【毕业学位论文】（Word原稿）RNAi介导的抗RSV转基因水稻研究分子植物病理学博士论文

密级 论文编号 中国农业科学院 学位论文 导的抗 基因水稻研究 on on I 摘 要 水稻条纹叶枯病是热带和亚热带地区最重要的病毒病之一。 在我国的 粳稻 产区一般会造成20 30的减产。 近年来 由于气候和耕作的变化以及水稻品种的抗病性较差，我国江苏、山东、河南等地 种植的水稻遭受严重的经济损失。水稻条纹叶枯病由水稻条纹病毒 （ 引起， 是纤细病毒属（ 代表种 ，主要由灰飞虱 （ 其 它 3 种 飞虱 持久性传播。 电镜下观察呈丝状粒体，以折叠、分枝和超螺旋等形式存在。 寄主植物和介体昆虫体内都能进行复制。 一种重要基因沉默现象， 当表达来源于病毒某一基因或核苷酸序列的转基因植物发生 默时，能对入侵的同一病毒或同属中相近病毒的 行降解，使入侵的病毒不能在植物中积累，从而赋予转基因植物病毒抗性。 本实验室对我国北方 34 个 离物 因 进行 分析，结果表明 因的 核苷酸序列一致性在 100之间 ，说明 我国北方粳稻产区所发生的 P 基因非常保守 ， 有利于识别 。 因此，本研究 探索 利用 理构建 P 基因全长片段或部分片段介导的干涉载体，通过农杆菌介导的方法转化水稻， 筛选对水稻条纹病毒产生抗性的转基因水稻 后代 ，利用品种自身的抗性达到主动防治的目的。 本研究首先利用 体 上的多克隆位点将 P 全长或部分片段的正义链、反义链、正反链分别连接到载体上，其中正反链之间由一段载体上的内含子作为间隔，从而形 成发夹结构。再根据农杆菌 导法转化水稻的需要，将初步构建的载体上包含目的基因结构的片段酶切后连接到水稻转化常用载体 终构建成适合农杆菌介导法转化水稻的载体，构建了含 P 全长和部分基因片段的正义链、反义链和正反义干涉载体。 此外，通过对 载体 和 体的改造， 构建了既可用于干涉，又能直接用于农杆菌介导的水稻转化 成一种新 载体。 利用农杆菌 介导将构建的干涉载体转入水稻模式品种爱知旭和推广品种皖粳 97及秀水 11 的 成熟胚愈伤组织 ， 利用 方法对转化得到的水稻进行目的基因检测，初步鉴定获得 以 爱知旭 为受体的 转基因水稻 8 棵（其中转 P 载体 5 棵，转 体3 棵），皖粳 97 为受体的 转基因水稻 1 棵（转 P 载体），秀水 11 为受体的 转基因水稻 2 棵（转 P 载体）。 对 转基因水稻再进行 35S、 几种载体上存在的元件进行 检测，初步判断转入水稻的元件 基因是否发生 丢失 。 对 皖粳 97 转基因水稻的后代 随机抽取样品 （ 20 棵、 约 66 棵） 进行目的基因检测和元件检测， 初 步 鉴定其中的70 棵为阳性 转基因水稻后代。 为了保证接种压力，首先 对实验室饲养的带毒灰飞虱种群进行检测，测得其带毒率为 。 利用带毒灰飞虱 进行接种 实验 ，每株水稻接种 10 12 头灰飞虱，接种7 天后 将灰飞虱转移或杀死 ，将植株移栽大田或温室 。 对 获得的 爱知旭 为受体的 转基因水稻 （ 其后代（ 皖粳 97 为受体的 转基因水稻 （ 及其后代（ 行 接种实验，接种后大约 55 60 天 进行抗病性调查。 病情调查结果表明， 转基因爱知旭水稻有 5 棵表现高抗，有 2 棵表现免疫。 与非转基因水稻 皖粳 97 相比，转基因 皖粳 97 植株发病延迟， 大部分转基因水稻的发病症状明显减轻或者 未出现 症状。 参照抗性评价标准进行抗病性分析，对照皖粳 97 植株 现高感， 皖粳 97 为受体的 转基因水稻中的 3 个株系表现中感， 7 个株系表现中抗， 5 个株系表现高抗 （其中 3 个株系的 植株 表现 免疫 ） 。通过对 皖粳 97 转基因植株的连续抗病性调查，可以看出 转基因 植株对 抗性可以遗传给 代。 接种后发病等级为 0 的转基因水稻植株中病毒 含量及其 累量与非转基因水稻相比明显 较低。 此外， 抽取不同转基因水稻进行外源插入结构的 左右边界分析及其旁侧序列测定。 转基因秀水 11 水稻 0有不完整的左边界和右边界，通过右边界的序列分析 初步推测 在 0外源片段是多拷贝插入 。转基因水稻 0因组中既发生了外源载体与水稻基因组的重组，还存在载体之间的重组。通过分析初步确定了外源载体在所扩增到的秀水 11 基因组序列中的位置，但尚不能定位。同时，分析结果表明转基因皖粳 97 水稻 有完整的右边界和断裂的左边界，其后代 有与其相同的分析结果。 关键词 ： 水稻条纹病毒 灰飞虱 干涉载体 农杆菌介 导的转化 is of in 0in In to in of is of is in by As a of in an it in P SV in 4 of P of cp by In P CP In of 969or 223 P an in to a 69 23 of P as of a A of P, P as as in to to A P P) on be to . CP At a on be to . to by of . CR to 5S et or in by as In to of of 4.3 0to or of 5 0 of of by as to of a IV or no to of SV of 7(on of SV 0, T1 2 of 1 be to 2 P in In on NA to of in of V 目 录 第一章 文献综述 . 1 稻条纹病毒的生物学 . 1 稻条纹病毒的分类地位及病毒粒体形态 . 1 稻条纹叶枯病的分布与危害 . 1 基因组结构 . 3 关抗 水稻研究 . 6 稻基因资源的利用 . 6 害控制的分子生物学策略 . 6 发现及其在水稻抗病毒基因工程中的重要性 . 7 发现及其特点 . 7 可能机制 . 9 物病毒外壳蛋白介导的抗性及 水稻抗 病毒中的重要性 . 11 用病毒外壳蛋白进行的抗病毒研究 . 11 基因植物研究中存在的问题 . 12 水稻抗病毒基因工程中的应用前景 . 13 杆菌介导的水稻转化技术研究 . 14 杆菌介导的遗传转化 (. 14 根癌农杆菌介导转化水稻等单子叶植物的尝试 . 15 响根癌农杆菌介导转化水稻的因素 . 15 化过程中的选择标记基因 . 16 化过程中的基因沉默及其对策 . 16 癌农杆菌介导转化植物的优点 . 17 研究的目的意义 . 18 第二章 适合农杆菌介导的水稻转化干涉载体的构建 . 19 P 基因的克隆测序 . 19 材料和试剂 . 19 实验方法 . 19 果与分析 . 22 适合农杆菌介导水稻转化的干涉载体的构建 . 23 验材料 . 23 验方法 . 24 果与分析 . 26 论 . 29 第三章 农杆菌介导的两种干涉载体的水稻转化 . 31 料与方法 . 31 料 . 31 验方法 . 31 果与分析 . 33 杆菌转化子的鉴定 . 33 稻成熟胚愈伤组织的培养 . 34 伤组织与农杆菌的共培养 . 35 基因水 稻植株的获得 . 35 化效率分析 . 39 论 . 39 四章 转基因水稻的分子鉴定及其抗病性研究 . 41 料与方法 . 41 基因水稻品种 . 41 基因水稻所转化的载体 . 41 稻叶片 小量提取 . 41 测 . 42 用设计的特异性引物对转基因水稻进行构造检测 . 42 联免疫吸附法间接 . 42 子的潮霉素平板抗性筛选 . 44 稻叶片总 提取 . 44 析 . 44 交分析 . 44 基因水稻抗病性鉴定 . 46 果与分析 . 48 知旭为受体得到的转基因水稻 . 48 粳 97 受体所得转基因水稻的鉴定与分析 . 51 论 . 56 第五章 转 P 基因水稻的插入位点解析 . 58 料与方法 . 58 稻材料 . 58 涉载体的物理图谱 . 58 载体构造 . 59 据 体所设计的引物 . 59 法 . 60 链 . 61 列测定和分析 . 61 果与分析 . 61 基因水稻 提取 . 61 基因水稻左右边界的检测 . 62 转基因水稻 0 1 结构基因检测及其旁侧序列分析 . 63 粳 97 受体所得转基因水稻结构基因的检测 及其旁侧序列分析 . 68 论 . 69 第六章 全文结论 . 71 参考文献 . 73 附录 . 83 致 谢 . 91 作 者 简 介 . 92 文缩略表 英文缩写 英文全称 中文名称 苄 青霉素 As 酰丁香酮 bp 基对 补 瓜花叶病毒 CP 壳蛋白 d 蒸水 氧核苷 三磷酸 肠杆菌 EB 化乙锭 二胺四乙酸 联免疫吸附法 h 时 霉素磷酸转移酶基因 际病毒分类委员 会 IR 因间隔区 MP 动 蛋白 使 I I 霉素磷酸转移酶基因 苷酸 开放阅读框架 合酶链式反应 复制酶蛋白 录后 水平的 基因沉默 乙烯吡咯烷酮 NA 依赖 合酶 稻矮缩病毒 导的病毒抗性 NA 涉 分钟转速 稻条纹病毒 转录一聚合酶链式反应 稻黄斑驳病毒 SP 病害特异性蛋白 链 GS 录水平上的基因沉默 编码区 毒义互补链 义链 干涉 43中国农业科学院 博 士学位论文 第一章 文献综述 1 第一章 文献综述 稻 条纹病毒的 生物学 稻条纹病毒的分类地位及病毒粒体形态 水稻条纹病毒（ 纤细病毒属（ 代表种。纤细病毒在1983 年才首次被确认为植物病毒的一个组，在 1993 召开的国际病毒分类委员会 (六次会议上，改为纤细病毒属（ ， 1995），归入无包膜的 毒中。根据传 毒介体、寄主范围、 分数目及大小和相应基因编码蛋白的氨基酸序列的同源性（ 85%）以及相应基因间隔区（ 列的同源性（ 60%），已将 草白叶病毒（ 玉米条纹病毒（ 水稻白叶病毒（ 水稻草矮病毒（ 尾稃草白叶病毒（ 明确归入纤细病毒属（ ， 2000） 。 有关 体形态的报道很多。 1975 年以前，水稻条纹叶枯病的病原 一直 被 认为是直径约3050球状病毒（ ， 1974）。