【毕业学位论文】（Word原稿）牛结核病多重组抗原间接ELISA试剂盒的研制及应用预防兽医学硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 硕士学位论文 牛结核病 多重组抗原 间接 剂盒的研制及应用 of it a of it a I 摘 要 为了建立一种有效的牛结核病间接 法， 本研究设计了 3 对引物，从牛分枝杆菌 菌株的基因组中 采用重叠延伸剪接技术 (by 得融合基因 经过多次亚克隆步骤后， 将 段 连于同一表达载体 )中，获得了重组质粒 该重组质粒转化 肠杆菌感受态后，经 导 表达 带有两个六组氨酸标签的 融合蛋白 以 合层析的方法 纯化该 融合 蛋白。 析表明该蛋白具有良好的免疫反应活性。 以 融合 蛋白 为包被抗原，在确定了最佳封闭液和最佳包被条件后，采用正交试验设计的方法摸索了最佳抗原、一抗和二抗稀释度， 以及 最佳一抗 、 二抗作用时间和显色时间，建立了检测牛结核病抗体的间接 法。 用 150 份健康牛血清 的 检测 结果 统计分析后确定诊断方法的判定标准，即样本 S/P 大于 阳性，小于 阴性，两者之间为可疑。 通过对 85 份牛结核病血清和 100 份 无结核病牛血清 的检测结果表明， 法的敏感 59/85），特异性为 96%（ 96/100）。对 50 份 性血清和 67 份 性血清（ 117份 ） 进行检测，并 与 试 进行 比较 ， 本方法与 试诊断的 符 合率为 本研究还进行了试剂盒的初步组装， 并将该试剂盒应用于现地血清样品的检测， 为产业化开发奠定了基础。 研究 表明本 试剂盒具 有较好的应用价值和产业化开发前景。 关键词： 牛结核病，融合蛋白，间接 n to an NA of NA . NA of by a +) to a It by of by to be A of to 34) of of 150 in to , .4 as .5 .4 as 5 00 59/85） 6%（ 96/100） . 117 67 of PD 0 of PD PD PD in is a of 录 1 绪论 . 1 内外研究现状 . 1 结核病的流行和控制 . 1 结核病诊断技术的研究进展 . 3 结核病疫苗的研究进展 . 5 究目的和意义 . 9 究内容和方法 . 10 分枝杆菌抗原 . 10 . 10 2 试验部分 . 11 分枝杆菌抗原 融合表达 . 11 料和方法 . 11 果 . 18 论 . 22 接 法的建立及试剂盒的组装 . 22 料和方法 . 22 果 . 26 论 . 35 3 结论 .考文献 .录： .录 1：测序结果序列（ 期望序列（ 比对： . 43 致 谢 . 者 简 历 .国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 1 1 绪论 内外研究现状 结核病的流行和控制 牛结核病 (主要是由牛分枝杆菌 (起的一种牛的慢性消耗性传染病，该病可通过病畜传染给人类或其他动物。自从 1882 年 次分离培养并详细描述了结核分枝杆菌以来，人们开始 渐渐 研究和认识 分枝杆菌（ 1882； et 2004）。 到 1898 年 ， 次将牛分枝杆菌 (M. 其它的分枝杆菌明确区分开来（ 898； et 2003）。牛分枝杆菌主要感染不同种属的温血动物，包括有蹄动物、有 袋动物、食肉类动物、灵长类、鳍脚类动物和啮齿类动物在内的 50 多种哺乳动物，还包括类鹦鹉鸟、石鸽、北美洲乌鸦等 20 多种禽类。其中牛是最敏感的动物（ et 1995）。 人对牛结核也很敏感，且很多病例与感染动物有接触史。由于牛和人类的关系（牛奶、牛肉及制品等）较其他动物更为密切，因此约 10%左右的人结核病（不同的国家和地区不同有不同的比例）是由牛分枝杆菌引起。牛结核病的传染流行不仅会严重影响到畜牧业的健康持续发展，而且还威胁着人类的身心健康。因此，早在 1960 年世界卫生组织专家委员会第七次会议 就指出：在那些还流行牛结核病的国家中，人类始终受到该病的威胁，除非消灭牛结核病，否则人类结核病的控制是不会成功的。 牛结核 病 感染一般发生在不太发达的国家和发达国家的特殊人群，他们因 食用未经巴氏消毒的奶制品而感染。人感染牛结核 病 的另一种来源是与感染动物的接触，如屠宰场工人、兽医和动物训练员。在发生该病的这些人群当中，以飞沫形式传播已被确认为是最可能的感染途径。后来，有了人结核 病 以飞沫形式传染给动物的报道（ et 1994； et 1998； et 2005）。 呼吸道传播是牛结核病的主要传播途径。吸入了被污染的飞沫或媒介是传播牛结核病的最主要的方式 ， 只须很少量的牛分枝杆菌即可引起感染。野生动物间常以此方式传播牛结核病，如英国的欧洲獾和新西兰的刷尾袋鼯。 采食了被污染的饲料和饮水是另一种重要的传播途径。动物可通过 采 食了有传染性的黏液、鼻汁、粪便和尿液等或食入了被污染奶牛的牛奶而经口感染。由于牛分枝杆菌具有长时间在体外存活的能力，因此食入了被牛分枝杆菌污染的食物即可造成种间疾病的传播。此外 ， 还有通过撕咬传染和垂直传播的报道（刘思国 ， 等 2005）。 目前，多数国家都不 提倡用疫苗接种的手段来控制牛结核病，而采用屠宰 试诊断阳性牛的策略（ 2001a）。许多发达国家就是利用该策略有效地控制了牛结核病。美国是世界上第一个实行根除牛结核病的国家。自 1917 年实施消灭牛结核病的计划以来，已经使牛结核病发病率降为 以后一直呈零星散发。美国于 1998 年实现了无牛结核病目标 ,。 但由于野生动物以及人类结核病的发生和流行，后来在密歇根州又有发生。所以，美国的牛群处在不断地检疫和高度警惕之中 (et 2000； 2003)。欧共体国 家于 20 世纪 50 年代签署了控制牛结核病的贸易协定。北欧的丹麦、比利时、挪威、德国和荷兰等国已基本消灭了牛结核病 ,英国和中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 2 法国处在控制状态。 2000 年英国提供的数据表明 ， 全国兽群中本病的发生率为 过去十几年间英国西南部的发病率成指数上升。獾被认为是本病在大不列颠和爱尔兰重要的传染源，目前正在进行大量试验来评价獾在牛分枝杆菌控制中的作用 (et 006)。与英国和美国的情况相似，澳大利亚、新西兰等国家已经消灭了牛结核病 ， 但近年来由于野生动物獾和狐狸等动物结核病的出现 ,致使牛又感染了 结核病（ 2001a）。 近年来发现了很多野生贮存宿主，如新西兰的刷尾袋鼯和海狮、英联邦的欧洲獾、美国密歇根的白尾鹿、水牛和南非的羚羊，其他的如大象和犀牛也是牛分枝杆菌的宿主。野生动物通过排泄物将结核杆菌排出体外，污染了饲草、饲料和饮水等 ,家畜采食后感染结核杆菌，进而造成牛结核病的发生。这是牛结核病难以消灭而持续存在的主要原因 (006)。 第三世界国家牛结核病广泛流行，严重地危害着人类的健康和畜牧业的健康发展。亚洲和非洲是牛结核病和人类结核病的高发区。在所有的非洲国家中 ， 只有 7 个 国家考虑到牛结核病是必须申报的疾病而采取检疫和部分扑杀政策 ， 只有 15%的结核病牛群采取检疫和扑杀政策 ， 其余 48个国家采取的控制措施不当或根本就没有采取任何措施。因此，大约 85%的牛群和 82%的非洲人生活在采取部分控制措施或根本没有采取任何控制措施的环境中。 1996南非克洛格国家公园爆发了结核病。据统计公园南部的水牛感染率达 42%，中部地区的感染率为 21%，该结核病的自然宿主是水牛 ,这种无种界限的相互传播是以前没有报道的。亚洲国家中 ， 只有 7 个国家采取检疫和部分扑杀的控制政策 ， 并考虑进行申报 ， 其余 29 个国家只采取了部分控制政策或根本没有采取控制措施。在亚洲国家中 ,因牛结核病感染 ,只有 6%的牛和低于 1%的水牛采取了申报检疫和扑杀政策 ， 94%的牛和 99%的水牛采取了部分控制措施和没有采取任何控制措施。因此 ， 大约94%的亚洲人生活在采取部分控制措施或根本没有采取任何控制措施的环境中。由于结核病感染宿主的广泛性，从而造成了结核病的不断发生，给预防工作造成了很大的困难（刘思国 ,等 2005）。 随着我国人民生活水平的不断提高 ， 人们对健康生活的要求也迅速提高 ， 与之相一致的是乳制品需求量的急速攀升 ， 随之带动了奶牛业 在近几年的迅猛发展。在这样一种情况下 ， 我国的牛结核病疫情正在受到日益广泛而密切的关注 （杨卫冲， 2004） 。 1985 年和 1987 年进行的两次全国奶牛抽样调查结果 ,牛结核病患病率分别为 1979 年、 1985 年和 1990 年三次全国结核病流行病学调查显示 ， 由牛型分枝杆菌导致的结核病所占的比例分别为 徐美英，等， 1998） 。此后未有全国性的调查统计数据见诸报道 ， 然而地方性的疫情调查显示情况不容忽视（黄纪铨， 2000；郭海晏，等 2002；朱长光，等 1999）。 近年来 ，随着耐药性菌株的产生及个体养牛户的增加，结核病的阳性检出率在逐年上升。因此，在我国，牛结核病作为一个危害甚大的传染病，再次引起人们的关注。在 1999 年的动物疫病病种名录中，牛结核病被列为牛病中的二类动物疫病。牛结核病已经给我国的养牛业造成了巨大的经济损失，尤其是对奶牛的危害极其严重。患病奶牛的寿命缩短，产奶量显著降低，母牛常常不能怀孕，使役牛患病后逐渐消瘦，劳动能力减弱，病牛乳汁将给人类的健康带来了威胁。牛结核病影响着我国养牛业健康发展和人类的健康。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 3 结核病诊断技术的研究进展 核菌素皮内试验 结核菌素皮内试验 (目前被世界各国广泛采用，并且是世界动物卫生组织(荐的诊断牛结核病的唯一方法。但该方法有许多显而易见的不足之处： 不能区分各型分枝杆菌，对因感染其它分枝杆菌而致敏的动物没有特异性，在一些对牛群进行 疫的国家或地区，不能鉴别免疫动物与感染动物； 在那些因病情严重而导致免疫反应低下的动物易出现假阴性； 由于迟发型变态反应 (滞后效应，此方法在一段时间 (30d)内不能重复进行； 质量和剂量、结果判定标准及操作方法等因素均能影响检测结果，故需严格进行质量控制； 还必须在活体上试验，不便于大规模的流行病学调查，也不能应用于回顾性的流行病学分析。在一些国家，使用比较结核菌素试验 (比较皮内试验， 即在颈部一侧的不同部位，同时注射 M. 两种 够提示被检动物是 染还是非特异的 应（ 1999；杨卫冲， 2004）。 结核病 断方法的研究进展 结核菌素皮内试验已经不能满足大规模的流行病学调查和牛结核病疫情进一步控制的要求。因此， 需要一种高特异性和高敏感性的血清学诊断方法来弥补它的不足 。 法因其快速、简便和成本低而受到青睐。最早，人们用 建立了 et 983)。但是有研究表明，该方法的特异性和敏感性都不能令人满意 (et 987, 1990)。因此，牛分枝杆菌培养滤液中的单个蛋白被纯化出来用作 断抗原，但蛋白纯化步骤繁琐、成本高而实用价值低（ et 989）。随着牛分枝杆菌分子生物学和基因工程技术的进步，包括 立了间接 法（ et 002）。这种方法较 异性有所提高，但敏感性却更低了，而以多种抗原 鸡尾酒 进行 验有望提高其反应的敏感性（ et 996）。 验 最早 由 于 1990 年建立 （ et 1990） ，其原理为致敏的外周血淋巴细胞（ 体外培养的条件下，受特异抗原 (如 激后被活化，表达并分泌 过一定的技术手段 (如 培养上清中的 行检测，或者对 表达进行定量或者半定量 (如 还可通过 术对分泌 淋巴细胞进行计数 (形成的斑点数 )及对单个细胞分泌的 行定量 (形成的斑点大小 )，其结果与淋巴细胞增生试验具有很好的相关性。目前， 应用最普遍 的是 法测定 肝素抗凝血液和 37 培养过夜， 或 以 者用于检查交叉反应 )作为全血培养的刺激物 ， 第二天收集血浆样品并以夹心 测 et 997） 。该 测定系统简便快速，便于用作疫情监测时大量样品的测试。与结核菌素皮内试验相比 , 定法不仅简单快速，灵敏度和特异性 (尤其是后者 )高，而且由于减少了前者试验中操作和解释上的主观性，中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 4 使结果更为客观可靠。而且，在皮内试验进行后的 8内再进行 验，其灵敏度和特异性未 受 显著影响 (分别为 85%和 93%)，因此可以作为皮内试验理想的补充实验 (et 000)。 最近的研究发现，用 为刺激抗原，可以大大减少交叉反应，从而显著提高该方法的特异性。使用 牛群进行免疫接 种并不会影响对疫情的监测 ， 能够同时实施疫情监测计划和免疫接种计划，所以该方法尤其适用于那些对牛群进行 种的国家或地区 (et 999； 2001b)。 牛 验的大范围田间试验已在世界上许多国家 (包括澳大利亚、爱尔兰、比利时、新西兰、阿根廷、西班牙、意大利和美国 )完成，并在澳大利亚、爱尔兰和新西兰被批准为正式试验。以 为抗原，该法 敏感性 约为 特异性约为 et 000）。若以 虽然 敏感性 有所下降，但是特异 性可达 2001 年 ， 报道，通过使用混合了 鸡尾酒 抗原进行刺激，可使该试验的特异性达到 100%。诊断上的高特异性将大大降低大规模实施 检疫 计划的经济成本，从而有利于这一计划的大范围推广实施。 菌体成分的检测 998)报道了利用薄层层析技术 (通过分析 GL( 可以快速对 行检测和鉴定。该技术只需 10细菌培养物，与传统的生化鉴定方法相比具有简便快速的优点，因而是一种可靠的替代方法。还有学者利用过氧化物酶标记的单克隆抗体检测 体抗原 (如 )的免疫过氧化物酶试验检测法。其优点是检测速度快、成本低、操作简便、在检测分枝杆菌混合感染时尤其出色；缺点是结果易受标本采集和病程影响，准确率比较低。 巴细胞增生实验 致敏的外周血淋巴细胞 (特异性抗原 (如 )刺激下 ， 可使抗原特异性 T 淋巴细胞亚群发生增生反应。经典方法使用同位素对合成 须的某种核苷酸进行标记。最近有报道使用 55代同位素标记的胸腺嘧啶核苷。 一种胸腺嘧啶核苷的类似物 ,可取代胸腺嘧啶核苷参与 合成。被结合的 由荧光标记抗 体识别并结合 ,配合流式细胞仪可以对其进行识别并计数。通过测定外周血循环中的增生淋巴细胞的比例可了解淋巴细胞增生的程度 ， 间接反映淋巴细胞被特异性 抗原致敏的情况 ， 从而分析动物机体对 细胞免疫状态。 合酶链反应 (术 ) （ 1999）从 序列中分别选择一段高度保守的区域设计引物对样本进行扩增，由于不同分枝杆菌基因组中插入序列的不同，可以鉴别多种分枝杆菌，且结果具有很好的稳定性和重复性。 （ 2002）对结核分枝杆菌复合群 ( 16 列设计引物，能从组织中一次检测出这两类分枝杆 菌。该试验秉承了 术高度灵敏的特性，而且通过对不同的特异区段设计相应引物，能够鉴别各种分枝杆菌。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 5 （ 2003）发现，可以将人巨噬细胞系 细胞具有 体 ,缺乏膜表面及胞浆免疫球蛋白，易于培养且对 感 ,是扩增牛 有效媒介 )用来从临床样本中分离和增殖分枝杆菌，经过 48 小时培养可以将微量的分枝杆菌大量增殖。收集培养后的细胞 ,随后可以通过半巢式 (测被感染的 胞中牛 M. 或 通过流式细胞仪检测分子伴侣 10(0，也有人称之为 为 特有 )的表达和分泌 ， 从而检测 酸探针技术 （ 1997）将 因组上一段长度为 165有 动子的 行放射性标记并将其作为探针，提取待测菌株的 限制性内切酶 消化，迹后与探针进行杂交 。 该方法综合利用了 的限制性酶切 片段 长度多态 (术和 针技术，能够从混合样品中一次检出 多种致病或非致病分枝杆菌。 （ 1997）建立了间隔区寡核苷酸分型技术 (用以检测 是利用一段特定的间隔区寡核苷酸与体外扩增得到的 这种杂交具有菌株特异性 ， 因而可以 同时对 各个菌株进行快速的鉴定和鉴别 ， 还可鉴别 方法只需要少量的 并可直接利用细菌裂解物进行试验 ， 无需进行细菌的传代培养和提取 果分析也相当简便。 （ 2000）在术的基础上 ， 结合运用序列捕获 (术 (目的是富集样本中的细菌 可以直接从组织样本中检测一组间隔区寡核苷酸型 (式 ， 从而可以快速检测出 结核病疫苗的研究进展 卡介苗（ 由 1908间发展出来的。时至今日， 是防治结核病的唯一可用疫苗 (et 2004)。但是， 免疫保护力却并不令人满意，因不同地区不同人群差异很大（ 0%，也缺乏统一的评价标准 (003)；且，环境分枝杆菌往往导致 et 002)；此外， 种牛无法用结核菌素 （ 验与自然感染牛区分（ 2001）。所以，世界各国都在致力于改进 研制一种新型有效的结核病疫苗。 因工程重组或减毒的活疫苗 这是一类通过各种基因工程手段，发展起来的基于主要保护性抗原和活载体（ 他分枝杆菌、沙门氏菌或痘病毒）的活疫苗。 重组的卡介苗（ 多次传代过程中，毒力下降的同时，由于抗原蛋白的编码基因也发生突变或丢失，其抗原性也下降。针对该不足，通过质粒等载体植入结核杆菌主要保护性抗原，使其能分泌这 些保中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 6 护性抗原，从而增强 免疫效力。重组 现今唯一保护力超过 可用疫苗。 一能表达 融合蛋白，其二能分泌 白。免疫试验结果表明前者的保护力比 强，后者的保护力与 当 (003)。 了包含更多的抗原和具有更强的保护力外，它还拥有 所有优点： 安全，接种发病率仅为百万分之一。 生产成本低，它没有花费昂贵的合成和纯化步骤。 能在巨噬细胞内复制，稳定地释放各种抗原物质。 稳定易保存。但是， 与 样不能用于免疫缺陷的个体，也干扰 验 (000)。 一种很有前途的结核病疫苗。通过以下途径还可以进一步改进 使用具有更强启动子的载体，增加抗原的表达量。 增加抗原的种类。 改变免疫接种途径 (003)。 使外源基因与细胞因子 融合表达或共表达。但是， 扰 验严重限制了它在牛体上的应用。因此，还未见 于牛的报道。进一步提高 保护力和发展新的牛结核诊断方法可望能解决这一应用上的限制。 非致病性分枝杆菌疫苗及其作为载体的重组疫苗 寻找非致病性的分枝杆菌作为结核病的疫苗。研究较多的有母牛分枝杆菌（ 耻垢分枝杆菌（ 田鼠分枝杆菌（ 哈瓦那分枝杆菌（ 非致病性的分枝杆菌疫苗具有生长速度快和安全等优点。而且它与 样能引入外源基因构建成重组的非致病性的分枝杆菌疫苗（吕华坤，等， 2004）。 以其他细菌或病毒为载体的重组疫苗 据报道将结核分枝杆菌 的主要保护性抗原引入减毒的沙门氏菌或痘病毒内制成结核病疫苗。其保护力与 当。而且，通过引入合适的抗原能设计出不干扰与 验的疫苗（范雄林，2001）。 减毒结核分枝杆菌疫苗和营养缺陷型疫苗 用基因工程的方法剔除其毒力因子或使之产生营养缺陷，从而改造牛分枝杆菌、结核分枝杆菌或 为新型疫苗。 将牛分枝杆菌的 因敲除得到的突变株对豚鼠的致病力明显减弱。而且，接种的豚鼠还不产生针对 迟发性变态反应（ 可用 试区 分疫苗接种和自然感染（ 2000）。 的研究表明脯氨酸或色氨酸营养缺陷型结核杆菌，在 10 天之内 90%以上被巨噬细胞杀死。在小鼠（ 内两者都无毒力，并且能提供相当于（前者）或高于（后者） 保护力（ A， et 2001）。 亮氨酸营养缺陷型 能在小鼠体内和培养的巨噬细胞内复制，免疫牛不产生针对 et 996）。 由此可见，减毒结核分枝杆菌疫苗和营养缺陷型疫苗有如下优点： 安全，它甚至对免疫缺中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 7 陷（ 体都没有毒力。 免疫效力较强。 可望发展成为一种结核的标记疫苗。 白亚单位疫苗 亚单位疫苗是由一个或多个分枝杆菌组份加上适当的免疫佐剂而成的疫苗。当前作为亚单位疫苗的候选分子的主要是蛋白性抗原。其中研究得最多的是培养滤液蛋白（ 热休克蛋白（ 范雄林， 2001）。 结核蛋白亚单位疫苗可分为培养滤液蛋白（ 合物疫苗、单一蛋白亚单位疫苗、复合蛋白亚单位疫苗、融合蛋白亚单位疫苗以及表位亚单位疫苗。 培养滤液蛋白（ 苗在小鼠体内能诱导与 当 的保护力。 用牛分枝杆菌 牛 合物作为疫苗免疫牛。 再 用牛分枝杆菌有毒力株攻毒。结果表明，该疫苗能够提供优于 保护力 (et 000)。 合物疫苗成分复杂而不确定 ,分枝杆菌生长缓慢而不易大批生产，而且该疫苗的免疫牛无法用 试与自然感染牛相区别 (et 002)。相比之下，单一蛋白亚单位疫苗、复合蛋白亚单位疫苗和融合蛋白亚单位疫苗则有一定的优势： 它是一种明确的产物。 缩短了生产周期。 由于融合蛋白亚单位疫苗是以融 合的形式产生的，因此其中的蛋白之间能互相增强免疫原性 (et 001)。 它不干扰 试诊断。 对被环境中的分枝杆菌致敏的动物同样有效 (et 002)。 此外，表位疫苗也因其具有安全和简单的优点而受到重视。 研究了两个来自 别表位 1氨基酸残基（ 51氨基酸残基（ 作为疫苗的可能性。他们发现 能诱导机体的免疫应答。但是 ，只有 提供足够强的与 当的保护力。而且无论是自然感染还是疫，机体产生的免疫反应都是针对 。这一结果表明：表位多肽可以作为抗结核的疫苗；而且具有简单、安全、能持续诱导强烈免疫反应但不被反应清除以及所有亚单位疫苗具备的优点 (et 000)。 酸疫苗 1990 年， 发现将细菌半乳糖苷酶基因注入肌细胞能导致基因细胞核内转导并合成半乳糖苷酶。 1992 年， 证明注射质粒 激发机体 的免疫应答。至此，核酸疫苗就宣告诞生。 我们今天所说的 苗是指将抗原的基因插入质粒载体构建成的重组载体；它能在细菌体内扩增；通过肌肉注射或基因枪等方式导入动物体后，能稳定表达抗原物质，诱导机体免疫应答。 1996 年， 和 各自构建了针对结核的 苗 (003)。从此，核酸疫苗成了结核疫苗研究中的热门。牛结核的核酸疫苗也取得了很大的进展。 编码单个抗原的 苗 用分别编码 三个 苗做牛体免疫试验。发现 诱导 细胞分泌特异性的 明编码 第一章 绪论 8 的 苗能够使牛产生针对牛结核的细胞免疫和体液免疫。而编码 苗诱导的免疫反应则相对较弱，编码 苗则几乎没有诱导产生免疫反应。在他们的研究中还发现这三种 苗免疫的牛都不对结核菌素皮试产生反应 (et 000)。 997)等的研究发现 苗有免疫治疗的作用。 对 苗的治疗作用的机理作了探讨。他们发现： 苗治疗组小鼠的肺部有淋巴细胞浸润； 这些浸润的淋巴细胞中， 胞表面 表达上调；而 胞表面只有 达的上调； 见， 苗的治疗作用主要是增强了以细胞毒作用为特征的 型细胞免疫反应，从而减少荷菌量 (et 004)。 编码多个抗原的 苗 编码单个的 苗保护力一般都低于 多个候选基因的联合作用则可以提高 怡等（ 2003）构建了分别编码 种抗原基因的苗。将这三者混合成组合 苗再免疫小鼠。结果表明该 苗有比 好的保护力。 组合 苗在体内表达时，可能会产生竞争，使得某些抗原蛋白不能得以表达。而将多个基因插入到一个载体上而成的嵌合 苗，在体内表达融合蛋白，则可以避免这种情况。（ 2004）构建了融合表达 苗。他们用小鼠做免疫试验和攻毒试验。结果显示： 结果表明在动物的不同器官融合 苗都有不同程度的表达； 融合 苗诱导的体液免疫和细胞免疫均比 导的强； 攻毒小鼠有更高的存活率，肺部的荷菌量也更少。可见，融合 苗更有应用前景。 表位 苗 （ 2004）将编码结核分枝杆菌抗原 38白的 位 M（ 90 到 198 位氨基酸残基）和 38（ 38白的第 166 到 175 位氨基酸残基 ）的 段重组到 体中，构建了表位 苗： 了观察 S 序列（ S,泛素（ Ub,两个表位的作用，他们还构建了 个表位 苗。小鼠免疫实验发现：表位 苗能诱导表位特异的 答。