产青霉素酶菌种的分离

产青霉素酶菌种的分离、纯化及活性测定,目录,实验原理实验内容实验结果讨论,实验原理,青霉素酶又称-内酰胺酶(-lactamase,EC3.5.2.6),可水解-内酰胺类抗生素。利用青霉素酶具有水解-内酰胺类抗生素的特点, 可将其用于抗菌药物筛选。枯草芽孢杆菌是常见的青霉素酶分泌菌种，革兰氏阳性菌，属芽孢杆菌。无荚膜，周生鞭毛，能运动；芽孢呈椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。,实验原理,紫外线作为物理诱变因子对诱变最有效的波长是在253-265 nm。紫外线诱变的主要生物学效应是由于DNA 变化而造成的，DNA 对紫外线有强烈的吸收作用，尤其是碱基中的嘧啶，它比嘌呤更为敏感。在进行酶活力诱导时，采用剩余碘量法测定，以标准对照法计算含量。青霉素在碱性条件下水解，生成的青霉噻唑酸在酸性条件下与定量过量的碘作用，剩余的碘用硫代硫酸钠滴定，同时做空白试验。,实验内容,（一）从土壤中分离菌种1、青霉素溶液的制备：称取0.625g 160万单位/0.96g青霉素溶解于10ml生理盐水中，即得10万单位/ml的青霉素。2、采集一个土壤样品，约取10g，75水浴加热20min，取1ml上层液稀释1000倍，取1ml上层液到100ml（1000、2000、5000单位）液体培养基，封口摇床培养，即为实验所用菌液。3、取菌液分别接种到1000单位，2000单位，5000单位的培养基，37培养24h。5.取5000单位的菌，按照上述方法诱导至1万单位。,实验内容,（二）筛选菌种1、挑取干燥的菌落（5000单位）进行革兰氏染色，镜检，将形状为杆状的菌落标上记号。（1）涂片（2）晒干（3）固定（4）染色（5）水洗（6）干燥（7）镜检2、将筛选出的菌种保存到斜面培养基（4）,实验内容,（三）酶活力的测定1、取菌体平板培养物，接种至发酵培养基内，在25摇床培养24小时，取摇瓶培养基中菌液15ml，4000r/min离心15min，沉淀菌体，取上清液保存。2、称取青霉素钠（钾）适量，用磷酸盐缓冲液(pH7.0)，溶解成每1ml中含青霉素1万单位的溶液。另取粗酶溶液，按估计单位用磷酸盐缓冲液(pH7.0)稀释1000倍，在37预热。,实验内容,3、精密量取青霉素溶液50ml,置100ml量瓶中，预热至37后，精密加入已预热的青霉素酶稀释液25ml，迅速混匀，在37准确放置1小时，精密量取3ml，立即加至已精密量取的碘滴定液(0.01mol/L) 25ml中,在室温暗处放置15分钟，用硫代硫酸钠滴定液(0.01mol/L)滴定，至近终点时，加淀粉指示液，继续滴定至颜色消失。4、取已预热的青霉素溶液2ml，在37放置1小时，精密加入上述碘滴定液(0.01mol/L)25ml，然后精密加粗酶稀释液1ml，在室温暗处放置15分钟，用硫代硫酸钠滴定液(0.01mol/L)滴定。得空白滴定消耗。,实验内容,按下式计算：E(BA)MFD100式中E为青霉素酶活力，单位(ml.小时)；B为空白滴定所消耗的上述硫代硫酸钠滴定液的容量，ml；A为样品滴定所消耗的上述硫代硫酸钠滴定液的容量，ml；M为硫代硫酸钠滴定液的浓度，mol/L；F为在相同条件下，每1ml的上述碘滴定液(0.01mol/L相当于青霉素的效价单位（742）D为青霉素酶溶液的稀释倍数。,实验内容,（四）诱变育种1、将之前保种的10000单位的菌种接种在250ml液体培养基里面摇床培养18h。2、将试管里的菌液稀释到100万单位/ml。3、将稀释后的菌液平铺（约取3ml)在6个灭菌的空平板上，分别于紫外灯下照射0min、1min、3min、5min、7min、9min。4、取照射后的菌液分别涂布在含有青霉素10000单位/ml、15000单位/ml的固体培养基上，于37培养箱保存，之后观察菌落生长情况。5、挑取长出来的菌落在液体培养基里面培养48h，取培养液进行测酶活，得出结论。,实验结果,（一）从土壤中分离菌种,5000单位,1000 10000单位,实验结果,（二）镜检,实验结果,（三）酶活测定结果结果数据记录：稀释100倍滴定刻度变化 A 样品 1.73.5 mL 1.8ml B 空白 2.04.1 mL 2.1ml硫代硫酸钠滴定液浓度 0.01mol/L碘滴定液浓度 0.05mol/L计算：E=(BA)MFD100 =（2.1-1.8）0.01742100100 =22260单位,实验结果,（四）紫外诱变结果 第一次做的诱变育种没有长出菌落，因此重复了诱导步骤，培养48h后仅长出5min平板其余均未长菌。,总结,1、实验过程中尝试很多菌株的诱变方法，平板筛选不成功后及时改进方案，改为液体培养基梯度培养，我们最终得到了耐10000青霉素的菌株。经过镜检发现该菌株确实是杆菌，对此菌株进行了保存。2、在酶活力测定过程中，按药典配制的滴定液浓度经滴定测定不准确，原因可能是没有及时将硫代硫酸钠避光保存，因而最终结果酶活力偏小。3、第一次紫外诱变后所有平板包括对照均没有长菌，对菌株进行了第二次10000单位诱导发现其确实为所需要的菌株，于是进行了第二次诱导。 第二次诱导12h未长菌，48h