤感受器（图 皮基本层次和一般表皮一样，但又与之稍有不同： 皮肤感受器表面的角皮层明显可见， 在皮肤感受器的内缩部位， 感觉毛的角皮层与 3。中层直接位于感受器表皮的角皮层之下，可能富含脂类物质。感受器的 所减薄，并向基底层略有延伸。 相比正常皮肤， 感受器属于皮肤的一种衍生结构，因此也存在中间层和基底层，这两层之间的差别主要是细胞形态有所不同。中间层细胞主要呈现单层柱状，细胞核靠近细胞基底面，这种结构符合结构与功能之间的一致性。单层矮柱状或者立方形的细胞则构成了基底层，这些细胞呈现半圆形排列结构，细胞核近似圆形，靠近细胞的基底面，细胞之间界线比较清晰，整个基底层覆盖在真皮 小 体的上部。真皮小体主要由扁平细胞组成，在染色时细胞核着色很深，但胞质着色很浅 。 光镜下，真皮小体与其他组织的界限也非常清晰，呈现圆球状，具有 很强烈的立体感。在非感受器部位的皮肤则不会存在类似于这种真皮小体的结构 4 常城等学者通过对荒漠沙蜥、大壁虎等 爬行类 皮肤感受器的研究 表明 ，皮肤感受器是由 两部分组成： 特殊分化的表皮 和 真皮小体， 因此皮肤感受器 是一种 终端 分化的功能性结构 18后来的研究证实，有鳞目爬行类 皮肤感受器 属于 机械刺激 类型 感受器 20。 2等在研究 角蜥 时指出，圆顶形的鳞片感受器可能具有以下功能： a. 在前进运动中，可以与目标直接接触； b. 定位 蜥蜴身上的蚂蚁 ； c. 掘穴时，确定深度； d. 感觉从土壤以及来自地表的掠 食 者，以及地面降雨的震动。 皮肤感受器所在 凹窝部位的结构比较特殊， 例 如 ， 格状结构和绒毛状突起 存在于凹窝周壁 3， 此外，表皮 缺乏 角质层以及 角质层变薄， 中兰州大学硕士研究生学位论文 荒漠沙蜥皮肤及皮肤感受器中 因的克隆与定位 4 间层细胞含有色素颗粒以及 真皮浅层 含有 色素 细胞这些特点， 因而 推测 皮肤感受器可能 能够 感受 辐射 热。 皮 肤感受器作为较特殊的微皮纹，有学者认为， 皮肤感受器的数目和分布变化在种间 差异 较大，而在种内相对稳定， 因此 具有一定的分类价值 22。据报道，许多有鳞目爬行类的鳞片表面具有感受器结构16对于感受器的功能也存在不同的看法 19， 有关感受器的具体发生过程仍有待进一步的研究。 图 肤感受器模式图 5。 b: 真皮小体 ; c：感觉毛 of . b: c: 行类鳞片与鸟类羽毛起源的研究 进展 目前主要存在两种 假说 涉及到 有鳞目爬行类鳞片与羽毛 的 起源关系， 第一种是 鳞片伸长 后可以 形成 羽毛 23第二种是鸟类羽毛与爬行类的鳞片进化上是非同源的关系 33。 有学者 29提出的假说认为 ， 羽毛的发生 分 为 以下五个过程 ：鳞片伸长 羽枝形成 羽干 形成 羽小枝 和 羽小钩 最后 形成 ，羽毛 的结构分化 完 整 。 中国鸟龙的研究也同样支持了 这一观点，并认为鸟类的羽毛和鸟龙的皮肤衍生物是同源的。哈里斯 等人 30提出， 尾羽基部存在 未分化的 羽片是羽毛形成的基础， 通常未分化的羽片会形成羽片和羽枝， 但是 反鸟类长尾羽 在形成过程中存在一种 特殊 情形 ：尾羽的基部缺少 未分化的 羽片， 尾羽远端 发育成 羽毛 和 羽干 。研究表明 29, 30，爬行类和鸟类 的皮肤衍生物中都含有 疫技术实验结果表明， 表达于 鸡表皮和美洲短吻鳄 （ 表皮中的 此外 ，分析这两者 列 的 结果表明 ， 来源于美洲短吻鳄 爪 表皮 的 段氨基酸序列 是 高度保守 的 ， 同时该蛋白 与鸟类的爪 、 羽毛中 的氨基酸 序列相似 。 哈里斯 等人通过 研究 两类涉及到 鸟类羽毛和鳄鱼鳞片发兰州大学硕士研究生学位论文 荒漠沙蜥皮肤及皮肤感受器中 因的克隆与定位 5 育过程的 信号分子 表达 情况 ， 表明 鸟类羽毛和爬行类的鳞片发育具有相同的祖先31。另外， 荒漠沙蜥皮肤感受器的感觉毛中间部位由 降低 角质化 程度会导致 鳞片的部分区域形成滤泡 结构 32，可以推测 跟鸟类羽毛发育有关的原始滤泡组织来源于此 。 另有学者研究 则 认为 ， 鸟类羽毛与爬行类的鳞片不是同源的。 在羽毛形成的不同阶段（例如基板形成阶段和羽毛发育周期）依赖于 存在 32。存在于 域 内的细胞 相对于皮肤其他部位的细胞， 有丝分裂 能力更强。有趣的是， 域会随着羽毛形成过程中不同的发育阶段而转移，现在研究的比较清楚的机制是， 域在 羽芽伸长 到 羽毛形成过程中会 发生 移位 （图 。 域的转移可以为 羽毛 的进一步 生长和分化 提供物质基础 。 但是直至目前的研究为止，还未在 爬行类鳞片 发育过程中发现 存在 34, 35。 所以 认为 鳞片不能伸长形成羽毛，这些研究为鸟类羽毛与爬行类的鳞片是非同源的这一说法提供了理论支持 。 2002 年哈里斯等 人通过 研究 又提 出 33， 鸟类羽毛和鳄鱼的鳞片在形成基板 时 具有同源性， 而在形成基板之后，羽毛 却 具有 不同的 形态发生机制。 因而推测 ，鸟类羽毛和爬行类的鳞片是非同源的。 图 毛形态发生过程中 域的转移示意图 61。 in of 号通路 研究 进展 号途径是在果蝇和小鼠中首次被发现，目前的研究发现 荒漠沙蜥皮肤及皮肤感受器中 因的克隆与定位 6 信号途径中一些重要的分子具有多重功能。 号通路是研究恶性肿瘤发生过程中的热点问题 。 研究发现 ， 人 源肿瘤发生过程中 号途径活性发生不正常的改变 34 号通路涉及了很多的癌细胞发生过程，如结肠癌，乳腺癌等 。 同时 ， 也涉及到人体很多重要的生理活动，如神经细胞退行性疾病以及细胞凋亡等生理过程。例如，近年来越来越多的研究报告指出， 号通路和细胞凋亡之间存在联系 ， 涉及到 号途径和细胞凋亡的相关基因，在胚胎发育早期就存在协同作用。 号途径在个体发育过程中起着本质的作用， 这是由于 号往往扮演着调控胚胎细胞发育模块化，细胞增殖分化，细胞粘附，细胞凋亡以及细胞存活的角色 。 尤为重要的是通过过表达某些信号分子， 足轻重 作用 37。 号调控了神经板，神经管，脑，脊索以及大量的神经感受器和 运 动神经元的发育 38号途径 除 了参与上述神经系统的发育之外，也参与了听觉系统和心脏系统的发育 41。 2008 年发现， 号调控造骨细胞生理的方方面面，包括骨细胞凋亡过程 42。 号通路调节了包括细胞分化，增殖 /衰老，存活 /凋亡，再生以及伤口愈合等细胞过程。发育生物学 中关于 号通路相关事件以及调节胚胎发育的机制都有相关报道。这条经典的信号通路被 分 为典型（ (赖型）和非典型 两种。信号转导放大途径包括结合 300泌型糖蛋白（ 7次跨膜 体去起始经典和非经典途径信号通路（例如，钙调蛋白 /钙离子信号通路）。这些结果为 白的多功能性，经典和非经典通路都提供了很高的研究价值。 虽然 号通路是通过使 蛋白与同源受体 /辅助受体结合而实现，非典型通路也是会发生的。最近的研究结果表明， 体外包装，可导致依赖于 平的降低或者蛋白酶体的降解。另外，药物性抑制剂 活性，例如，合成的小分子和氯化锂 (以介导依赖号的 号配体的缺失。 号配体的其他受体如 果蝇配体都已有报道 42。 白研究现状 号 转导 途径中的一个下游元件，作为顺式作用因子之一参 于其中，具有重要的作用。 早是 1996 年发现的，后来 表明 是一种多功能蛋白质，是一种相对分子质量约 92 可溶性蛋 白 36。 肽链由 150 个氨基兰州大学硕士研究生学位论文 荒漠沙蜥皮肤及皮肤感受器中 因的克隆与定位 7 酸组成 三个结构域： N 端、 域 ， C 端。各结构域在信号传递过程中分别发挥不同的作用 ， 与多种 蛋白 互相结合从而发挥作用 。 毛囊作为皮肤重要的附属结构之一，在发育初期，起源于胚胎外胚层，毛囊的发育过程受 到 诸如 多种 信号 分子的调控 40。 号 途径在毛囊的发育中 扮演重要角色 。当使用基因突变的方法研究 ，发现当 变发生于胚胎形成期时，毛囊基板的形成被阻断， 而基板是毛囊形成的第一个关键步骤 ，这 种 突变最终 导致毛囊形态 不能正常发生 41, 42。 够锚定肌动蛋白的细胞骨架，传输接触抑制信号，从而导致上表皮细胞停止分裂 43, 44。 能够调控细胞分化，决定细胞的最终 命运，例 通过调控细胞的 生长、凋亡 过程 、 细胞发育的 对称 性以及细胞的 极性 等方式 决定 细胞命运 45。最近的研究报道表明， 肝脏生物学，肝脏发育（包括胚胎期和出生后），肝切除后的再生，肝细胞生长因子介导的肝脏肿大以及肝癌的发生机制中都有重要的作用 46。另外，对于金鱼整个胚胎期中 表达研究结果表明，当 性丧失时，会导致胚胎背部结构的严重缺损和沿前后轴组织发育受阻 ，并会在幼体形成前死亡，说明 胚胎启动和发育的必须的因子之一。 以联接粘连蛋白，并稳定细胞内微丝， 作为上皮细胞间一种重要的粘附分子，当 号被激活后， 够进入到细胞核中，从而 作为核因子调控特定基因表达，最终促进细胞的增殖与分化 47，在毛囊等皮肤附属物 48, 49 61及许多器官形态发生中具有重要作用。 0等人以家鸡为实验动物的结果表明， 与了上皮形态发生的调节，当 鳞片中过表达时，皮肤附属 物 的表型活性也随之增加 ，从而使鳞片转变成羽毛。家鸡 鳞片主要有三种 类型，分别为 盾鳞、小盾鳞 和 网状鳞， 前两种鳞片 的结构比较类似，外表皮主要由 表面和铰链 区 ， 而网状鳞只表达 过给鸡后肢注射 果表明，过表达 活了存在于鳞片表皮中某些特定区域的干细胞，使其分化生长为羽毛。 因此，本实验中，采用免疫组织化学方法检测 荒漠沙蜥皮肤及其皮肤感受器中的表达水平，利用原位杂交方法进一步确定 细胞内的分布和定位。 我们寄希望通过荒漠沙蜥皮肤及皮肤感受器中 够为有鳞目爬行类鳞片的形态发生，以及和鸟类羽毛的起源进化 关系 提供一定的实验参考。 兰州大学硕士研究生学位论文 荒漠沙蜥皮肤及皮肤感受器中 因的克隆与定位 8 第二章 实验材料与方法 验动物 实验动物 荒漠沙蜥 采自内蒙古阿拉善左旗的 （ 图 饲养于实验室人工仿沙地环境，用于免疫组化和原位杂交实验时，尽量选择处于蜕皮期或者经过伤口愈合的沙蜥。 图 漠沙蜥 ， 采自内蒙古阿拉善左旗荒漠 。 验仪器 恒温水浴锅（常州国华电器有限公司）； 真空干燥箱（上海 一 恒科技有限公司） ； 动 高压蒸汽锅（上海三申医疗器械有限公司）；速 冷冻 离心机（上海安亭科学仪器厂）； 脱色摇床（海门市其林贝尔仪器有限公司）；容声冰箱 ； 免疫组化笔（中杉金桥生物技术有限公司）；普通光学显微镜（麦克奥迪股份公司）；防脱磨砂载玻片（武汉博士德生物工程有限公司）； 光显微镜； 自动旋转式石蜡切片机（麦克奥迪股份公司）； 定时恒温磁力搅拌器 ； 石蜡切片机专用刀片（德国莱卡）； 电泳仪（北京六 一 仪器厂）； R 凝胶成像系统（美国 司）； 定时恒温磁力搅拌器；电热恒温培兰州大学硕士研究生学位论文 荒漠沙蜥皮肤及皮肤感受器中 因的克隆与定位 9 养箱； （美国 司）；解剖工具（剪刀、镊子等） 验 主要试剂 （ 1） 4%多聚甲醛固定液 （ ： 表 1 4%多聚甲醛固定液配方 4% 剂 含量 多聚甲醛 4 g 双蒸水 80 表 1 称取 4 g 多聚甲醛 （通风橱中操作） ，加入 80 蒸水中， 加热 至65并磁力搅拌 ，直至 成为乳白色悬液 ， 用 1 M 的 节 呈清亮状，再加入 10 0充分混匀， 定容至 100 再检查 过滤后 4保存备用。保存不超过 一 周，最好现配现用。 （ 2） 爱氏 （ s）苏木精染液： 表 2 苏木精染色液配方 剂 含量 苏木精 2 g 冰醋酸 10 油 100 5%酒精 100 酸铝钾 5 g 蒸馏水 100 取表 2 中各项试剂，按如下步骤配置： a 将苏木精溶于少量酒精中，加冰醋酸后迅速搅拌，加速其溶解； b 加入甘油及其余酒精； c 将加温的钾矾溶液一滴滴地加入， 并使用玻璃棒 不断搅动； d 瓶口用双层纱布包扎，置于 阳台通风处 ， 使其慢慢氧化成熟 ，直到颜色变为紫红 ，即成为母液。 成熟时间约需2以致数月 ，使用前需要过滤 。已成熟的 母 液用瓶塞 密封，置于低温暗处长期保存。使用时以原液 1 份加入 50%酒精与冰醋酸等量混合液 1 份或 2 份。 （ 3） 1%盐酸乙醇 分化液 ： 1 盐酸加入到 100 0%乙醇中。 （ 4）中性树胶封片剂 （ 5）梯度乙醇 ： 浓度分别为 50%、 70%、 80%、 95%、 100% （ 6） 1/2 乙醇 1/2 二甲苯混合液：纯乙醇：纯二甲苯 =1:1 兰州大学硕士研究生学位论文 荒漠沙蜥皮肤及皮肤感受器中 因的克隆与定位 10 （ 7）二甲苯溶液 （ 8）鳞片状切片石蜡（熔点为 57 ） （ 9） 冲液，配制如表 3： 表 3 冲液的配 方 剂 含量（ g） 10） 红染液 ： g 伊红溶解于 50 0%乙醇中。 （ 11）一抗： ； 二抗试剂盒 ： 兔抗人 疫组化试剂盒 ； 色试剂盒 （武汉博士德生物工程有限公司 ） 。 （ 12） 碳酸二乙酯（ 100 蒸水 中加 1 床室温下处理 12 h， 高温高压灭菌处理，使溶液中的 活。 （ 13） （ 14） 70%、 85%乙醇：用 理过的水配制。 （ 15） 0.5 置： 表 4 0.5 方 0.5 剂 含量 g 蒸馏水 100 0 馏水中加入 g 水浴锅中加热至大约 60使其完全溶解，同时使用 粒中和直至溶解，加蒸馏 水定容至 100 （ 16） 10 mg/B 贮存液 配置 ： 表 5 10 mg/B 溶液配方 10 mg/B 剂 含量 溴化乙锭 （ 200 馏水 20 取 200 B 固体于专用容器中，加入 20 ml 完全溶解后转移至兰州大学硕士研究生学位论文 荒漠沙蜥皮肤及皮肤感受器中 因的克隆与定位 11 棕色瓶中， 4避光保存。（注意： 强致癌物，带双层手套操作） （ 17） 聚赖氨酸： 用移液管将少量三蒸水加入多聚赖氨酸的小管中（ 25 然后将溶解的多聚赖氨酸加到 200 终体积达到 250 滤除菌分装于小瓶中，保存于 （ 18） 0液配方： 表 6 0液配方 0剂 含量 4 g 0.5 0 酸 27.5 g 蒸馏水 100 取 54 g ， 27.5 g 硼酸，加入 0.5 0 用酸度计测量 用 节至 容至 100 4 保存。 （ 19） 体培养基： 表 7 体培养基配方 LB 剂 含量 胰蛋白胨 2.5 g .5 g 酵母提取物 g 蒸馏水 200 取表 7 中各成分，加热熔化 ， 定容至 250 用 1 个过程使用玻璃棒不停搅拌 ， 高温高压灭菌。 （ 20） 态 培养基： 表 8 体培养基配方 LB 剂 含量 胰蛋白胨 1 g g 琼脂 1.5 g 酵母提取物 0.5 g 蒸馏水 100 州大学硕士研究生学位论文 荒漠沙蜥皮肤及皮肤感受器中 因的克隆与定位 12 称取表 8 中各成分，加热熔化， 使用 1 容至 100 压灭菌 20 ，待液体冷却到 55左右加入氨苄，摇匀后立刻倒板 。 （ 21） 3% 30% 释 10 倍，现配现用。 （ 22）蛋白酶 K（ 1 g/于 0.1 50 （ 23） （ 24） T （ 25） NA NA （ 26） 胶回收试剂盒和 粒 量试剂盒（ （ 27） 制性内切酶， 制性内切酶（ （ 28） 10（ （ 29）原位杂交试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司） （ 30） 0.1 表 9 0.1 液配方 0.1 剂 含量 g 蒸馏水 100 g 于 100 馏水中，高温高压灭菌。 （ 31） 100 mg/液配方 ： 表 10 100 mg/液配方 0 100 mg/mp 剂 含量 g 蒸馏水 10 g 入 10 ml ，用 m 滤膜过滤除菌， 保存备用。 （ 32）预杂交缓冲液（ 40 50% 去离子甲酰胺 20 50% 4 （ 33） （ 100 10 100 150 州大学硕士研究生学位论文 荒漠沙蜥皮肤及皮肤感受器中 因的克隆与定位 13 6 2O 84 （ 34）封闭液： g 末加入 1 中，沸水中加 热约 30 分钟，期间不停的剧烈摇晃，直至完全溶解，现配现用。 （ 35） 1加入 0 配成。 （ 36） 2 别用 2 表 11 2准柠檬酸盐溶液配方 1 2剂 含量 .8 g 柠檬酸三钠 4.4 g 2O 500 37） 置： 表 12 方 2 剂 含量 0 g .2 g 纯乙酸 2O 1000 取 0 g， .2 g，纯乙酸 2O 定容至 1000 （ 38） 20%甘油： 20 油加 入到 80 理过的蒸馏水中，加到湿盒中。 验方法 漠沙蜥皮肤切片苏木精 色） （ 1）蜡块制作： 取活体成年沙蜥 ， 乙醚麻醉 后 ，自来水 彻底 冲洗 干净 ，迅速切取蜥体背部皮肤，修剪成 约 1 .5 方形块。将切取好的皮肤固定于 4%多聚甲醛 (定液中 12 h 后，流水冲洗 1 h 左右，洗去表面残留的固定液。 低浓度乙醇到高浓度乙醇脱水处理（ 50%， 70%， 80% 梯度乙醇中脱水各 1兰州大学硕士研究生学位论文 荒漠沙蜥皮肤及皮肤感受器中 因的克隆与定位 14 小时， 95%， 100% ， 100% 乙醇中各 40 更换 乙醇时，需用滤纸将组织以及培养皿中的残留乙醇彻底吸干；乙醇二甲苯等比例混合液 25 甲苯 及二甲苯 中各透明 25 甲苯石蜡等比例混合液 15 溶蜡箱 60 保温 ， 纯 石蜡 及 纯 石蜡 各浸蜡 1 h。 石蜡倒入 事先折叠好的 纸盒中， 迅速夹取皮肤组织放入其中 ， 表层凝固后 ，放入冰水中快速冷凝；将 包埋好的 蜡块修成小正方形， 于石蜡切片机上 7 m 厚度连续切片， 40 水浴展片（ 载玻片使用多聚赖氨酸处理 ）；切片于 37 恒温过夜 烘干后 ， 4 保存备用。 （ 2） 色 二甲苯 及二甲苯 中脱蜡各 15 据室温可以适当延长，直至完全脱蜡）； 100%， 95%， 80%， 70%， 50% 梯度乙醇中各 4 蒸馏水 4 将切片入染色缸内染色 5 右（ 根据 苏木精 的 染色程度而定）， 浸入自来水中洗去多余染色液； 1% 盐酸 酒精 分化数秒 钟，流水 缓慢 冲洗 ， 入蒸馏水片刻， 镜检 观察，至结果满意。 切片入梯度 酒精 中各 4 70%， 80%， 95%） ；切片入伊红染色 液 数秒，然后入 95%、 100% 、 100% 乙醇中各 2 醇二甲苯等比混合液、二甲苯 及二甲苯 中各 5 明 ； 将已透明的切片上滴 加中性树胶，盖上盖玻片，镜检拍照 。 疫组织化学染色（ （ 1）将蜡块修至合适大小（一个载玻片上可展 3材料），切片厚度为 7 m ， 40 水浴展片， 37 烤片过夜，为防止掉片， 60 烤片 2 h，再进行后续操作。 （ 2）二甲苯 及二甲苯 各 15 100%、 95%、 80%、 70% 系列乙醇中各 4 馏水 4 （ 3）热修复抗原：提前高火煮沸 片浸入沸 ，水浴煮沸 5 10 次。 （ 4） 原修复：切片入 3% 温浸泡 15 除内源性过氧化物酶活性，蒸馏水洗 3 次， 10 次。 （ 5）使用免疫组化笔圈 画 材料。 （ 6）滴加封闭液：每个组织上滴加一滴 5% 闭液，室温孵育 20 去多余液体，不洗。 （ 7）滴加一抗：用 5% 照 1： 500 的比例稀释 ，在组织切片上滴加一抗，阴性对照处滴加 湿盒于 4 孵育过夜（ 12h），兰州大学硕士研究生学位论文 荒漠沙蜥皮肤及皮肤感受器中 因的克隆与定位 15 10 次。 （ 8）滴加二抗：材料上滴加生物素 化羊抗鼠（兔） 温（ 25 ）， 30 5 次。 （ 9）滴加 霉亲和素 作液，盖住材料，室温（ 25 ）， 30 5 次。 （ 10）根据用量，将显色液按照 1 入显色液 A， B 各一滴， 充分混匀，滴加到切片材料上，室温避光显色（约 3钟），随时镜检，观察是否有红色阳性结果，至结果满意为止，蒸馏水充分洗涤以终止反应 。 （ 11）苏木精轻度复染 30 s，自来水冲洗， 随时镜检至细胞核着色适宜，明胶甘油封片剂封片。 光显微镜拍照。 位杂交（ In 提取 （ 1）实验器具处理： 所有实验用玻璃器皿及镊子都应于实验前一日置高温 （ 180 ） 烘烤 6 h， 以达到消除 的目的。 实验过程中使用的塑料工具使用 2O 过夜处理，高温高压灭菌后使用。 （ 2）实验步骤 （实验方法参考 ： a切取蜕皮期（或愈合的伤口组 织）荒漠沙蜥的背部皮肤约 25 用事先预冷的玻璃匀浆器进行研磨，每 10织加入 300 l 裂解液 匀浆液转移到一 个 预先 液氮冷却的无 1.5 心管中 。 b 向离心管中 加入 无 90 l 和 10 l， 充分 混匀后孵育 20 56 ） 。 c. 14,000 缓慢 吸取上清， 转移 到 一个新的无 心管中 ， 加入 无水乙醇 （ ， 充分 混匀 后 ，得到的溶液 一 起转入吸附柱中 ，14,000 倒掉 废液 。 d. 向吸附柱中加入 去蛋白液 350 14,000 废液 。 e. 向吸附柱中央加入 80 工作液 （现配现用） ，室温静置 15 接下来再 加入 350 蛋白液， 14,000 倒掉 废液 。 f. 向吸附柱中加入 漂洗液 500 放 于 室温 2 14,000 心 1 掉 废液， 重复此步骤。 g. 14,000 心 2 弃 废液， 放置 室温 5分钟左右 ， 从而 彻底晾干 吸附柱中 的 漂洗液 。 h. 将吸附柱 放 入 一个 新的 无 心管中， 悬空 滴加 30 州大学硕士研究生学位论文 荒漠沙蜥皮肤及皮肤感受器中 因的克隆与定位 16 温静置 3 然后 14,000 离 2 即 获得 到的80 保存，取 2 行 测。 a 引物设计 通过 对几种不同物种 列后，选择了以安乐蜥 来源的 参考模板，共设计了 5 对引物扩增 因序列，只有序列 2 作为 物扩增出了 因 序列，如表 13： 表 13 增引物对 3 列 1 3 5 序列 2 3 3 5 序列 3 3 3 5 序列 4 3 3 5 序列 5 3 3 5 b 反转录过程 合成实验 参考 T 在预先冰浴的无核酸酶的离心管中加入 表 14 中的 反应混合物： 表 14 反转录反应混合体系 4 剂 体积 g 5 2 l l l 70 加热 5 迅速 置于冰 浴 冷却 2 心后， 再加入 以下组分： 5 l l l 兰州大学硕士研究生学位论文 荒漠沙蜥皮肤及皮肤感受器中 因的克隆与定位 17 42孵育 50 95 5 止反应，放置冰上以便进行后续实验 ， 加入反应体系稀释至 终体积 50 l，取 2 l 进行 增反应。 c 应 反转录结束后，按表 15 将各组分 加入到 200 l 应管中，使终体系 为50 l ： 表 15 应体系 5 应成分 用量（ l ） 10 5 10 mM 25 合酶 （ 5 U/l） 列 2 正义引物 列 2 反义引物 菌蒸馏水 入 上表 各 反应 成分 ， 轻柔 混匀，简短离心 后 ，按 以下 条件设定反应程序： 94 2