【毕业学位论文】(Word原稿)番茄尖孢镰刀菌无致病力尖孢镰刀菌生防特性的研究-生物化学与分子生物学

分 类 号 密级 _ 收藏编号 10386 学号 11士研究生学位论文 番茄尖孢镰刀菌 无致病力尖孢镰刀菌 生防特性的研究 送 审 编 号： _ 研究生 姓名： 指 导 教 师： 姓名、职称： 研究员、副教授 学科、专业： 生物化学与分子生物学 研 究 方 向： 应用微生物 所 在 学 院： 生物科学与工程学院 论文答辩委员会 主 席 签 名： _ 二 一二 年 三 月 番茄尖孢镰刀菌 无致病力尖孢镰刀菌 生防特性的研究 答辩时间： _ 答辩地点： _ 答辩委员会 成员名单： _ _ _ _ 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得福州大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 论文作者本人签名： 签字日期： 20 年 月 日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解福州大学有关保留使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。（保密的论文在解密后应遵守此规定） 本学位论文属于（必须在以下相应方框内打“”，否则一律按“非保密论文”处理）： 1、保密论文： 本学位论文属于保密，在 年解密后适用本授权书。 2、非保密论文： 本学位论文不属于保密范围，适用本授权书。 是否同意授权以下单位 （必须在以下相应方框内打“”，否则一律按“同意授权”处理）： 1、 同意授权 不同意授权 清华大学“中国学术期刊 (光盘版 )电子杂志社”将本人学位论文进行电子和网络出版，并编入 列数据库（中国优秀博硕士学位论文全文数据库和中国知识资源总库）。 2、 同意授权 不同意授权 中国科学技术信息研究所（万方数据库）将本人学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并进行信息服务，同时本人保留在其他媒体发表论文的 权利。 本人签名： 签字日期： 20 年 月 日 导师签名： 签字日期： 20 年 月 日 I 中文 摘要 植物 枯萎病是由尖孢镰刀菌 （ 引起的毁灭性病害， 该菌能够引起多种作物及花卉的枯萎，造成严重的经济损失 。 无致病力尖孢镰刀菌作为最有潜力的生防菌株，其生防机制仍然不是很清楚，研究清楚 无致病力尖孢镰刀菌 的作用机理是关键所在 。本文 以一株无致病力尖孢镰刀菌 基础 ， 研究 该菌 的生长速度、细胞壁降解酶（ 活性 、次级代谢产物、 寄主范围 、 定殖特性 及其 对 番茄 枯萎病的盆栽防治效果 。结果表明： 无致病力 尖孢镰刀菌 生长速度与致病菌相比无明显差异， 对枯萎病菌无拮抗作用；在以 柑桔 果胶和羧甲基纤维素钠（ 碳源的培养条件下 均能产生 多聚半乳糖醛酸酶（ 、 果胶甲基半乳糖醛酶（ 、 纤维素酶（ 、 多聚半乳糖醛酸反式消除酶（ 果胶甲基反式消除酶（ 这几种 细胞壁降解酶（ 但以 柑桔 果胶为碳源时 活力 更高； 在发酵液的 析中得到高匹配率成分（匹配率高于 80 %） 17 种，包括有机酸，酮类，醇类，醛类等 ， 与致病菌株的发酵液相比 未发现特殊组分。 无致病力 尖镰孢菌 够在番茄、茄子、黄瓜、甜瓜、甜椒、香蕉、粉蕉7 种作物中定殖，而且对这 7 种作物无致病性， 从入侵时间和入侵后的定殖时间来看，无致病力 尖镰孢菌 番茄和香蕉中的定殖最稳定 。 该菌能够提高番茄和香蕉植株体内 过氧化物酶（ 多酚氧化酶（ 种酶 的 活 性 ，但对不同的酶影响时间不一致 。 无致病力尖孢镰刀菌 番茄有明显促长作用，能显著提高番茄的株高和叶片数量， 且 先接入无致病力尖孢镰刀菌 接入病原菌的处理方法，显著优于与病原菌同时接入或者先接入病原菌的处理方法，对番茄枯萎病盆栽苗的防效可达76 %。 关键词： 无致病力尖孢镰刀菌 ；尖孢镰刀菌 ；酶活；防治效果 该论文做的和写的很好，建议： 1、英文要继续修改， 2、第 4、 5 章合并。 on as a so of is At a in of on of in At of in of no no to or as of of 7 of in of 0 %), et , no in of to of in of 3 - in of of is to of 6 %. 录 第一章 绪论 . 1 1 枯萎病的发生及危害 . 1 2 枯萎病的防治 . 1 业防治 . 1 学防治 . 2 病育种 . 2 物防治 . 3 3 无致病力尖孢镰刀菌的作用模式 . 3 导系统抗性 . 3 争 . 4 养竞争 . 4 入位点竞争 . 5 4 无致病力尖孢镰刀菌的应用现状 . 5 5 本研究的目的及意义 . 6 第二章 无致病力尖孢镰刀菌 理学特性研究 . 7 引言 . 7 1 材料与方法 . 7 验材料 . 7 验方法 . 8 致病 力尖孢镰刀菌 长速度 . 8 同营养条件对无致病力尖孢镰刀菌 胞壁降解酶的活性影响 . 8 胞壁降解酶粗酶液的制备 . 8 G、 性的测定 . 8 性的测定 . 9 血清蛋白标准曲线的制作 . 9 马斯亮蓝 测定酶蛋白浓度 . 9 孢镰刀菌 致病力菌株与致病菌株的 分分析比较 . 9 2 结果与分析 . 9 致病力尖孢镰刀菌 致病菌生长速度的比较 . 9 养条件对无致病力尖孢镰刀菌 胞壁降解酶的活性影响 . 10 桔果胶为碳源的影响 . 10 甲基纤维素钠为碳源的影响 . 11 柑桔果胶和羧甲基纤维素钠混合为碳源的影响 . 12 孢镰刀菌 致病力菌株与致病菌株的 分分析比较 . 12 致病力尖孢镰刀菌 致病菌的 分特性分析 . 14 3 讨论 . 15 第三章 无致病力尖孢镰刀菌 毒基因检测及其病理学特性研究 . 17 引言 . 17 1 材料与方法 . 17 验材料 . 17 验方法 . 17 无致病力尖孢镰刀菌 作物的安全性评价 . 17 致病力尖孢镰刀菌 作物体内定殖能力分析 . 17 株的特异性引物 测 . 18 2 结果与分析 . 18 几种主要作物的安全性 . 18 致病力尖孢镰刀菌 作物体内定殖能力分析 . 19 株的特异性引物 测 . 20 3 讨论 . 20 第四章 无致病力尖孢镰刀菌 香蕉与番茄上的定殖特性研究 . 22 引言 . 22 1 材料与方法 . 22 验材料 . 22 验方法 . 23 致病力尖孢镰刀菌 致病菌在植物体内的定殖监测 . 23 致病力尖孢镰刀菌 致病菌对植物体内酶类的影响 . 23 液的 制备 . 24 测定 . 24 测定 . 24 活力的计算 . 24 萄糖标准曲线的制作 . 24 . 24 2 结果与分析 . 25 致病力尖孢镰刀菌 致病菌在植物体内的定殖监测 . 25 株的致病性测定 . 25 株的分离验证 . 27 致病力尖孢镰刀菌 致病菌对植物体内酶类的影响 . 错误 !未定义书签。 致病力尖孢镰刀菌 致病菌对过氧化物酶的影响 . 30 致病力尖孢镰刀菌 致病菌对多酚氧化酶的影响 . 31 致病力尖孢镰刀菌 致病菌对 . 33 3 讨 论 . 35 第五章 无致病力尖孢镰刀菌 番茄枯萎病防效的测定 . 37 引言 . 37 1 材料与方法 . 37 验材料 . 37 验方法 . 37 致病力尖孢镰刀菌 致病菌平板共培养的营养竞争 . 37 致病力尖孢镰刀菌 致病菌株 番茄盆栽苗枯萎病防效的测定 . 37 致病力尖孢镰刀菌 番茄植株生长特性的影响 . 38 致病力尖孢镰刀菌 番茄盆栽苗枯萎病防效的测定 . 38 2 结果与分析 . 38 致病力尖孢镰刀菌 致病菌平板共培养的营养竞争 . 38 致病力尖孢镰刀菌 致病菌株 番茄盆栽苗枯萎病防效的测定. 39 V 致病力尖孢镰刀菌 番茄植株生长特性的影响 . 39 致病力尖孢镰刀菌 番茄盆栽苗枯萎病防效的测定 . 40 3 讨论 . 42 第六章 结论与展望 . 44 1 结论 . 44 2 展望 . 44 参考文献 . 46 致 谢 . 51 个人简历 . 52 番茄尖孢镰刀菌无致病力菌株生防特性的研究 1 第一章 绪论 1 枯萎病的发生及危害 植物枯萎病是由镰刀菌引起的一种世界性真菌土传病害，其主要的致病菌是尖孢镰刀菌（ ） 。绝大部分的尖孢镰刀菌都是致病的，会引起植物根部腐烂或维管束病变，但它们中有一些菌株能够定殖于植物组织而不引起任何症状 1。致病的尖孢镰刀 菌具有很强的寄主特异性。基于寄主植物的种类和品种，可以把它们大约分为 53 个种， 117 个专化型，还有 29 个变种 2。 该菌有较强的腐生性，在土壤中能存活 5，厚垣孢子通过牲畜消化道后仍具有活力。所以，连作地和施用未充分腐熟有机肥的地发病严重 3。 尖孢镰刀菌寄主范围广泛，目前已报道的被严重为害的作物有 番茄、香蕉、辣椒、西瓜、黄瓜、棉花、香石竹、康乃馨、萝卜、鹰嘴豆、菠菜、草莓、川红花、甘蔗、芝麻、粉蕉、凤梨等多种植物 4。 枯萎病在植株的整个生育期均可发生， 3 至 4 年内就会由零星点片发展为普遍流行性病害 5。 邓坤章对广西北海市香蕉枯萎病进行调查，自2003 年起到 2009 年，枯萎病发生面积由 加为 30 。 在发病地区，该病的发病率一般为 15 %至 30 %，严重时可达 70 %至 80 %，有时甚至导致绝收，造成了严重的经济损失。 张扬等对北京市延庆县 2002 年至 2006 年期间甘蓝枯萎病的田间发生和危害进行了追踪调查，结果发现这 5 年来该县甘蓝发病面积提高了 ，年产量损失由 180000 展到 1370000 积年产量损失 4030000 。 目前陕西、甘肃、福建、 广西 、四川、 海南、 湖南、北京、 贵州、 浙江、山西等地已相继有此病的报道。植物枯萎病呈快速发展和蔓延态势，危害日益加重，已经对农业生产构成巨大威胁。 2 枯萎病的防治 业防治 对枯萎病的防治传统上采用农业措施：（ 1）实行与其它种类蔬菜轮作，最好水旱轮作 ；轮作在一定程度上可控制土传病害已经在多种作物病害控制中得到证实。 就要求进行轮作，由于 镰刀菌 在土壤中的存活时间较长，一般 5 年以上轮作才有较好的防治 效果 8。 （ 2）选用无病土育苗，提倡 用新法育苗，减少伤根， 即使清理田间发病植株及病残体，防治其随农事操作在田间传播或者成为病害的侵染来源，对减缓病害发生和蔓延具有积极作用； 重病地块或棚室在夏 季 高温季节覆膜， 利用太阳 能 升高薄膜下温度直至病残体全部腐烂，从而杀死病菌，可有效控制病害的蔓延。 （ 3） 以抗枯萎病能力较强的作物为砧木，嫁接 栽培 达到防治目的 ； 嫁接苗不仅可以防治枯萎病，确保苗全、苗壮，而且嫁接苗的根系强大，对水、肥的吸收能力强。 莫云彬等用不同砧木嫁接西瓜，结果表明利用日本强势葫芦作为砧木的效果最佳，不仅抗枯萎病能力最好，而且其综合性状也比其它 砧木福州大学硕士学位论文 2 效果好 9。 （ 4）加强肥水管理，严防大水漫灌，施用充分腐熟的有机肥，增施饼肥、磷钾肥与消石灰，改善土壤理化性状 10。 虽然 传统的农业措施对枯萎病具有一定的 防治效果，但由于这种方法耗费时间长，适用范围有限，此外，采用嫁接法除了增加工作量，同时也使得生育期推迟，某些嫁接组合的可溶性糖、蛋白质含量和有机酸的成分发生了变化，导致果实口感、品质下降 ，同时也无法解决种子带菌的问题，这些缺陷都限制着农业防治的适用性 11。 学防治 与农业防治相比，化学防治具有起效快 、效果好等优点。 国内 常用的化学方法 有：（ 1）新土育苗或床土消毒，每平方米用 50 %多菌灵可湿性粉剂 8g 加土拌匀，先将1/3 药土洒 在畦面上，然后播种，再把其余药土覆在种子上。（ 2）种子消毒，用适乐时进行种子包衣（ 100 以处理 2 子），并将药液稀释到 2000 倍进行苗床浇灌或用 硫酸铜浸种 5 净后催芽播种。（ 3）发病初期要及时拔除病株，带到田外深埋或烧掉，并对发病点进行喷药保护。药剂有 70 %甲基托布津可湿性粉剂 1000 倍、50 %多菌灵 600 倍、 适乐时 1500 倍，灌根时，可根据植株的生长情况，每 株灌药液 100 g，每隔 7d 一次，连续 3 12。 国外常用化学药剂熏蒸土壤达到消灭病原菌的目的，如用甲基溴熏蒸。 在西瓜播种前 25 d 用聚乙烯塑料薄膜覆盖地面，利用太阳能加热结合 的多菌灵菌种和播种后喷洒，可明显降低枯萎病的发生13。 采用化学防治的方法虽能产生 较好 的防治效果，但 也 能够导致病原菌产生抗药性，从而使防治工作失败，更加严重的是化学农药污染环境、损害人类健康 ，例如甲基溴已经被发现是一种潜在的致癌物 ，现在国家已不提倡使用 11。 病育种 对 环境最安全的方法就是使用抗病品种， 常规方法一般是用野生植物作为抗枯萎病育种材料，经过几年抗性培养筛选出具有良好抗性的植株。但 常规育种方法选育抗性资源花费时间长、耗资大 。现代分子生物学的发展，为抗病育种研究提供了强有力的工具，分子标记方法和 基因工程 技术已成为 抗病育种 的 主要方法 ，植物的遗传转化可创造出常规方法得不到的基因型，相比常规手段 大大减少了育种工作，缩短了育种周期，提高了育种效率， 可更加有效的改造栽培品种的缺点，并打破物种界限，扩大了基因来源 14。通过将质粒 入 一株荧 光假单胞菌获得融合菌株，提高了该菌株对黄瓜枯萎病的防治效果 15。 抗病育种 虽然 能够选育出抗病品种 ，但也面临很多问题 。一方面， 有些作物抗性种质资源较少，抗性遗传规律复杂，且选育的抗病品种只是相对抗病，生命力较弱，不能从根本上解决问题 ； 从另一方面来说，培养一种抗病植物，不仅要知道该植物的优势基因，而且要求这个植物是雌雄同株的。对于康乃馨、仙客来、亚麻这些植物来说，它们的优势基因未知，而对于棕榈树来说，它又是雌雄异株的 16。随着时间的推移，致病菌还会突变为一种新的菌侵入那些抗病植物。总而言之，通过农药以及 培养抗病品种来控番茄尖孢镰刀菌无致病力菌株生防特性的研究 3 制枯萎病还存在一定的困难。随着人们对杀菌剂危害环境的认识逐渐提高，对零化学农产品的兴趣逐渐增加，加上培育抗病品种费时费力，生物防治就成为人们最青睐的办法。 物防治 用来防治植物枯萎病的生防菌已经有很多报道，包括多种细菌、真菌、放线菌，或者将两种或两种以上的菌联合起来使用。 这些生防菌之所以能够防治枯萎病，目前公认的机制主要包括营养的竞争、生态位的竞争、 重寄生、 产生抗菌素或诱导植物产生免疫抗性等 17。 生防 细菌 目前