抗生素类药物的分析

第十四章,抗生素类药物的分析,第一节 概述,抗生素的定义,在低微浓度下即可对某些生物（病原微生物）的生命活动有特异抑制作用的化学物质的总称 抗生素是细菌、放线菌和真菌等微生物的代谢产物，对各种病原微生物有强大的抑制或杀灭作用。,一、抗生素类药物的特点,1.化学纯度低同系物多：结构相似、分子组成相差若干个“CH2”原子团的有机化合物互相称为同系物。异构体多：化学式相同而结构不同的化合物。降解物多:四环素差向异构体,一、抗生素类药物的特点,2.活性组分易发生变异微生物菌株的变化、发酵条件改变3.稳定性差抗生素的活性基团稳定性差,二、抗生素类药物的质量分析,主要内容：鉴别、检查、含量测定（效价测定）方法分类：理化方法和生物学方法,二、抗生素类药物的质量分析,（一）鉴别试验1.化学方法利用某些官能团的特性，利用适当的试液与其反应显色2.物理化学方法UV、IR、TLC、GC、HPLC等3.生物学方法特异的酶反应或其他反应,二、抗生素类药物的质量分析,（二）杂质检查1.影响产品稳定性的指标水分、酸碱度、干燥失重2.控制有机、无机杂质的指标溶液的澄清度与颜色、重金属、残留溶剂、炽灼残渣,二、抗生素类药物的质量分析,（二）杂质检查3.与临床安全性密切相关的指标热源、细菌内毒素、无菌、降压物质、异常毒性4.其他指标-内酰胺类抗生素：聚合物,热原：系指能引起恒温动物体温异常升高的致热物质，某些细菌的代谢产物、细菌尸体及内毒素。内毒素是革兰氏阴性细菌细胞壁中的一种成分，叫做脂多糖。只有当细菌死亡溶解或用人工方法破坏菌细胞后才释放出来引起发热、微循环障碍、内毒素休克及播散性血管内凝血等。,（三）含量测定或效价测定,1.微生物检定法,以抗生素对微生物的杀伤或抑制程度为指标来衡量抗生素效价的一种方法。,（三）含量测定或效价测定,1.微生物检定法,2.理化方法,适用于提纯的以及化学结构已确定的抗生素,3.抗生素活性表示方法,抗生素的活性以效价单位表示：每ml或每mg中含有某种抗生素的有效成分的多少用单位（u）或微克（ug）表示如：1mg青霉素钠定为1670单位；1mg硫酸卡那霉素定为670单位1mg青霉素钾单位（u）=1598u/mg,三、抗生素的分类（按结构与性质）： 内酰胺类、 氨基糖苷类、 四环素类、 大环内酯类、 氯霉素类、 其他抗生素类,第二节 内酰胺类抗生素,青霉素类6-APA,头孢菌素类7-ACA,结构特点游离羧基酰胺侧链氢化噻唑环或氢化噻嗪环与-内酰胺合并,青霉素,（青霉素G、苄青霉素）,氨苄西林（氨苄青霉素）,阿莫西林（羟氨苄青霉素）,普鲁卡因青霉素,头孢氨苄,头孢拉定,头孢羟氨苄,头孢噻吩钠,（二）性质,酸性与溶解性旋光性紫外吸收特征-酰胺环的不稳定性,与碱金属(Na+、K+)成盐,1.酸性和溶解度,易溶于水,与有机碱(普鲁卡因)成盐,难溶于水，易溶于甲醇,普鲁卡因青霉素,2.旋光性,头孢菌素类 C6 C7,青霉素类 C3 C5 C6,3.紫外吸收特征,青霉素类 母核无明显UV 多数有苯环取代基,4. -内酰胺环的不稳定性,不稳定性因素,四元环张力大,酰胺键易水解,4. -内酰胺环的不稳定性,稳定性与含水量和纯度密切相关干燥纯净条件下，较稳定室温保存3年以上；60保存6周；1501.5小时后降解水溶液不稳定：青霉素水溶液在pH6-6.8时较稳定；酸、碱、青霉素酶、金属离子、氧化剂作用下变质,例,青霉素的降解反应,青霉素,青霉噻唑酸,H2O/OH,青霉素酶,青霉酸,H2O,pH2,100,青霉噻唑酰基羟胺酸,NH2OH,青霉烯酸,pH4,青霉胺,CO2,青霉醛,HgCl2,（一）显色反应,1. 羟肟酸铁反应,-内酰胺类,NaOH,呈色,二、鉴别,2. 双缩脲反应,-内酰胺类,（开环分解）,似肽键,2. 茚三酮反应,-氨基,3. 与重氮苯磺酸反应,（偶合）,头孢哌酮,（二）沉淀反应,1. 青霉素盐的沉淀反应,沉淀在过量HCl或有机溶剂（乙醇、三氯甲烷、乙醚）中溶解,2.重氮化 - 偶合反应,重氮化-偶合反应,芳伯氨基,取本品，加醋酸-醋酸钠缓冲液制成每1ml中含50微克的溶液，量取10ml，在水浴中加热30分钟，立即冷却，以未加热的供试品缓冲液做空白，在339nm波长处有最大吸收，吸光度约为0.6,药典对本类抗生素的鉴别几乎均采用该法,对照品对照法,三、特殊杂质的检查,高分子杂质检查头孢他啶、头孢曲松钠、头孢哌酮钠等规定了各自聚合物的检查分子排阻色潽法、离子交换色谱法、反相色谱法吸光度检查青霉素钠吸光度：取本品，加水制成每1ml中含1.80mg的溶液，照紫外-可分光光度法，在280nm的波长处测定吸光度，不得大于0.10；在264nm 的波长处有最大吸收，吸光度应为0.80-0.88,四、含量测定,微生物检定法汞量法HPLC,（水解）,青霉素与汞盐不反应，降解产物青霉噻唑酸及其继续水解生成的青霉素胺与汞盐反应，据此可测得降解杂质的含量氢化噻唑环开环形成巯基化合物与汞定量反应，可测得总青霉素含量,2.方法,青霉素钠含量测定,取本品约50mg，精密称定，加水5ml溶解后，加1mol/L氢氧化钠溶液5ml，摇匀，放置15分钟，加1mol/L硝酸溶液5ml，醋酸盐缓冲(pH4.6)20ml及水20ml，摇匀，照电位滴定法，在3540，用硝酸汞滴定液(0.02mol/L)缓慢滴定（控制滴定过程约为15分钟）。每1ml硝酸汞滴定(0.02mol/L)相当于7.128mg的总青霉素,另取本品约0.5g，精密称定，加水与上述醋酸盐缓冲液各25ml，振摇使完全溶解，在室温下，立即用硝酸汞滴定液(0.02mol/L)滴定，终点判断方法同上。每1ml硝酸汞滴定液（0.02mol/L）相当于7.128mg的降解物。 总青霉素的百分含量与降解物的百分含量之差值即为青霉素的含量。,含量,大多数药物采用此法,特点 快速、高效、灵敏 专属性强、重现性好 一法多用（鉴别、检查、含测）,第三节 氨基糖苷类抗生素,第三节 氨基糖苷类抗生素,常见药物：硫酸链霉素 硫酸阿米卡星新霉素 卡那霉素硫酸庆大霉素 妥布霉素,氨基环醇与氨基糖缩合形成含有多羟基，又称为多羟基抗生素,链霉胍,链霉糖,N-甲基-L-葡萄糖胺,链霉胍 + 链霉糖 + N-甲基-L-葡萄糖胺,苷键,链霉胍,链霉糖,N-甲基-L-葡萄糖胺,碱性中心,可与无机酸或有机酸形成可溶于水的盐，临床常用其硫酸盐,绛红糖胺,绛红糖胺,氨基环醇（脱氧链霉胺）,加洛糖胺,加洛糖胺,绛红糖胺 + 脱氧链霉胺 + 加洛糖胺,庆大霉素C1 R=H R1、R2=CH3 庆大霉素C2 R=R2=H R1=CH3 庆大霉素C1a R、R1、R2=H 庆大霉素C2a R=CH3 R1= R2=H 庆大霉素C2b R=R1=H R2=CH3,几种庆大霉素的结构,多与硫酸成盐,碱性,1,2.旋光性 氨基糖具有旋光性,链霉素 pH47庆大霉素 pH212,链霉素的水解酸性：链霉胍、链霉糖+N-甲基-L-葡萄糖胺碱性：重排，生成麦芽酚（特有）,水解产物,链霉素在230nm处有紫外吸收庆大霉素无紫外吸收,硫酸庆大霉素的鉴别：取本品约5mg，加水1ml溶解后，加0.1%茚三酮的水饱和正丁醇溶液1ml与吡啶0.5ml，在水浴中加热5分钟，即呈紫蓝色,链霉胍特有反应,方法：取本品0.5mg，加水4ml溶解，加氢氧化钠试液2.5ml与0.1%8-羟基喹啉的乙醇溶液1ml，放冷至15，加次溴酸钠试液3滴，即显橙红色,链霉糖特有反应,链霉糖特有反应,硫酸链霉素的反应：取本品约20mg，加水5ml溶解后，加氢氧化钠溶液0.3ml，置水浴上加热5分钟，加硫酸铁铵溶液0.5ml，即显紫红色,吡咯衍生物,红色,硫酸盐的鉴别反应,H+,P195：硫酸庆大霉素的鉴别,链霉素杂质,链霉素B（水解后为甘露糖、链霉素）,3. 方法 TLC中的对照品法,来源 反应中间体特点 活性仅为链霉素的20%-25%,薄层色谱法检查链霉素B,取本品0.25g，精密称定，置回流瓶中，加5ml新鲜配制的硫酸-甲醇溶液溶解，加热回流1小时，冷却，用甲醇冲洗冷凝管，合并冲洗液，并用甲醇定量稀释成每1ml中含10mg的溶液，作为供试品溶液。,薄层色谱法检查链霉素B,精密称取甘露糖对照品36mg，置回流瓶中，同法处理后定量制成每1ml中含72ug的溶液，作为对照溶液取上述溶液，点于同一薄层板上，展开，晾干，显色供试品溶液所显链霉素B斑点的颜色与对照溶液主斑点比较，不得更深,四、含量测定,微生物检定法 本法系利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用量反应平行线原理的设计，比较标准品与供试品两者对接种的试验菌产生抑菌圈的大小，以测定供试品效价的一种方法。,第四节 四环素类抗生素,A,B,C,D,四并苯或萘并萘,结构特点：二甲氨基、酰胺基、酚羟基酮基和烯醇基的共轭双键结构,金霉素 (CTC) chlortetracycline,氯四环素,土霉素 (OTC) oxytetracycline,氧四环素,多西环素 (DOTC) doxycycline,脱氧土霉素,美他环素（METC） metacycline,与酸、碱均能成盐,强酸或强碱中溶解度临床常用其盐酸盐,酚羟基、烯醇型羟基 弱酸性,二甲胺基 弱碱性,2.溶解性和引湿性,pH4.5-7.2，难溶于水pH低于4或高于8，溶解度增大具引湿性，含有结晶水,3.旋光性 用于定性或定量4.紫外吸收和荧光性质土霉素的酸性溶液在353nm处的百分吸光系数为270-290多西环素酸性甲醇溶液在349nm处的百分吸光系数为325-363在紫外光照射下产生荧光，降解产物也具有荧光,5、不稳定性,差向异构化反应：pH2-6酸性条件下降解：脱水碱性条件下降解：C环打开,对各种氧化剂、酸、碱都不稳定。干燥避光较稳定。,淡