【毕业学位论文】（Word原稿）H3N2亚型猪流感病毒进化分析及重组HA1蛋白间接ELISA诊断方法的建立预防兽医硕士论文

中国农业科学院 硕士 学位论文 型 猪流感病毒进化分析及重组 白间接 断方法的建立 3N2 of an A1 3N2 of an A1 要 型猪流感病毒在全世界猪群中广泛存在，不仅给养猪业带来了巨大的经济损失 ，而且对人类健康造成威胁。为了了解我国 2004 2005 年猪流感病毒流行情况，我们对中国某些省市猪群进行猪流感血清学和病原调查研究，从 1238 份猪鼻棉拭子和猪肺、气管样品中分离到 5 株 型猪流感病毒。 通过比较发现分离的 5 株 型猪流感病毒 因同源性较高， 都 达到99%以上。对其中一株 A/(缩写 D/9/05)的 全基因进行克 、测序，构建 分基因片段的系统进化树， 从系统进化树来看它属于近期人流感病毒分支，通过 对 码的氨基酸序列和参考毒株进行比较， 得知其 在某些氨基酸位点发生了突变。 将 增得到的 全长 为 因 克隆到 体上，筛选 、鉴定阳性重组子 以此为模板 扩增出 段，去除编码 号肽的核苷酸序列，然后亚克隆到原核表达载体 ，经双酶切、 定 ， 筛选重组表达质粒 序列分析 进一步验证 因完整 。将 重组表达质粒 化到表达菌 ，经终浓度为 1 的 导，表达产物经 析，结果显示 型猪流感病毒 因在原核表达系统中已表达， 白表达量 占 细胞总蛋白的 40%，分子量近似 42测 结果表明表达蛋白具有 良好 的 抗原 性 。 利用表达并纯化后的重组蛋白作为抗原，建立检测 型猪流感病毒抗体的间接了优化 应条件，我们 用 型猪流感病毒的标准阳性血清和标准阴性血清进行反应 ，最终确定了抗原的最适包被浓度为 00l，最适血清稀释度为 1:100，酶标 最适工作浓度为 1:1000。 该 检测 方法 不与 型猪流感病毒及 猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征、伪狂犬病等猪病的阳性血清发生交叉反应 。 与 对比实验 ， 同时 对 来自不同 地区患有呼吸道疾病 的 96 份现地 猪 血清 进行 检测， 检测结果表明法的 特异性和敏感性都较高， 并且 两者的符合率达到 85以上，建立的间接 型猪流感病毒抗体检测提供了快速、准确、简便的方法。 关键词 ： 猪流感病毒 ， 原核表达系统，间接 3N2 as a to To I 004 005, I in 1238 5 3IV A A 3a To of 3N2 （ IV of A1 of NA A NA A1 of A A1 of as We CR A in 0% in by A1 3N2 as We 3 To 3 00l, of :100, gG :1000. no 1I, 6 I It be as an to 3 录 第一章 引言 . 1 基本概况 . 1 生物学活性 . 2 基因组结构及编码蛋白 . 2 复制 . 3 抗原性变异 . 4 间传播的分子机理 . 4 I 的公共卫生 . 5 V I 的流行现状 . 5 清学诊断方法 . 6 I 血凝和血凝抑制试验 . 6 I 神经氨酸酶抑制试验 . 7 I 中和试验 . 7 脂凝胶扩散试验 . 7 疫荧光法 . 7 联免疫吸附试验 . 8 试验研究的目的和意义 . 8 第二章 型 传演化分析 . 9 料 . 9 验用病毒株 . 9 胚 . 9 要试剂 . 9 要仪器 . 10 种 . 10 物设计 . 10 法 . 10 毒分离及有限稀释克隆纯化 . 10 细胞凝集（ 验 . 11 细胞 凝集抑制 (验 . 11 毒核酸的提取 . 11 因的 增 . 11 物的 琼脂糖凝胶电泳 . 12 物回收和纯化 . 12 肠杆菌感受态 制备 . 13 的基因 物的连接与转化 . 13 性重组质粒的筛选 . 13 组质粒的 定 . 13 粒 化 . 14 粒 序 . 14 列拼接与分析 . 15 果与分析 . 15 株 型病毒表面基因 物 . 15 株 D/9/05 内部基因 物 . 16 株病毒 因的阳性克隆 . 16 株病毒 因编码区核苷酸序列同源性比较 . 17 五株病毒八个基因片段同源性最高的毒株 . 17 W/（ 定 . 25 组表达质粒的构建 . 25 组表达质粒的鉴定 . 27 白在大肠杆菌中表达 . 28 达产物的 析 . 28 疫印迹检测 . 29 合蛋白的纯化 . 29 果 . 30 I 结果分析 . 30 因的 . 30 组质粒 鉴定 . 31 组蛋白 泳 . 33 组蛋白的 测 . 33 合表达蛋白的纯化 . 34 论 . 34 第四章 型 组 白间接 测方法的建立. 36 料 . 36 原 . 36 清和酶标抗体 . 36 关溶液 . 36 要仪器和设备 . 37 接 法的建立 . 37 接 作程序 . 37 同抗原包被浓度和血清稀释度试验 . 37 同封闭液的对比试验 . 37 同封闭时间的对比试验 . 38 抗最佳作用时间的试验 . 38 标二抗稀释倍数和作用时间试验 . 38 接 法阴阳性临界值的确定 . 38 重复性试验 . 38 测方法比较 . 39 叉试验 . 39 果 . 39 原最适包被浓度及血清最佳稀释度的确定 . 39 闭液的选择 . 41 适封闭时间的确定 . 42 抗最佳作用时间 . 43 标抗体最适稀释浓度的确定 . 44 标抗体最适作用时间的确定 . 45 阳性判定标准的确定 . 46 复性试验 . 47 叉试验 . 48 较试验 . 48 论 . 48 第五章 结 论 . 50 参考文献 . 51 附 录 . 55 致 谢 . 64 作 者 简 介 . 65 主 要 符 号 说 明 缩略语 全称 对照解释 脂扩散试验 流感病毒 苄青霉素抗性 bp 基对 血清白蛋白 补 d 巯基苏糖醇 二胺四乙酸 炭酸二乙酯 联免疫吸附试验 g HA 凝 素 h 时 HI 凝抑制 根过氧化物酶 丙基 kb 碱基 道尔顿 那霉素抗性 L LB mg 克 钟 ml 升 摩尔 /升 尔 /升 nm 米 经氨酸酶 OD 密度 苯二胺 开放性阅读框架 丙烯酰氨凝胶电泳 酸盐缓冲液生理盐水 合酶链式反应 PH 离子浓度 P/N 性值 /阴性值 乙二醇 /分 转录 搪核酸 糖核酸酶 糖核蛋白体 体破坏酶 s 二烷基磺酸钠 特定病原体的 流 感 流感病毒 (羟 )甲基氨基甲烷盐酸盐 g 克 l 升 g/克 /毫升 X 插图和附表清单 序号 图表名称 页码 图 1感病毒粒子构成示意图 3 图 2株 型病毒 因 物 15 图