分子细胞遗传学新进展

分子细胞遗传学新进展 传统的细胞遗传学 细胞遗传学主要研究染色体的亚显微结构和基因活动的关系 细胞周期的阶段 简介 60年代早期局限于计算染色体的数目粗略的将染色体按照大小和着丝粒位置进行区分 groupsAtoG 1970年显带技术的建立清楚的分辨出46条染色体 细胞遗传学的一般步骤 细胞培养使细胞停留在分裂中期低渗的方法使细胞膨大固定染色体 保留核酸将细胞滴到玻片上用显带染色技术进行染色在荧光显微镜下分析染色体数20个中期分裂相进行分析常规研究方法可区分400 600条带高分辨率研究方法可区分 650条带 细胞遗传学技术的步骤 细胞遗传学技术的步骤 细胞遗传技术的步骤 有丝分裂 中期的核型分析 染色体组核型分析 G 带 Giemsa 富含AT的区域颜色较深优点能看到整个基因组显示每一单个染色体缺点分辨率 5 10Mb 进行细胞培养其他会用到的核型分析技术R Q C 和NOR带 染色体异常数目改变 三倍体和四倍体非整倍体 21 18 13 XO XXY 等 染色体异常结构异常 平衡改变易位和倒位不平衡改变缺失 扩增 环状染色体 和等臂染色体 倒位 扩增和环形染色体 染色体缺失 缺失看得见的识别起来相对容易微缺失看不见识别起来不是很容易 意义 为什么开展细胞遗传学分析 A 产前及产后遗传病 染色体异常的发生机率 出生婴儿0 6 先天性智力障碍 MR 患者23 先天性心脏病13 SAB夫妇5 死胎和围产期死亡胎儿6 0 自然流产 前三个月 60 染色体异常在自发性流产中的发生率 唐式综合症在活产中的发生率及与孕妇年龄的关系 新生儿染色体异常发生率 唐氏综合症 21号染色体三体 95 97 多余的染色体来自母亲 唐氏综合症与母亲的年龄有关系 确切的病因不是很了解 活产新生儿发病率为1 800to1 1 100 唐氏综合症与文化 种族 社会阶层以及地理区域都没有必然的联系 智能较正常儿童低 认知困难 发育迟缓 他们也有很特殊的面貌 通常双眼距离较远 眼睛向上斜 鼻梁骨平坦 嘴 牙齿及耳朵均细小 肌张力低 Turner综合症 1个x染色体的全部或者部分丢失 只发生在女性 是最常见的染色体异常导致的疾病 活产女性新生儿发病率大约为1 2500 身材矮小 卵巢不发育 性幼稚 蹼颈 肾脏和甲状腺有问题 骨骼畸形等生长激素治疗 雌激素替代治疗等 B 白血病及实体瘤 肿瘤的分子生物学基础1 癌基因2 抑癌基因 基因功能与肿瘤 肿瘤中常见的癌基因种类 肿瘤中常见的癌基因扩增 常见的抑癌基因 白血病及淋巴瘤中常见的基因改变 基因组大小和分辨率 分子细胞遗传学荧光原位杂交技术 FISH 多色FISH SKY和M FISH 比较基因组杂交 CGH 基因微阵列 aCGH 荧光原位杂交技术 FISH 荧光原位杂交 FluorescenceinsituHybridization FISH 基本原理 应用荧光染料标记探针DNA 变性成单链后与变性后的染色体或细胞核靶DNA杂交 在荧光显微镜下观察并记录结果 生命科学中的 钓鱼 技术 centromere telomeresubtelomere locusspecific wholechromosomepaint FISH技术的特点 操作简便 探针标记后稳定 可与多种技术结合 可成功地帮助细胞遗传学家做出回顾性分析 方法敏感 能迅速得到结果 24小时就可以完成检测 人员培训较快 标本来源丰富 间期细胞 分裂中期细胞 分化或未分化细胞及死亡或存活的细胞皆可以被检测 FISH在白血病及实体瘤中的应用 1 诊断 宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤之一 发病率在女性恶性肿瘤中居第二位 仅次于乳腺癌 据世界范围统计 每年估计有46 6万左右的宫颈癌新发病例 其中80 的病例发生在发展中国家 近几年来 据一些国家和地区报道 宫颈癌的发病和死亡大致稳定 但局部有增长的趋势 特别是宫颈癌的年轻病例增加 宫颈腺癌的发病也趋于年轻化 在我国部分地区近年也出现了宫颈癌病人年纪年轻化趋势的报道 行为危险因素性生活过早 多个性伴侣 多孕多产 社会经济地位低下 营养不良及性混乱等生物学因素细菌 病毒和衣原体等各种微生物的感染 子宫颈癌 细胞学分级 鳞状细胞癌为主 约占95 腺癌仅为5 左右 腺鳞癌少见 但恶性度最高 预后最差 传统的宫颈癌检查及诊断程序 CervicalPapscreening Normal ASC US ASC H LSIL HSIL RepeatPap4to6months or HPVTesting HPVnegative high risktype HPVpositive high risktype RepeatPap12months Colposcopy Nolesionseen Cervicalpre cancerorcancer RepeatPapat6 12months orHPVtestingat12months Treat 传统巴氏细胞学涂片 液基薄层细胞检测 TCT HPV病毒检测荧光原位杂交 FISH 检测 三种检测方法比较 TERC 人类染色体末端酶 基因定位在3q26 3 该基因的扩增可阻止细胞凋亡 导致肿瘤产生宫颈细胞由非典型性发育异常向宫颈癌转变的过程中几乎都伴有3号染色体长臂扩增 其中 涉及到的最重要的基因可能是TERC基因 该基因扩增能准确区分宫颈细胞高度癌前病变与低度癌前发育异常 鉴别诊断的敏感性及特异性均在90 以上 同时 这一扩增也能预测52 96 的癌前病变有恶变的可能hTERC基因扩增的检测极有助于宫颈癌的筛查及早期诊断检测这一基因扩增的标准方法即为FISH技术 CIN2andCIN3区分正常 ASCUS andCIN1的灵敏度和特异性达到90 预测从CIN1 CIN2发展到CIN3的风险在52 96 其预测灵敏度是100 特异性是70 可供FISH分析的宫颈细胞样本 宫颈细胞涂片传统宫颈刮片巴氏涂片宫颈细胞TCT制片TCT采集宫颈细胞 子宫颈癌检查 膀胱癌 细胞学检查灵敏度 大约50 60 特异性 大约98 膀胱镜检查侵入性膀胱肿瘤抗原灵敏度较高 但特异性比细胞学要低 膀胱癌检测新发现FISH尿液检查p16缺失 是移行上皮细胞肿瘤发生的早期事件和关键步骤3 7 17染色体的不稳定性与移行上皮细胞肿瘤的浸润行为有关灵敏度 大约80 特异性 大约96 肾癌 肾盂癌鉴别诊断 血尿鉴别诊断 移行上皮细胞肿瘤早期诊断 和移行上皮细胞肿瘤治疗后病程监测的有效手段 前列腺癌 Pca 一种老年男性泌尿生殖系统常见的恶性肿瘤发病率发达国家高于发展中国家欧美 前列腺癌居男性恶性肿瘤的第二位 死亡率仅次于肺癌我国 发病率呈上升趋势 已高居泌尿系肿瘤的第三位 并且发病年龄也日趋年轻化 临床上已经将其作为老年男性常见恶性肿瘤之一 临床表现变化多样 其自然发展规律无法预测晚期可侵及尿道或膀胱颈 引起梗阻症状或刺激症状 如尿频 尿急 尿线变细等 血尿亦较常见PCa早期难以察觉 患者很少引起症状 细胞病理学改变不典型 诊断易受病理检查者主观的影响早期诊断成为治疗和判断预后的关键 PCa临床诊断方法直肠指诊 DRE PSA抗原筛查经直肠超声引导穿刺活检美国 每年5O 75岁无症状的男性进行直肠指诊 DRE PSA检查 当PSA 10ng ml时患癌的几率在50 以上当PSA为4 10ng ml 考虑穿刺活检进一步证实 仅能发现20 40 的PCa患者 漏诊率高当PSA 4ng ml 不主张做穿刺活检 但近年来发现当PSA为2 4ng ml时 20 30 的患者也发现有PCaPSA作为PCa血清学标记不能有效地区分早期PCa和前列腺增生 特异性低 特别是当PSA为2 10ng ml时 有必要研究新的早期PCa诊断方法 有效地筛查出PSA在2 10ng ml范围内的PCa 前列腺癌检测新发现 80 左右PCa存在TMPRSS2与ETS家族的融合改变TMPRSS2 21q22 2男性雄激素调节基因ETS家族为E26转化特异性基因 用于调节细胞分裂 ERG 21q22 3 ETV1 7p21 2 ETV4 17q21 TMPRSS2 ERG55 左右 TMPRSS2 ETV125 左右 TMPRSS2 ETV42 左右TMPRSS2与ERG融合基因能预测PCa的进展缺乏ERG基因改变的PCa显示可观的病因特异性生存率 8年生存率达90 FISH检测TMPRSS2与ERG 21q22 3 ETV1 7p21 2 ETV4 17q21 基因融合成为早期诊断及预后判断的主要手段TMPRSS2 ETV1双色双融合探针25 TMPRSS2 ERG双色双融合探针55 TMPRSS2 ETV4双色双融合探针2 敏感性达到80 以上 特异性达到100 预后判断 2 微小残留病灶检测 检测肿瘤细胞的常见方法 3 预后 FISH检测在乳癌患者中的应用 我国女性的乳腺癌发病率为20 1 10万 GLOBOCAN2002 IARC 新的治疗理念剂量密度和剂量强度新的治疗药物以紫杉醇为代表的传统药物以赫塞汀为代表的靶向药物 乳腺癌靶向治疗 HER2 neu C erbB2 是与乳腺癌细胞增殖有关原癌基因 大约20 25 的乳腺癌病人伴有HER2 neu的高表达 HER2高表达的乳腺癌生存期短 预后差 对一些化疗药物耐药 原癌基因 17q11 2 q12表皮生长因子受体家族的跨膜酪氨酸激酶受体蛋白erbB家族的四个成员之一 参与正常乳腺组织生长与发育的调节当发生点突变而激活 主要表现为基因扩增及mRNA和蛋白质的过度表达Her 2受体表达增多 细胞内酪氨酸激酶的蛋白活化增强 酪氨酸激酶自身磷酸化 信息经细胞膜和细胞间质传至细胞核激活基因 加速细胞的增殖 细胞过度增殖导致肿瘤形成和增长加快目前发现该蛋白可激活c Src前癌基因Her 2的细胞内信号传导通路与细胞内的ras MAPK通路 MAPK依赖性S6激酶通路和磷酸化酶C的 信号传导通路密切相关 HER 2基因靶向药 赫赛汀 Herceptin 1998年被美国FDA批准上市针对癌细胞erbB 2基因靶点的第一个分子靶向药能特异性地抑制有HER 2癌基因扩增的癌细胞生长通过基因工程方法将人IgG的稳定区与鼠的抗HER2蛋白IgG的抗原决定簇嵌合在一起获得对HER一2受体有高度亲和力解决了鼠源性抗体应用于人体的免疫源性问题 下调细胞表面的HER一2蛋白 减少血管内皮生长因子的产生 介导对过度表达HER一2的肿瘤细胞的抗体依赖性细胞毒作用 ADCC 抑制HER一2蛋白与受体酪氨酸激酶超家族的其他成员发生交联形成异质二聚体 减弱细胞生长信号的传递 通过诱导P27kipi和RB相关蛋白P130而大量减少s期细胞数目 增强化疗所致细胞毒性 赫赛汀 Herceptin 抗肿瘤机制 1 基因拷贝2 mRNA转录3 细胞表面受体4 受体细胞外片断 正常细胞 肿瘤细胞 Cytoplasm HER2受体 Cytoplasmicmembrane Nucleus HER2DNA HER2mRNA 1 2 3 4 乳腺癌靶向治疗 Herceptin带来的治疗获益 HER 2检测推荐方法免疫组化 IHC 方法有条件的单位可采用FISH或CISH检测若IHC结果 应由FISH证实 免疫组化 IHC 0 免疫组化 IHC 1 免疫组化 IHC 3 急性非淋巴细胞性白血病的预后分类 细胞遗传学分类 慢性粒细胞性白血病 细胞遗传学和 或FISH检测t 9 22 BCR ABL FISH检测ASS缺失 慢性淋巴细胞性白血病 慢淋 是成人中常见的白血病有的慢淋病人只能存活几个月 而有的病人则能生存超过20年目前的常规检测手段 RaiandBinet 不能很好的预测病人的风险分子细胞遗传学为预后提供关键参数信息通过FISH检测可确定病人所属的预后组 依据平均生存月份划分 32 17p 79 11q 111 normal 114 12q 133 13q 结论 Binet分级 IgVH突变 CD38以及FISH都可独立的作为慢性淋巴细胞性白血病的预后评价手段FISH是一种有效且可靠的预测方法 多发性骨髓瘤 一种B细胞单克隆肿瘤从浆细胞自我增殖演变而来与异常蛋白生成及溶骨性损害相关中老年人群发病黑人及男性发病率高于白人及女性无法治愈对于不同发病风险的患者急需有效的治疗方案 多发性骨髓瘤 标准的预后指标 与预后有关 血清 2 微球蛋白C 反应蛋白 CRP 骨髓浆细胞形态学浆细胞增殖 浆细胞标记指标 基因组标记 非常重要 多发性骨髓瘤 应用FISH方法确定的三个预后组 预后差 t 4 14 p16 q32 t 14 16 q32 q23 17p13 24 7个月 预后中等 13q14 42 3个月 预后好 其他 50 5个月 成人急性淋巴细胞性白血病的预后分类Favorablerisk medianDFS 3years Normalorisolated9p p15 p16deletionsIntermediaterisk medianDFS19months 6qdeletions hyperdiploidy andmiscellaneousaberrationsUnfavorablerisk medianDFS7months t 9 22 BCR A