翻译及其调控

翻译及其调控,复旦大学药学院生化教研室,蛋白质生物合成（protein biosynthesis）,是指DNA结构基因中贮存的遗传信息，通过转录生成mRNA，再指导多肽链合成的过程。蛋白质的生物合成过程也称为翻译（translation）。,本章学习内容,1.蛋白质生物合成过程（掌握）2.蛋白质合成后的折叠与加工（熟悉）3.蛋白质的转运与定位（熟悉）4.蛋白质合成的调控（了解）,第一节 蛋白质的生物合成,一、蛋白质的合成体系氨基酸原料，mRNA，tRNA，核糖体，各种蛋白质因子和酶类，ATP，GTP，无机离子等。（一）蛋白质生物合成的模板-mRNA1.原核生物翻译模板mRNA的特点1）多顺反子；2）转录产物不需加工即可作为翻译的模板；3）SD序列2.真核生物翻译模板mRNA的特点1）单顺反子；2）转录和翻译在不同时空；3）5端帽子结构及Kozak序列。,单顺反子与多顺反子,原核生物SD序列,真核生物Kozak序列:kozak序列：起始密码子处的一段保守序列，-CCACCAUGG-，用于增强翻译起始的效率,SD序列是mRNA与核糖体识别、结合的位点。,3.mRNA遗传密码的特点：1.方向性2.连续性3.兼并性简并性(degeneracy)：多数氨基酸拥有一个以上的密码子；多少与该氨基酸在生物中的利用度相关；4.摆动性：摆动性(wobble)：密码子与反密码子配对的摆动现象；5.通用性,遗传密码（genetic code)及密码的破译,遗传密码无细胞体系体外翻译：特点：翻译起始点随机； 阅读框架随机。,ACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACAC,ACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACAC,ACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACAC,ACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACAC,ORF1,ORF2,ORF3,AACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAAC,AACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAAC,AACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAAC,AACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAAC,ORF1,ORF2,ORF3,Nirenberg破译密码子,同位素标记某种氨基酰tRNA,核蛋白体,某种三核苷酸寡聚体（密码子）,硝酸纤维素膜放射显影,滤过硝酸纤维素膜,AGA,UCA,UGA,64管,硝酸纤维素膜可截留核蛋白体，不能截留游离的氨基酰tRNA和三核苷酸寡聚体,氨基酰tRNA如果能识别并结合某种密码子，则将与核蛋白体形成“核蛋白体-氨基酰tRNA-密码子复合体”,Amber,ochre,and opal nomenclature,Stop codons were historically given many different names, as they each corresponded to a distinct class of mutants that all behaved in a similar manner. These mutants were first isolated within bacteriophages (T4 and lambda), viruses that infect the bacteria Escherichia coli. Mutations in viral genes weakened their infectious ability, sometimes creating viruses that were able to infect and grow within only certain varieties of E coli.Amber mutationswere the first set of nonsense mutations to be discovered, isolated by graduate student Harris Bernstein in experiments designed to resolve a debate between Richard Epstein and Charles Steinberg. Bernstein (whose last name means amber in German) had been offered the reward of having any discovered mutants named after himself.Viruses with amber mutations are characterized by their ability to infect only certain strains of bacteria, known as amber suppressors. These bacteria carry their own mutation that allow a recovery of function in the mutant viruses. For example, a mutation in the tRNA that recognizes the amber stop codon allows translation to read through the codon and produce full-length protein, thereby recovering the normal form of the protein and suppressing the amber mutation. Thus, amber mutants are an entire class of virus mutants that can grow in bacteria that contain amber suppressor mutations.ochre mutationwas the second stop codon mutation to be discovered. Given a color name to match the name of amber mutants, ochre mutant viruses had a similar property in that they recovered infectious ability within certain suppressor strains of bacteria. The set of ochre suppressors was distinct from amber suppressors, so ochre mutants were inferred to correspond to a different nucleotide triplet. Through a series of mutation experiments comparing these mutants with each other and other known amino acid codons, Sydney Brenner concluded that the amber and ochre mutations corresponded to the nucleotide triplets UAG and UAA.opal mutations or umber mutationsthe third and last stop codon in the standard genetic code was discovered soon after, corresponding to the nucleotide triplet UGA. Nonsense mutations that created this premature stop codon were later called opal mutations or umber mutations,阅读框架 ( reading frames) mRNA中的一段含有翻译密码的碱基序列。*mRNA的阅读和翻译以连续和不重叠的方式进行；,开放阅读框架：从起始密码AUG开始到终止密码子处的正确可读序列。一般一条真核生物mRNA序列只编码一条蛋白质多肽链。只在噬菌体中存在基因重叠现象。,遗传密码的摆动性,遗传密码的摆动性,（二）蛋白质合成的场所核糖体由蛋白质、rRNA以及Mg2+组成，一般为两个亚基，一大一小。,核糖体上功能位点：,（三）蛋白质合成的搬运工具tRNA,1.氨基酸的活化与氨基酰-tRNA合成酶,黄色碱基为识别必须位点,AA + tRNA 氨基酰-tRNA细胞中一般只有二十种氨基酰-tRNA合成酶，不同tRNA与同一氨基酸的结合均由同一个酶催化。合成酶有很强的校对功能。,氨基酰-tRNA合成酶催化的反应,氨基酸 + ATP-E,氨基酰-AMP-E + PPi,氨基酰-AMP-E + tRNA,氨基酰-tRNA + AMP + E,氨基酸 + tRNA + ATP,氨基酰-tRNA + AMP + PPi,氨基酰-tRNA 合成酶,总反应式为：,氨基酰-tRNA的表示方法,AA-tRNAAA,通式,Asp-tRNAAsp,Ser-tRNASer,Gly-tRNAGly,Met-tRNAMet,fMet-tRNAifMet,Met-tRNAiMet,*一个特殊的tRNA 原核生物起始Met转运,甲酰化,氨基酸的活化 起始 Initiation 延伸 Elongation 终止与释放 Termination & Release,二、蛋白质合成的过程,多肽链合成的过程核蛋白体循环,1.肽链合成的起始,核糖体小亚基先与mRNA结合。起始氨基酰-tRNA再与mRNA配对。核糖体大亚基与小亚基结合，起始氨基酰-tRNA位于大亚基的 P位,2.肽链合成的延伸阶段,翻译过程中肽链的延伸是以下三种化学过程的循环。 1）进位 2）成肽 3）移位,核蛋白体循环之进位,核蛋白体循环之成肽,核蛋白体循环之移位,3.肽链合成的终止,当A位上出现终止密码时，释放因子(releasing factor, RF)进入，促进酯键水解。,之后，tRNA和mRNA被释放，核糖体大、小亚基解聚。,解聚的大、小亚基参与下一轮翻译过程。,核蛋白体循环(ribosome cycle),当一条多肽链合成结束后，核蛋白体大小两个亚基解聚，解聚后的大小亚基可以重新参与一条新的多肽链的合成 ，这就构成了核蛋白体循环(ribosome cycle) 。在蛋白质合成的过程中，往往几个核蛋白质体附着在同一条mRNA链上，形成多核蛋白体(polyribosome)结构。,三、蛋白质合成与药物,蛋白质生物合成的阻断剂,第二节 蛋白质合成后的折叠与加工,一、蛋白质合成后的折叠1.核糖体上新合成的多肽链必须经历折叠（folding）过程才能成为具有天然空间构象（native conformation）的蛋白质。2.蛋白质折叠异常和疾病：疯牛病，老年性痴呆，可传播性海绵状脑病，帕金森氏症，肌萎缩性脊索侧索硬化症等。3.蛋白质折叠过程中，分子伴侣起着非常重要的作用。,分子伴侣（molecular chaperone）,在蛋白质折叠过程中，分子伴侣起着非常重要的作用，内质网系统是质量控制的主要场所。分子伴侣是指能够结合和稳定另外一种蛋白质的不稳定构象,并能通过有控制的结合和释放,促进新生多肽链的折叠、多聚体的装配或降解及细胞器蛋白的跨膜运输的一类蛋白质 。分子伴侣包括两大类：一类能与核糖体结合，如触发因子（TF），新生链结合复合物（NAC）；另一类不与核糖体结合，如hsp70家族,hsp60家族，二硫键异构酶（PDI），脯氨酰-顺反异构酶（PPI）。,热休克蛋白,HSP70家族包括HSp70、Hsp40和GrpE三种蛋白。Hsp70等协同作用可与待折叠多肽片段的78个疏水残基结合，保持肽链成伸展状态，避免肽链内、肽链间疏水基团相互作用引起的错误折叠和聚集，在通过水解ATP释放此肽段，以利于肽链进行正确折叠。Hsp60家族主要包括Hsp60和Hsp10两种蛋白。Hsp60家族的主要作用是为非自发性折叠蛋白质提供能折叠形成天然空间构象的微环境。分子伴侣并未加快折叠反应速度，只是防止蛋白质错误折叠或是消除不正确折叠，增加功能性蛋白质折叠产率。,热休克蛋白（heat shock protein, hsp) 是一种分子伴侣,至少包括有两大类， hsp60和hsp70，前者帮助尚未折叠或错误折叠的多肽链形成正确的折叠，而后者可以和新生肽链结合，防止其聚集，有利于正确折叠的形成。,蛋白质二硫键异构酶,真核细胞内质网中GSH和G-S-S-G的相对浓度（51）有利于蛋白质二硫键的形成。内质网中的二硫键异构酶有利于形成正确配对的二硫键。,肽-脯氨酰顺反异构酶,天然蛋白质多肽链中肽酰-脯氨酸间肽键绝大部分是反式构型，仅6%为顺式构型。肽-脯氨酰顺反异构酶也是蛋白质三维空间构象形成的限速酶。,二、蛋白质合成后的加工,（一）一级结构的修饰1.新生肽链N端fMet或Met的切除2.特定氨基酸的共价修饰包括磷酸化、甲基化、乙酰化、羟基化、糖基化、羧基化、亲脂性修饰等。3.二硫键的形成4.多蛋白的加工如鸦片促黑皮质原POMC经蛋白水解酶水解后可形成促肾上腺皮质激素,-促黑素, -内啡肽， -脂解释放激素等。5.前体蛋白的加工如酶原的激活、胰岛素原向胰岛素的转变、胰高血糖素原向胰高血糖素的转变。蛋白质前体可通过多肽的剪辑，剪除某些氨基酸序列片段，然后再以一定的顺序结合起来，最终形成成熟的，有活性的蛋白质的现象。,1.亚基聚合2.辅基连接对于结合蛋白来讲，其非蛋白部分（辅酶或辅基）都是合成后连接上去的，这类蛋白只有结合了相应辅助成分，才能成为天然有活性的蛋白质。,（二）、空间结构的修饰,蛋白质翻译后添加化学基团的这一类的加工修饰方式称为化学编辑（chemical edit).1.蛋白质的脂酰化脂肪酸与肽链中的Ser或Thr的羟基以酯键结合。如棕榈酰化、豆蔻酰化、异戊二酰化、胆固醇化等。2.蛋白质的糖基化寡糖与蛋白质的连接方式有两种 ：O-型连接和N-型连接。,化学编辑（chemical edit),O-连寡糖和N-连寡糖的特点,O-连寡糖通常指寡糖通过O-糖苷键与蛋白质中的丝氨酸、苏氨酸或羟赖氨酸残基的侧链-OH相连。O-连接寡糖较短，通常只有14个糖残基。O-连糖基化只发生于高尔基体中。N-连寡糖指寡糖通过N-糖苷键与天冬酰胺残基侧链的-NH2相连。蛋白质中N-连的识别靶序列为Asn-X-Ser/Thr，X不能为脯氨酸（Pro）或天冬氨酸（Asp）。N-连寡糖较长，至少有5个糖残基。N-连糖基化过程始于内质网，完成于高尔基体。,第三节 蛋白质的转运与定位,合成蛋白质的场所核糖体: 存在于几乎所有细胞。 附着于内质网上的称附着核糖体（bound ribosome），主要合成外输性蛋白质。 散在于胞质中的称游离核糖体（free ribosome），合成细胞本身生长所需的蛋白质。,一、蛋白质的转运,内质网(Endoplasmic Reticulum,ER) (1)粗面内质网 (RER) 表面附着大量核糖体，以扁囊为主，少数管状和泡状结构； 管腔与核膜腔相通，有的细胞中与核膜呈同心圆分布，围绕在核的周围(2)滑面内质网 (SER) 膜面光滑，以分支小管和小泡相互交织形成网，与RER相通。,粗面内质网：参与蛋白质合成和蛋白质糖基化作用。由附着于内质网膜上的核糖体合成的蛋白质进入内质网腔后转运。主要合成分泌性蛋白质(即外输性蛋白质),如蛋白类激素,消化酶原,抗体,胞外基质中的蛋白质等.RER的不同区域可以合成不同的蛋白质;合成蛋白质的糖基化作用 糖基化作用是RER的主要功能之一，许多分泌蛋白膜、嵌如蛋白和溶酶体蛋白等都是糖蛋白，这些蛋白质的糖基化作用是在内质网内进行的。蛋白质运输,蛋白质合成后被精确地运输到他们行使功能的部位，这个过程称为蛋白质的分选和运输，又可称为蛋白质靶向（protein targeting）。胞浆中合成好的蛋白质去向：1）留在原地；2）分泌到细胞外；3）被转运到各类细胞器中。膜被细胞器蛋白的三种输入机制：1）核孔转运；2）跨膜转运；3）小泡转运,分泌蛋白质的输送路径,蛋白质运输的细胞学过程示意图,蛋白质的跨膜转运方式,信号肽引导的经内质网运输途径 信号肽假设导肽引导的经线粒体等的运输途径 导肽假设,* 信号肽假设： 信号肽：位于分泌蛋白N端的一段肽段，长度一般为15-35个氨基酸残基, N-末端含有1个或多个带正电荷的氨基酸,其后是6-12个连续的疏水残基;在蛋白质合成中将核糖体引导到内质网,进入内质网后通常被切除；信号序列没有特异性。,内含信号肽(internal signal peptides),位于肽链中部，具信号序列的作用，不能被切除, 合成的是膜蛋白。,信号肽假设的工作原理,信号识别颗粒(signal recognition partical, SRP),是一种核糖核酸蛋白复合体,沉降系数为11S，含有分子量为72kd、68kDa、54kDa、19kDa、14kDa及9kDa的6条多肽和一个7S(长约300个核苷酸)的scRNA, 它的作用是识别信号序列,并将核糖体引导到内质网上。,SRP受体：又称停靠蛋白（docking protein，DP），能够与结合有信号序列的SRP牢牢地结合,使正在合成蛋白质的核糖体停靠到内质网上来,translation,核糖体受体蛋白转运因子复合物： 形成跨膜通道，使信号肽和新生肽链通过；同时与核糖体紧密结合；,translation,信号肽引导跨膜过程,信号肽与SRP结合肽链延伸终止SRP与受体结合SRP脱离信号肽肽链在内质网上继续合成，同时核糖体与跨膜通道蛋白结合信号肽引导新生肽链进入内质网腔信号肽切除肽链延伸至终止翻译体系解散这种肽链边合成边向内质网腔转移的方式，是在翻译过程中完成的，即边翻译边跨膜，故称为共翻译（co-translation）。从SRP受体上释放下来的SRP可以循环使用，称为SRP循环。,translation,导肽假设,线粒体、叶绿体、过氧化物体、乙醛酸体等的跨膜蛋白质是属于合成后再分选和运输的，这些蛋白质由胞浆内游离核糖体合成，由导肽牵引到靶向部位。导肽位于蛋白质前体的N端，约含2080个氨基酸残基，导肽所引导的前体蛋白通过细胞膜时，被12种内肽酶水解后转化为成熟型蛋白质。导肽的特征： ,在新生肽链的跨膜中，以及进入内质网以后，都需要保护其不发生错误的折叠和变性分子伴侣负责调节蛋白质的折叠和组装。,translation,分子伴侣参与蛋白质的跨膜运输,分子伴侣(chaperone): 能与其它构象不稳定的蛋白相结合并使之稳定的一类蛋白质，通过与多肽结合来帮助被结合的多肽在体内的折叠、组装、转运或降解等，在完成任务后从多肽上释放下来。,translation,热休克蛋白（heat shock protein, hsp) 是一种分子伴侣,至少包括有两大类， hsp60和hsp70，前者帮助尚未折叠或错误折叠的多肽链形成正确的折叠，而后者可以和新生肽链结合，防止其聚集，有利于正确折叠的形成。,蛋白质经内质网进入高尔基体再加工和折叠,高尔基复合体位于内质网和质膜之间, 是膜结合核糖体合成的蛋白质的分选和运输的中间站从ER分泌出来的小泡同顺面高尔基网络融合后成为高尔基体的一个部分，然后经过中间膜囊出芽形式分泌小泡(又称穿梭小泡)逐步向反面高尔基体网络转运,转运时,分泌小泡与高尔基体膜囊的融合和出芽都是发生在两侧，该过程伴随有蛋白质的各种加工。,高尔基体反面网络的功能是进行蛋白质的分选,蛋白质的正向运输和逆向运输,一般将内质网-高尔基体系统中，运输蛋白的小泡连续不断地从内质网向高尔基体的移动方向称为蛋白质的正向运输（forward transport, anterograde transport）蛋白质的逆向运输（retrograde transport）是指某些在ER中滞留的蛋白质进入高尔基体后通过特殊的信号，如-KDEL-或KKXX-序列，从高尔基体再返回内质网的小泡运输过