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沃登编辑 医学论文中统计分析错误辨析与释疑(17) 实验设计原则的正确把握一、均衡原则及其作用均衡原则的概念:均衡原则是实验设计4 个基本原则之一,可以这样说:均衡原则(包括对偏性的控制,如分层取样、盲法分组等) 是实验设计4 个基本原则中最核心的内容,起着统观全局的作用。所谓均衡,就是指某因素各水平组中的受试对象所受有人认为“ 含在“随机、对照、是不够正确的,因为我们可以举出很多实例,他们都按这3 个原则实施了,但很多组间却缺乏可比性,其实质就是无视“均衡原则”所致。因此,没有必要为了减少一个原则而招来很多麻烦、甚至可以避免的错误。一项科研工作,在这4 个基本原则中任何一个原则上出了问题,其结论很可能就是错误的;另一个关于“均衡原则”的误区就是认为“均衡等价于实验中所有组之间都具有高度的可比性”,这在多因素实验研究的场合中是不成立的。例如:人们常设计如下的实验:第1 组为空白对照组,第2 组为单用A 药组,第3 组为单用B 药组,第4 组为A 、B 药联合使用组。即使4 组中的受试对象具有高度的可比性,但第1 组与第4 组之间的可比性也是很差的,由于他们之间的差别无法被清楚地进行解释,不知是A 药的作用、是B 药的作用,还是A 与B 药的交互作用。因为这两组之间不是一个因素两种水平影响的结果,而是“A 药用否”和“B 药用否”这两个因素4 种水平组合中的两种极端情况,即两药都不用相对于两药都用。均衡原则的作用:确保实验因素各水平组间不受其他实验因素或重要的非实验因素的不平衡的干扰和影响,以便使所考察的实验因素取不同水平条育,这两组学生在重要的非处理因素(即是否吃面包) 方面是不均衡的,故其结论是不可信的。只有一半学生吃不含赖氨酸的面包,另一半学生吃含赖氨酸的面包(每个面包的大小应相同、制做面包的原料也应相同),其他(如锻炼身体情况、作息时间等) 各方面两组学生应尽可能一致,1 年结束时再比较,才有可能说明“赖氨酸”的价值有多大。提高均衡性的策略:其一,研究设计者本身应具有较丰富的专业知识和统计学知识,对拟研究的课题的基本情况有较为全面地掌握,对相关的文献资料比较熟悉,对相关的实验技术、难点和可能出现的异常现象比较了解,并有一定的把握。其二,实验设计方案初稿制定出来以后,研究者不仅自己要反复修改,还应请几位同行专家帮助修改,以弥补个别人在某些专业知识方面的不足,从专业角度使实验设计方案进一步完善。其三,一般来说,经过同行专家审阅后的实验设计方案,从专业角度看是不会有太大问题的。但这并不能保证它在统计学方面是无可置疑的。因此,请一、二位对统计学研究得较深入的统计学工作者严把实验设计方案的质量关是很有必要的。因为对于同一个问题,实际工作者与统计学工作者考虑问题的角度往往是不同的,统计学工作者能够结合具体问题和实验设计的4 个基本原则提出各种可能的问题和建议,这将十分有利于修改和完善实验设计方案。二、违背均衡原则的案例例1 某项研究的目的: 观察联合用药治疗大鼠早期矽肺的治疗效果。方法:石英粉尘20 mg/ 只建立模型;采用低剂量不同抗矽药物分别治疗60 d 及150 d 后宰杀。给药组分别为克矽平、汉防己甲素、羟基磷酸哌嗪、柠檬酸铝单一用药组;克矽平+ 汉防己甲素、汉防己甲素+ 羟基磷酸哌嗪、羟基磷酸哌嗪+ 柠檬酸铝联合用药组。另有生理盐水正常对照组和石英阳性对照组。分别称量大鼠全肺湿重、干重,测定大鼠全肺胶原蛋白,结果见表1 、表2, 按单因素k(k 3) 水平设计资料进行方差分析,差异有显著意义,再进一步用q 检验进行两两比较。无论是预防性治疗60 d 或是150 d 组,均以“柠铝+ 羟哌”和“汉甲素+ 羟哌”的疗效最好,明显优于单一给药组的疗效“,克矽平+ 汉甲素”组在150 d 治疗时也优于单一给药组。表1 大鼠矽肺预防性治疗60 d 各疗效指标的测定结果全肺湿重组别动物克矽平汉甲素羟哌柠铝克矽平+ 汉甲素汉甲素+ 羟哌柠铝+ 羟哌石英对照盐水对照数6 6 6 6 6 6 6 6 6 0. 62 3 2. 85 0. 36 3 3 0. 57 3. 03 0. 43 3 3 0. 61 2. 86 0. 37 3 3 0. 51 3. 67 1. 05 3 3 0. 74 2. 70 0. 31 3 3 0. 55 2. 50 0. 31 3 3 0. 51 4. 95 0. 75 1. 86 0. 16 0. 39 0. 08 3 0. 70 0. 36 0. 05 3 0. 64 0. 37 0. 06 3 3 0. 66 0. 34 0. 05 3 3 0. 61 0. 40 0. 11 3 3 0. 71 0. 33 0. 05 3 3 0. 59 0. 30 0. 03 3 3 0. 54 0. 56 0. 09 0. 27 0. 05 T/ C 83. 53 10. 85 3 0. 64 83. 77 15. 91 3 3 0. 64 84. 14 14. 76 3 3 0. 65 75. 28 9. 88 3 3 0. 58 98. 26 26. 66 3 3 0. 75 74. 65 16. 17 3 3 0. 57 64. 77 6. 04 3 3 0. 50 130. 35 26. 65 51. 26 11. 03 注:T/ C 为治疗组与石英组该指标的比值; q 检验,与石英组相比3 P 0.05 , 33 P 0. 01 对差错的辨析与释疑:原作者实验设计的目的主要是考查联合用药能否增加疗效, 按单因素k (k 3) 水平设计资料进行方差分析,由于各组中并不全是单因素的每个水平,联合用药组则涉及到多个因素不同水平的组合,这样分析显然是欠合理的, 即使某个联合用药组的疗效好于其他组,但表中没有列出的其他的联合用药组疗效是否会更好,则不得而知。显然,很多组之间在某些方面是不可比的, 即属于“对照不全”,其本质是违反了实验设计“均衡原则”。仔细考查此资料,不难发现此资料涉及表2 大鼠矽肺预防性治疗150 d 各疗效指标的测定结果全肺湿重全肺干重全肺胶原含量动物(g) (g) (mg)组别数x s T/ C x s T/ C x s T/ C 克矽平6 3. 56 0.75 0.35 161. 66 0. 77 3 0. 05 33 0.67 33.28 33 0. 62 汉甲素6 3. 31 0. 33 145. 36 0. 55 33 0.70 0.05 33 0.63 32.41 33 0. 56 3. 62 0. 39 188. 59 羟哌6 0.50 0.76 0.05 3 0.73 32.04 33 0. 72 柠铝6 3. 22 0. 32 136. 62 0. 44 33 0.68 0.05 33 0.61 26.51 33 0. 52 克矽平+ 汉甲素6 2. 91 0. 32 148. 31 0. 38 33 0.61 0.05 33 0.61 30.45 33 0. 57 2. 89 0. 29 139. 97 汉甲素+ 羟哌6 0. 26 33 0.61 0.03 33 0.56 14.90 33 0. 53 2. 70 0. 31 127. 75 柠铝+ 羟哌6 0. 08 33 0.60 20.50 33 0. 49 0. 52 261. 48 6 0.03 22.37 2. 03 0. 18 65. 81 6 0.50 0.04 22.34 注:T/ C 为治疗组与石英组该指标的比值; q 检验,与石英组相比3 P 0.05 , 33P 0. 01 到5 个实验因素,即“克矽平用否”、“汉甲素用否”、“羟哌用否”“、柠铝用否”及“疗程”,每个因素2 个水平,故应考虑采用5 因素的析因设计,这样不但能分析出每个因素的实验效应,而且能够分析任意几个因素之间的交互作用效应的大小。5 个2 水平因素的全面组合形成32 个实验条件,每个实验条件下做2 次独立重复实验(这样才能分析各级交互作用的效应),总共需要64 只动物,仅比原作者所用的一半动物数(54 只) 多10 只,研究者应该可以承受。按照析因设计资料所对应的方法进行方差分析,可以分析出任意因素及其组合的效应,找出较好的治疗方案来,由于采用了完善的实验设计方案,精确地估计和控制了误差,结果更可靠。例2 有人在研究耐力训练与提高战士体质的关系时,设计了如下的实验:以血乳酸为主要观察指标,20 名连队的战士按训练方案进行耐力训练,以机关同龄的20 名战士为对照,对照组进行日常活动,观察经4 周训练后,两组战士进行一定量的运动时血乳酸的变化,结果见表3 。原文结论:按此方案训练能够降低运动时血乳酸蓄积,提高战士的耐力。对差错的辨析与释疑:对照组选择不合理,对照组除训练因素外,其他应尽可能与实验组一致,而机表3 两组战士训练前后血乳酸的观测结果组别血乳酸(mg/ L) 训练前训练后训练组38. 2 3. 5 33. 1 3. 1 3 3 对照组40. 0 4. 0 38. 9 3. 5 注: 33 与训练前比P 0. 01 ; 与对照组比P 0. 01 关战士和连队的战士由于工作性质不同,体能的基础可能存在较大的差别,一开始两组之间就不具备可比性。也就是说,此实验研究违反了实验设计“均衡原则”,其结论没有说服力。此研究回答了一个问题,即耐力训练提高了战士的耐力,这种结论毫无意义。因人们早就认识到了训练和不训练不一样,而应研究不同训练方案对提高战士体质之间的差异有无显著意义,以探索最大限度地提高战士体质的最痛的药物如消心痛、倍他乐克等连续治疗1918d 216 d (1327 d) 。3 组根据病情需要加用静脉滴注硝酸甘油。观察指标为: (1) 心绞痛变化:记录每日发作次数和持续时间,以观察心绞痛症状治疗的效果; (2) 心电图变化:治疗前与治疗后每天做心电图, 并记录ST2T 变化程度,到治疗截止时心电图恢复情况(恢复、部分恢复、无恢复) ; (3) 观察治疗前后血压和心率的变化。 能说清到底是3 种药物的作用还是硝酸甘油的作佳方案。另外,分组时,连队战士和机关战士都应随机抽取,然后将各自的总样本含量的一半随机分入 实验组和对照组。对差错的辨析与释疑:原文的目的是比较3 种治疗方法的疗效,但在设计时却规定可根据病情需要加用硝酸甘油,我们知道硝酸甘油会改善心绞痛的症状,这就使得各组的效应既包括各药物的效应, 又包括硝酸甘油的效应,混杂在一起,分析完毕也不 就会越好。各组患者的治疗时间不等,对3 种药物例3 原文题目:血清高敏C2反应蛋白在心血管病变中的表达特性。原作者探讨心血管病变血清高敏C2反应蛋白的表达特性。采用胶乳增强免疫(超敏) 比浊法, 定量检测健康对照组340 名, 男191 名,女149 名,年龄1972 岁(排除明显炎症感染个体);冠脉造影患者341 例,男245 名,女96 名, 年龄2980 岁;急性心肌梗死患者86 例,男70 例, 女16 例,年龄4289 岁。在健康对照组年龄分组中,50 岁以上的人数只有20 人。对差错的辨析与释疑:根据常识,心血管系统疾病大都发生在年龄较大的人身上,就是说年龄越大心血管病患者就越多, 本例中健康人年龄分组在50 岁以上的人数大大少于其他组。应在实验设计时,结合专业知识,各性别组样本例数、各年龄段例数都应分别接近,本资料健康人对照组应多选取年龄较大的人,这样与其他组相比较更有说服力。例4 原文题目:硬膜外注入布比卡因吗啡复合液治疗不稳定性心绞痛的临床观察。不稳定性心绞痛患者60 例,随机分为3 组,每组20 例。3 组病例性别、年龄及病程构成无显著差异。布比卡因组(A 组) 先胸椎硬膜外穿刺,首次注入015% 布比卡因5 ml, 然后连接电脑控制微量注射泵以4 ml/ h 速度连续给予010625 % 布比卡因,连续1516d 218d (922 d) ;布比卡因吗啡复合液组(B 组) 胸椎硬膜外穿刺后,用微量泵以4 ml/ h 速度给予010625 % 布比卡因与10 g/ ml 吗啡复合液,连续1216d 213 d(716 d) ;对照组(C 组) 采用内科常规治疗心绞的疗效进行评价也是缺乏说服力的。进行实验设计时,对混杂因素的处理特别重要,有些方案,表面上考虑了一些重要的非实验因素的均衡问题,但如果考虑不周,哪怕忽略了一个混杂因素,也会导致实验设计的失败。应控制混杂因素的干扰,各组患者都应禁止加用硝酸甘油,如果出于治疗的需要必须加用,要注明加用的次数和剂量,以便后期统计分析时加以处理。各组患者的治疗时间应根据专业知识确定统一的观察时间,以使各组具有较好的可比性。例5 原文题目:健康儿童血清透明质酸水平。原作者系统观察了07 岁的健康儿童血清透明质酸(HA) 与年龄的关系,得出健康儿童血清HA 含量与年龄之间呈密切负相关关系, r =-018169 , P 0101 。资料见表4 。表4 668 名健康儿童血清HA 水平年龄新生儿例数(男/ 女) 37 (20/ 17) HA ( x s , ng/ ml) 778 170 1 个月41 (21