【毕业学位论文】（Word原稿）虎杖白藜芦醇合酶基因的克隆与表达生物化学与分子生物学硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 虎杖白藜芦醇合 酶基因的克隆与表达 of of 摘 要 白藜芦醇（ 3,45称 一种天然存在的多酚化合物。已经发现花生、葡萄、虎杖等植物中含有 白藜芦醇 。据报道， 白藜芦醇 有着广泛的生物学和药理学特性，如抗癌、抗炎症、心 血管保护等作用。 白藜芦醇 在植物保护中也发挥着重要作用。 白藜芦醇合酶 （ 芪类（ 质合成的关键酶 ,催化一分子 豆酰 三分子 二酰 成 白藜芦醇 。 酸 代谢途径，是控制植物次生代谢产物合成途径中重要的分支点的酶之一。苯丙酰代谢途径几乎存在于所有植物中，而 存在于少数有 植物中，大多数重要的作物都缺乏该基因，因此将 因 转入无 植物 ,可以为该植物提供增强抗真菌侵染的防御体系或增强植物抗逆境胁迫的能力，还能提高一些作物的品质。 本研究利用 ，从药用植物虎杖（ 克隆到了 全长 们将它命名为 从虎杖基因组 克隆到了一个具有全长编码区的 因序列和一个比全长编码区少了 72 因（ 列以及一个含有两个内含子的 因序列。将来自花生 ( 因 (来自虎杖的 核表达时发现， 因与 能正常表达成蛋白，而因在诱导表达时，却未能检测到相应蛋白。植物表达时，用上述三个基因替换掉了面的 因，从而构建了三个植物表达载体 用农杆菌介导法导入烟草品种 经 测表明，目标基因已经转入烟草 ，且在 水平得到了表达 。但通过 藜芦醇 。 关键词 ：虎杖 ， 白藜芦醇合酶 ， 转基因烟草 is a in It is it a of as It is to be a to of in to in of of of of is in is in S. S be to by S in In A RS . A S a a 72 bp as a NA 1 in in in be no be to In in by US in in no be 录 第一章 综 述 . 1 白藜芦醇 . 1 生化特性及其在植物中的分布与存在形式 . 1 生物合成途径 . 1 作为植物雌激素而起到预防癌症的作用 . 2 调节癌症第一、二阶段的酶 . 3 保护心血管系统 . 3 白藜芦醇与炎症 . 4 藜芦醇合酶 . 5 白藜芦醇合酶 的酶学性质 . 5 白藜芦醇合酶 与查尔酮合 酶 . 5 白藜芦醇合酶 基因的诱导表达 . 6 白藜芦醇合酶 基因的转基因研究 . 6 第二章 材料与方法 . 8 材料 . 8 方法 . 9 基本的实验方法 . 9 提取 （ 结合酸酚、高盐溶液与 . 9 一条链的合成 . 9 克隆全长基因 . 10 司的 体亚克隆 . 11 百泰克公司质粒提取试剂盒 . 11 百泰克公司 段的回收 . 12 粘末端 进行基因克隆 . 12 导表达 . 13 蛋白的提取 . 13 镍柱纯化目标蛋白 . 13 蛋白浓缩及分子筛纯化 . 14 泳 . 14 虎杖基因组 提取 . 14 农杆菌感受态细胞的制备： . 15 农杆菌感受态细胞的转化： . 15 含目的基因的农杆菌的鉴定 . 15 根癌农杆菌介导 化烟草 . 15 提取烟草 . 15 9 用 理所提取的 . 16 白藜芦醇的提取 . 16 色谱分析 . 16 第三章 结果与分析 . 17 虎杖 因全长 克隆与测序分析 . 17 法克隆虎杖 因同源片断 . 17 克 隆虎杖 因的 3末端 ： . 18 法克隆基因 5末端 . 19 全长序列 . 19 与来自花生、葡萄、蓼科大黄属的 因以及查尔酮 查尔酮合酶 基因进行蛋白序列比对 . 22 虎杖基因组 白藜芦醇合酶基因同源序列的克隆与 分析 . 24 扩增起始密码子与终止密码子之间的序列 . 24 从虎杖基因组 克隆到比全长编码区缺失了 72序列 . 25 从虎杖基因组 克隆到了含有全长编码区的序列 . 28 从虎杖基因组 克隆到含有两个内含子的序列 . 29 因的原核表达 . 30 将 个基因克隆到 . 30 进行诱导表达、纯化与鉴定 . 33 白藜芦醇合酶 基因的植物表达 . 34 利用 T 载体 行亚克隆 . 34 植物表达载体的构建 . 35 烟草的遗传转化 . 37 检测转基因烟草植株 . 38 检测转基因烟草植株 . 39 检测转基因烟草中白藜芦醇的含量 . 40 讨论 . 41 第四章 结论 . 42 基因克隆 . 42 原核表达 . 42 植物表达 . 42 参考文献 . 43 致谢 . 48 作者简历 . 49 V 英文缩略表 缩略词 中文全称 英文全称 落酸 苄青霉素 6b 羧苄青霉素 椰菜花叶病毒 35S 启动子 5S 六烷基三己基溴化铵 ,4,4 一二氯苯氧 乙酸 2,4碳酸二乙酯 硫苏糖醇 B 溴化乙锭 二胺四乙酸二钠 葡萄糖醛酸糖苷酶 丙基硫代 那 霉素 N 激动素 E 巯基乙醇 乙酸 酸钠 合酶链式反应 端快速扩增 of 福平 转录聚合酶链式反应 二烷基磺酸钠 羟甲基氨基甲烷 B 菌培养基 43吲哚 - 5国农业科学院硕士学位论文 第一章 综述 1 第一章 综 述 藜芦醇 化特性及其在植物中的分布与存在形式 白藜芦醇 （ 称 是一种植物次生代谢产物， 分子式为 对分子质量为 228 25，为无色针状结晶，难溶于水，易溶于乙醇、乙酸乙酯、丙酮、氯仿、二甲亚砜等，有顺、反两种构型，其中反式是稳定结构 （见图一） ，而且生物活性更加广泛，结构式见图一 (胡赕 等， 2005)。 它能保护植物免受病原微生物和草食动物的侵害，是一种植保素 （ 994） 。 它是 1940年首次从毛叶藜芦 (根部 获得的（ 2005）。 白藜芦醇 存在于葡萄 、花生、藜芦、决明子和等天然植物中，到目前为止至少已在 21科、 31属的 72种植物中发现了 白藜芦醇 （ 1997） 。 在一些药用植物中含量较高，尤其是蓼科植物虎杖 白藜芦醇 的含量比花生和葡萄高很多 （ 曹庸 等， 2003） 。 白藜芦醇 常被发现以糖苷（ 3,5,4 - D- 形式存在，见图二（ 2005）。 隆到了一种能将 白藜芦醇糖苷 转变成白藜芦醇的酶，命名为 D - 它水解 -（ 13 ） 2006） 。 图一 反式白藜芦醇 二 白藜芦醇糖苷的顺反两种构型 生物合成 途径 在植物中， 白藜芦醇 是由一分子的香 豆酰 三分子丙二酰 白藜芦醇合酶 (化形成的。 第一章 综述 2 应 (et 992),它的催化步骤如图三所示 (et 999)。 1994)已从葡萄中分离出 白藜芦醇 生物合成途径中的相关酶基因 ,白藜芦醇 的生物合成途径如图四所示。 图三 化的反应步骤 S 图四 白藜芦醇 的生物合成途径 of 44oA 作为植物雌激素而起到预防癌症的作用 随着年龄的增长而引起的雌激素和雄性激素的减少会导致组织和器官功能的失调 ，然而， 不平衡的荷尔蒙刺激可能使得细胞增殖超过分化和衰亡 ，因而增加了发 生癌症的风险。因此，激素依赖的肿瘤（乳房和前列腺，或其他的如肺）可以通过日常摄入恰当量的选择性雌激素受体调节物来阻止其发生，这些复合物表现出了不同程度的对雌激素的竞争与拮抗作用，雌激素受体的靶标基因表达和其他相关细胞内应答依赖于细胞周期（ 2003） 。几种多酚化合物在结构上极像雌激素，例如植物雌激素类黄酮 999） 。西方国家妇女乳腺癌发生率比亚洲国家高六倍，因为亚洲国家妇女们常食用富含植物雌激素的豆 类产品，表明，植物雌激素可作为一种癌症的化学预防药（ 2002） 。多酚化合物 白藜芦醇 可以被看作是可以食用的植物雌激素，它对于雌激素受体表达或不表达的人类肿瘤具有非常好的效果。 白藜芦醇 的化学结构像合成的雌激素 白藜芦醇 属于一型雌激素（ 003） 。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 综述 3 节癌症第一、二阶段的酶 癌症的起始是多个事件的结果。刺激因子（如激素、细胞因子）、压力调节因子（ 炎症氧自由基 ）的组合作用以及外源入侵物（病毒、辐射和异型生物质复合物）都能影响细胞增殖的 控制从而导致组织的肿瘤化（ 2005）。 异型生物质（致癌物和药物）常常是很容易进入细胞的脂溶性物质。为了防止它们的毒害作用，细胞常通过所谓的生物转化的处理过程使它们变得更亲水、容易排泄。这个过程包括第一阶段的酶的氧化作用和通过第二阶段的酶连接上极性基团，然而这种处理容易导致高反应活性的氧自由基和其他容易与 而使前致癌物变成了致癌物（ 997）。 这个氧化阶段包括了一些膜结合酶（例如细胞色素 ,它们利用氧分子引入氧原子。第二 个阶段通过转移酶进行，它们加入亲水基团或者改变分子的氧化还原状态（如谷胱苷肽 转移酶， 苯醌氧化还原酶）（ ， 2003， 2004）。化学防治策略包括第一阶段负责激活异质型生物的酶的抑制和第二阶段酶的诱导，它们能联合已经激活的复合物成为内源配基（如谷胱苷肽）。 白藜芦醇 是种外源的脂溶性的复合物，能跨过质膜，进行细胞代谢的，而且它可能与第一阶段的酶相互作用。在体外白藜芦醇抑制人重组的 450（ ,2003） 。进一步的研 究表明，在鼠表皮中， 白藜芦醇 也能诱导第二阶段的酶（如 )H:苯醌氧化还原酶） (， 2004)。这些数据都增强了 白藜芦醇 可以用于癌症的化学预防这一假说。 护心血管系统 白藜芦醇 对心血管系统的保护作用源于它能够引起血管舒张（通过调节一氧化氮合成酶）、抑制前列腺素的产生（通过调节环氧合酶）以及具有抑制血小板凝聚、抑制低密度脂蛋白氧化、抗炎症、清除自由基等作用。 已知一氧化氮有血管舒张特性，它能抑制血小板黏附聚集，而且能抑制粘连分子的表达，而且它能抑制 细胞生长和转移（ 1997； 1989； 1991； 996）。很明显，一氧化氮和 白藜芦醇 享有一样的靶标。一氧化氮合成酶世含有亚铁血红素的单氧化酶，有一个还原酶区域和一个氧化酶区域。内皮、神经元、线粒体的一氧化氮合成酶的组成型异构体能提供低细胞内浓度的半寿期短且自由基一氧化氮。一种一氧化氮合成酶的可诱导形式，在发生炎症时可以在转录水平激活，提供高浓度的一氧化氮（ 2005）。 白藜芦醇 可能通过削弱血管生成的进程来支持抗癌活性。已知这种复合 物能抑制内表皮细胞的转移、血管的形成从而阻断氧自由基的形成以及相关的 2003）。以为摩尔范围内的 白藜芦醇 进行处理，能通过促进一氧化氮的释放来诱导血管平滑肌细胞的松弛，而这能被一氧化氮合成酶的抑制物所逆转（ ， 2002）。 白藜芦醇 首先被发现在根部能抑制环氧化酶（ 活性，环氧合酶催化前列腺素生物合成的首个步骤 (底物是花生四稀酸 )。已知前列腺素是细胞增殖和血管生长的刺激物，免疫监视的抑制因子（ ， 2004）。在体外， 白藜芦 醇 非竞争地抑制环氧合酶和氢过氧化物酶 ， 1997;， 2004）。 白藜芦醇 的这种双效性是唯一的，因为典型的非中国农业科学院硕士学位论文 第一章 综述 4 类固醇抗炎症药物（ 影响 1971； 003)。除了组成型的 种可诱导形式的 炎 症药物 和有丝分裂刺激所诱导（ ， 2003）。 既然 ， 1995； ， 1997）。所以盯住 天然的抗氧化剂，如维生素和多酚化合物，在预防跟自由基相关的疾病中起着重要的作用。白藜芦醇 的抗氧化能力可能跟它能阻止动脉硬化有关，因为低密度脂蛋白的氧化是 动脉 硬化发生中的一个重要事件。 在胡萝卜素的乙醇溶液中， 白藜芦醇 能非常有效地清除羟基（氢氧基）（ ， 2003）。 白藜芦醇 对于巨噬细胞（受到脂多糖和佛波醇酯刺激）产生的超氧自由基（ 能明显减少化生四稀酸的释放（由脂多 糖或佛波醇酯诱导、或通过暴露于 2）（ ， 2000）。有人对 白藜芦醇 的抗氧化能力进行过评估，发现它能阻止微粒体中 诱导的脂质过氧化；也能阻止 诱导的低密度脂蛋白的氧化（ ， 1997） ;还能抑制铁离子或紫外照射所催化的鼠肝脏微粒体中的脂质过氧化( 4.8 , （ ， 2000） 。最近有人在酵母 白藜芦醇 的抗氧化效果进行了评价，发现跟维生素 C、维生素 E、丙基末食子酸盐相比， 白藜芦醇 有更高的清除 ， 1999；， 1998） 。 藜芦醇与炎症 炎症的发展是由前列腺素所介导的，对前列腺素的抑制作用可以部分解释 白藜芦醇 的化学预防和保护心血管效果。已经有研究表明， 白藜芦醇 能剂量依赖地抑制人外周血白细胞中 ， 2005）。活体实验中， 白藜芦醇 能明显降低已经升高的 2004）。在体外 或活体模型中， 白藜芦醇 也能降低环氧合酶 2的表达，环氧合酶 2能被炎症所诱导，它催化前列腺素的产生（ ， 2005； 2004）。 白藜芦醇 还被观察到，能降低诱导型环氧合酶 2的活性（经由信号转导途径抑制这种酶的表达）（ ， 1998；， 2004； 2004） 白藜芦醇 也能抑制细胞因子的炎症作用，如肿瘤坏死因子（ 白细胞介素 ， 1999； ， 2003）。核因子 是一种转录因子，调控基因参与炎症与肿瘤发生（ ， 1997） 。抑制 核因子 是 白藜芦醇 展现出抗肿瘤活性的可能机制。已经在几类细胞株中观察到， 白藜芦醇 抑制了肿瘤坏死因子诱导的核因子 的激活（ ， 2000； ， 2002） 。最近研究发现，通过抑制 核因子 的表达以及抑制由 核因子 调控的两个酶（环氧合酶 2和基质金属蛋白酶）的表达， 白藜芦醇 能减少诱发乳腺癌，各种肿瘤、广大癌症在雌性 潜伏（ ， 2002） 。 白藜芦醇 抑制核因子 活化的确切机制仍然不清楚。 2000)的研究确定， 白藜芦醇 能够抑制肿瘤坏死因子 的活化，是通过防止磷酸化和， 2000）。通过阻断核因子 活性， 白藜芦醇 也表现出对核因子 活性的阻断（ ， 2000） 。 第一章 综述 5 以结合无活性的 。在激活时， B， 并降解它，从而容许 核因子 迁移到核。 白藜芦醇 抑制上游的一个信号成分（ ， 2000） 。 藜芦醇合酶 藜芦醇合酶 的酶学性质 C 被称为 3,5,4 是芪合酶 (称 的一类。 et 995),分子量为 90 000 等电点为 984;991)。芪合酶（ 芪类物质合成的关键酶，这类酶催化合成其它酶作用底物的骨干分子。蛋白质交叉结合和定点突变分析证明 ,58个氨基酸残基 ,接近于酶的活性位点 个亚单位均可进行三步缩合反应 ,同时异源二聚物的亚单位缺失补充实验证明 ,两个亚单位在产物形成过程中是协同合作的 ,但还不能确定这种协同作用是发生在酶 et 995;991)。 984 ）。 992)利用定点突变技术研究了酶活性位点半胱氨酸 将 果酶对受试三种底物的活性均丧失 ,而藜芦醇合酶 对 4的活性 ,动力学分析证明其与对照相比 倍 ,从而使得该酶从 白藜芦醇 形成型转化为二氢赤松素形成型。2001)改变 白藜芦醇合酶 的底物，研究了 白藜芦醇合酶 合成其他新型聚酮化合物的能力 ,结果显示很微小的化学修饰就可引导 白藜芦醇合酶 催化反应形成一系列不同的新产物。 藜芦醇合酶 与查尔酮合 酶 白藜芦醇合酶 和 查尔酮合酶 是植物体中 白藜芦醇合酶 和 查尔酮合酶 的序列比较分析显示两种基因是相互关联的但不是完全相同，两者在 蛋白质水平是高度同源的