ARMS法检测

,ARMS法,ARMS法技术ARMS法与测序法比较ARMS原理ARMS应用,目前，突变扩增阻滞系统（amplification refractory mutation system，ARMS）已成为国际上肿瘤个体化分子检测最重要、最先进的技术之一，其在临床应用中的优势已被业内专家广泛认可。,ARMS技术优点,ARMS方法检测灵敏度明显高于直接测序法等其他方法（表1），可检测出样品中含量低至0.1-1.0%的突变基因；该方法在设计上可以最大限度地缩短目标产物的长度，可以解决石蜡包埋组织标本提取的DNA大部分片段化而无法得到准确检测结果的难点；该方法结合实时PCR平台实现扩增时闭管操作，操作简单，无需产物的后处理，能最大程度地避免扩增产物的污染。,表1 ARMS法与测序法比较,其中ARMS检测可以分为实时荧光定量PCR和巢式ARMS法电泳检测。,实时荧光定量PCR,ARMS技术利用特异引物对突变靶序列进行高精准PCR扩增放大，与此同时，利用探针对扩增产物进行检测，在实时荧光定量 PCR平台上实现对样品DNA中稀有突变的检测，以达到对基因突变检测的高特异性和高灵敏度。,该技术所用探针为 Scorpion 探针， Scorpion 探针是一种新型的探针， 由一条发夹结构的探针和一条引物构成， 探针的 5 端和 3 端分别标有报告荧光和淬灭荧光， 3端通过PCR blocker（一个非扩增的单体 , 防止探针退火后的延伸）与引物的 5 端相连。 在自由状态， 报告荧光和淬灭荧光很接近， 不产生荧光。 变性阶段茎环结构打开， 退火时引物与模板结合并延伸， 环区与新合成的目的基因的互补区域结合， 此时 Scorpion 探针与 PCR 产物在同一条 DNA 链上， 是分子内的结合。 由于发夹结构打开， 报告荧光和淬灭荧光分离， 因此可检测到报告荧光发出的荧光信号。 由于 Scorpion 探针中序列特异性引物和探针在同一分子上， 因此信号的产生特别快。,巢式ARMS法电泳检测,利用PCR引物的3端末位碱基必须与其模板DNA互补才能有效扩增的原理，设计等位基因特异性 PCR扩增引物，在严格的条件下，只有在引物3碱基与模板配对时才能出现PCR扩增带，从而检测出突变，该法省去了探针杂交操作。,基本原理,在PCR扩增时，引物的延伸是从其3未端开始的，而这种延伸的进行要求引物3端 的碱基与模板需完全配对，只有这样引物才能延伸，扩增才得以进行下去而得到预期 的扩增产物，若引物3端与模板不能配对，则引物的延伸即阻断，不能得到相对应的 扩增产物，基于以上事实，可利用3端含突变碱基的引物来检测靶DNA中有无相应的 突变位点，此即3特异PCR，扩增阻滞突变系统及等位特异PCR.该反应系统包含两个 PCR扩增反应，有两对引物但它们的3端有差异，一为正常引物，另一为3端编食突 变的引物，正常引物只与正常模板互解，PCR时扩增相应的产物，而食突变的引物只 与突变的模板附扩增出相应的产物.扩增完成后可直接同琼脂糖电泳技术检测分析结 果。,碱基配合、或错配，决定PCR能不能进行PCR产物一边长，而另一边短，通过电泳，就可以方便地确定哪一边扩出来了，就是碱基配合的；反之，没有扩出来的，那一边引物的最后一个碱基是错配的2组对称的实验，把最终的SNP型确定下来。,利用该系统进行基因突变检测时不仅能检出突变的纯合子，而且能检出杂合子个 体，在这种情况下，同一个体的DNA模板利用突变引物和正常引物均能引发扩增反应. 尚可利用多对突变引物和正常引物进行多重3-特异PCR，可攻DNA分子上的多位点变 化的鉴定准确快速，简便。,应用,目前利用ARMS法研发用于临床的试剂盒有：人KRAS基因突变检测试剂盒(Taqman-ARMS法) 本试剂盒用于检测大肠癌患者癌组织中KRAS基因的热点突变情况，可定性检测KRAS基因外显子2中第12密码子(G12D(35GA)、G12A(35GC)、G12V(35GT)和13密码子(G13D(38GA)的四个热点突变位点。,ARMS-PCR法四项耳聋基因检测试剂盒近日，中生北控生物科技股份有限公司分子诊断试剂研发部开发的ARMS-PCR法四项耳聋基因检测试剂盒经中检所检测，顺利通过国家药监部门的审核，获得国家食品药品监督管理局颁发的医疗器械注册证，注册号为：国食药监械（准）字2012第3400599号。 四项耳聋基因检测试剂盒用于定性检测人血细胞中基因组DNA中与遗传性耳聋相关的3个基因中的 4个突变位点，即GJB2基因235delC；SLC26A4基因IVS 7-2 AG；线粒体12Sr RNA基因1555AG和1494CT。这4个位点是中国人最常见的耳聋突变位点。通过对上述位点的检测，比常规听力筛查的1阳性检出率提高20倍。四项耳聋基因检测试剂盒检测适应人群为，需要使用氨基糖苷类抗生素的人群、产前筛查、新生儿筛查以及各种不明原因的耳聋人群。尤其针对每一个新生儿在其成长过程中，使用该产品让父母都能了解自己孩子听力方面内在的优势和劣势，能够做到清楚、科学地应对由于自身基因缺陷而面临的潜在听力危机，通过有效避免不良因素的干扰，保证孩子在一个健康的听力状况下成长。,人KIF5B-RET融合基因检测试剂盒（ARMS-荧光PCR法）本试剂盒用于定性检测非小细胞肺癌等患者KIF5B-RET融合基因7种融合型，产品包含独家稳定剂，在达到1%高灵敏度的前提下，仍可保证高特异性，避免假阳性。检测结果可供医生在非小细胞肺癌患者中选择适合Ret抑制剂的靶向药物治疗的人群时参考。检测结果仅可用于临床参考，不可作为诊治的唯一依据。仅可用于体外检测。,人类BRAF基因突变检测试剂盒（ARMS-荧光PCR法）（广州好芝生物科技有限公司）本试剂盒以石蜡包埋病理切片组织中提取的DNA 为检测样本，定性检测肿瘤患者体细胞的BRAF 基因V600E 突变状态，用于辅助临床甲状腺癌诊断、分型，或对黑色素瘤、结直肠癌的酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKIs）和BRAF 基因突变靶向药物选用提供参考。,ADx-ARMSPDGFRA基因D842V突变检测试剂盒（厦门艾德生物医药有限公司）PDGFRA基因编码的蛋白质是血小板衍生生长因子受体A(Pdgfr-a),为一种单链跨膜糖蛋白，与C-KIT同属III型酪氨酸蛋白激酶家族，且结构相似，两者的氨基酸序列有很高的同源性。PDGFRA与配体PDGF结合后形成受体配体复合物并活化PDGFRA，从而激活*脂酰肌醇、cAMP及多种蛋白质的*酸化途径，通过各种信号转导通路将有丝分裂等信号传递入细胞核，诱导相应基因表达，促进DNA合成，引起细胞分裂和增殖。当受体或配体发生异常突变，可导致恶性肿瘤。,人EGFR基因29种突变型检测试剂盒（PCR-荧光探针法）本检测试剂盒采用PCR方法结合荧光探针的体外扩增和和检测技术，适合于检测非小细胞肺癌病人血清或血浆、组织样本中的EGFR基因29种常见突变型，该检测试剂盒仅用于科学研究使用。,目前用于科学研究阶段的有：地贫ARMS法4种常见突变诊断试剂盒 该试剂盒应用于产前基因诊断，应用该试剂盒检查了95例地贫的常见突变，获得了满意的结果。对一个重型地贫家系4例基因型的检测也证明这种检测方法的可行性和可靠性。,ARMS法检测G6PD应用突变特异性扩增系统(amplification refractory mutation system,ARMS)检测江西省常见的3种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)缺乏症突变基因G1376T、G1388A、A95G.方法用ARMS法对40例江西籍经G6