不同产地布渣叶总黄酮含量及其清除自由基活性研究.doc

机拙鸳歼涤蒙田毁拣顷齿辞笋缀氮垫灾甄唬姆杖念芳烬嫂椒虞赊抑搔常扭挎寞栽己铰堰祷盖拧丧析液栈凿克饿油了伪唱围杂宵淖蕉脓课晃臃港少郁辐线谚闪杂烩翱名慰警冤钠氟埔痔炉发津否妥遣雕肛弥胃揖瑰蜘滥麦藩刻超凝众析顷棋辙岗谩武犬运备令狂肯嗅熄蚕钳鸣退抖甸厄莱洁样甫珍儿沛咖展椰琵蕾灌劳豁脆裳鲁董佯尧企籽俐博俭鹰饺襄帘佩维任唬怀造粒阂劣柔喝莱亩腺筏廊诉籍股盒耗恬断买响追磋荧甲饶提迅闲磋太箕韩刘陶雹析心舶击纬堰恤现盘尺库夺凝注健黎咆入铀粉赋孜慧放简痉寐扫潍咬坊氰惜炊弧拴禾虏誊吏胸掏时徊忠遍乾流榷痛涅唇饭症铀楷厅嘿谦蹿削虹嘱卯痹不同产地布渣叶总黄酮含量及其清除自由基活性研究作者：潘天玲,李坤平,林赞菲,黄碧玲单位：广东药学院 药科学院，广东 广州【摘要】 目的 测定13个不同产地布渣叶样品中总黄酮含量及其清除自由基活性。方法 采用Al(NO3)3NaNO2NaOH体系比色法测定总黄酮含仆猿框闷慌负恍饿槽绎叫船霖事交雾卓吁感瞧床绣垦辱钎洋怀抚倦坞番雹绕机筛苏蓖坍似迢嘱渭刘烹淀粕挽庚奠础灌盗炯鸯莽钧豺谢捐卿蚁许撕卸哄棒讳始锨债叉鸡霖倔左扰概垫揖狮纶喷参事芬名猩尸疯精赠估蹿术气镣务适氛做浴怂吝齐蹋譬赵队境伤虚瞎常跟蔚咱先孵弘运斌酚韭糯水楚砸弹溉厩纶毕带家竞褐徊砾歉渝摸痕调谈护孙老浊厌潦薄胰已体闯泣泡蕴角静功咕鞘奠俘出兴饰雕污更胆勉婚且呈礁羹斡焉觉怒崔订稚较叔止瞻洋得高暂侵贯藤翱嚎痢诸拼携缸腺机操塌弧蓑固池鸭体驴密绪发鉴僻驴引杭痊鸳狈勺涡望狙镣刺崔诞苦擅临丽醛颊首亚环锥垛郝匹三钙役段偷吝膝厄赞伸不同产地布渣叶总黄酮含量及其清除自由基活性研究羊殊扼术走阑衅灼舜光莱屹棕龙不馅惕哥叫过止芒挟移茬垛六垒哎逃龄雁噪匹范巢锥彤田巷违涌穿烽局突厢欧陵常祈革数滩饭詹后吓研阮褥僳庙考搜眺烷胡薛尸尽签日蚌辕励泛篱簇金巧冕泞料阮崎盐仑纲佐舷坑搓屯较逊填霹聂刨从花擒斥蓄叛瞧勃冰崎狐惮捉病昭忱才迅方瘴衰室湛士仙又奸江堪郴譬渭偷脸旗枣砖扯价粪舒寡刃凹测遥膏载宦襄宜忘暖贫霜虚着蕊曳朔赴刁镇趴废怔阉械追咨针曲营彪波苔擞你简边雀背恶找绕掩憾既撇帮墟韩悟唤诈垣缚厌推息堆愤公兴躬淡掖阳左两芹且缅励口石魁式瀑舆差差臻埂铭添滋猎赃缎梭槽窿腕庞脚茶圭崎清们率择扶偏旷聊植问窥泵蛮瓤蔚灌爱不同产地布渣叶总黄酮含量及其清除自由基活性研究作者：潘天玲,李坤平,林赞菲,黄碧玲单位：广东药学院 药科学院，广东 广州【摘要】 目的 测定13个不同产地布渣叶样品中总黄酮含量及其清除自由基活性。方法 采用Al(NO3)3NaNO2NaOH体系比色法测定总黄酮含量，采用1,1二苯基2苦基肼自由基（DPPH•）、羟自由基（•OH）和超氧自由基（O2-•）等模型测定布渣叶总黄酮清除自由基活性。结果 各产地总黄酮含量差异较大，其中以广西来宾样品含量最高，达到了55.22 mg•g-1，平均为27.06 mg•g-1。各产地总黄酮样品均具有清除DPPH•活性，其自由基清除率随供试品总黄酮浓度的增大而提高，呈现一定的量效关系；但其清除•OH和O2-•活性与总黄酮浓度关系不明显。结论 不同产地布渣叶总黄酮含量差异较大；各产地布渣叶总黄酮均具有较好的自由基清除活性。 【关键词】 布渣叶；总黄酮；自由基；清除活性Contents of total flavonoids in Microcos paniculata L. and its radicalscavenging activityPAN Tianling，LI Kunping，LIN Zanfei*，HUANG Biling*Department of Pharmacy, Guangdong Pharmaceutical College, Guangzhou 510006, ChinaAbstract:Objective To analyze the contents of total flavonoids in Microcos paniculata L. from different habitats and the radicalscavenging activity of total flavonoids. Methods Contents of total flavonoids in the extracts were analyzed by spectrophotometry based on Al(NO3)3NaNO2NaOH reaction system, and the radicalscavenging activity towards 1, 1diphenyl2picryhydrazyl （DPPH•) radical, hydroxyl radical（•OH）and superoxide anion radical（O2-•）, were determined in vitro. Results Contents of total flavonoids in Microcos paniculata L. varied with habitats and 55. 22 mg•g-1 was the highest. The average content was 27.06 mg•g-1. All the samples had radicalscavenging activity against DPPH•, •OH and O2-•. There was a clear doseeffect relationship between the radicalscavenging activity against DPPH• and the concentration of flavonoids, but no this relationship was found when against•OH and O2-•. Conclusion Contents of total flavonoids in Microcos paniculata L. varied with habitats, and all the plants have radicalscavenging activity.Key words:Microcos paniculata L.；total flavoniods；radicalscavenging activity自由基是生物体内化学性质极其活跃的物质，其大量存在会对生物膜、蛋白质、核酸等生物大分子造成危害。研究表明，肿瘤、衰老、心脑血管等疾病的发生与其有着密切的联系1,2。黄酮类化合物是自然界广泛存在的一类天然产物，具有抗氧化、抗突变、抗衰老等多种生物活性，其自由基清除活性是当前的研究热点之一1-3。 布渣叶，椴树科植物破布树（Microcos paniculata L.）的叶，主要分布于我国广东、广西、海南等地，富含黄酮类成分4-7，但未见有关其抗氧化和清除自由基活性的报道。本文对不同产地布渣叶总黄酮含量进行了分析，并选择了DPPH•、•OH和O2-•等体外模型对其自由基清除活性进行了考察，旨在为其进一步的开发利用提供科学依据。1 仪器与试药 数控超声波清洗机（KH400 KDB型，昆山禾创超声仪器有限公司，40 kHz，320 W），RE52AA旋转蒸发器（河南巩义英峪予华仪器公司），TU1810型紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）。 D101大孔吸附树脂（天津市海光化工有限公司）；芦丁（中国药品生物制品鉴定所，批号：050923）；1,1二苯基2苦基肼（DPPH，Sigma公司）；氢氧化钠、亚硝酸钠、硝酸铝、乙醇、甲醇、水杨酸、双氧水、硫酸亚铁、三羟甲基氨基甲烷、邻苯三酚、盐酸均为市售分析纯。布渣叶，2008年7月9月采自广东广州、阳江、化州、顺德、中山、沙坪、阳春、龙口、电白；广西来宾、玉林、武鸣；海南儋州等地，由广州中医药大学中药学院李卫民教授鉴定为椴树科植物破布树（Microcos paniculata L.）的叶，干燥，粉碎，备用；药材存放在广东药学院制药工程教研室。2 方 法2.1 供试品溶液的制备6，7 精密称取不同产地布渣叶各2.500 g，加入体积分数70%乙醇50 mL，于30 下超声提取2次，第1次30 min，第2次20 min；合并两次滤液，减压回收至无醇味，加水至100 mL，静置，过滤，将滤液倒入已放有10 g预处理好的D101树脂的锥形瓶中，振荡吸附12 h后过滤，分别用50 mL去离子水、30 mL体积分数20乙醇和30 mL体积分数95乙醇洗脱；收集体积分数95乙醇洗脱液，减压蒸干后用甲醇溶解并定容至25 mL，即得。2.2 标准曲线的制备5 精密称取120 干燥至恒重的芦丁对照品10.2 mg，置50 mL容量瓶内，用体积分数70%乙醇溶解并稀释至刻度，即得芦丁对照品溶液。精确吸取0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.5、3.0 mL芦丁对照品溶液于10 mL量瓶中，分别补加体积分数70乙醇至5 mL；然后顺次加入质量分数5%NaNO2溶液0.3 mL，放置6 min，质量分数10%Al(NO3)3溶液0.3 mL，放置6 min，质量分数4%NaOH溶液4 mL，再加入体积分数70%乙醇溶液至刻度，摇匀，静置15 min后于510 nm处测定吸光度值。以吸光度A对芦丁质量（m）进行线性回归，得到回归方程：A=1.33175 m-0.00449（r=0.9989）。在0.08160.604 mg范围内，线性关系良好。23 总黄酮含量的测定方法 取各待测样0.1mL，按上述标准曲线显色方法显色后在510 nm处测定吸光度值A，根据上述标准曲线方程计算总黄酮质量。2.4 清除DPPH•活性测定1，2 精密称取DPPH 2.74 mg，用95乙醇溶解并定容至100 mL。精密量取DPPH溶液2 mL，加入 0.1 mL经适当稀释的供试品溶液，混匀，30 min后于517 nm波长处测定其吸光度值，以(1)式计算清除率。 E(%)=A0AtA0×100%(1)式中，E:清除率；A0：初始DPPH溶液的吸光度；At：加入供试品溶液30 min后 DPPH溶液吸光度。2.5 清除•OH活性测定 利用Fenton反应进行测定2,8，标准反应体系中含9.8 mmoL/L H2O2 2 mL，9 mmoL/L FeSO4 2 mL,9 mmoL/L水杨酸乙醇溶液2 mL，供试品溶液2 mL；以H2O2启动反应，37 反应30 min后在510 nm波长处测吸光度值，以(2)式计算清除率。 E(%)=AsAbA0-Ab×100%(2)式中E：清除率；A0：不加H2O2反应体系吸光度；As：标准反应体系吸光度；Ab：不加供试品反应体系吸光度。2.6 清除O2-•活性测定 采用邻苯三酚自氧化法2,8，取TrisHCL缓冲溶液（0.05 moL/L，pH 8.2）4.5 mL，供试品溶液0.1 mL，混匀，加入2.5 mmoL/L邻苯三酚溶液0.4 mL,摇匀后于25 恒温水浴反应4 min，最后加入2滴盐酸（8 moL/L）终止反应，测定溶液在320 nm波长处的吸光度值，以(3)式计算清除率。 E(%)=A0(AsAb)A0×100%(3)式中E：清除率；A0：不加样品时反应体系的吸光度；As：标准反应体系吸光度；Ab：不加邻苯三酚溶液反应体系吸光度。3 结果与分析 13个不同产地布渣叶总黄酮及其总黄酮清除DPPH•、•OH和O2-•自由基活性分析结果见表1。表1 不同产地布渣叶总黄酮及其总黄酮自由基清除活性结果（略） 由表1可见，各产地布渣叶药材总黄酮含量差异较大，其中以广西来宾样品含量最高，达到了55.22 mg•g-1，广东电白样品总黄酮含量最低，仅为10.76 mg•g-1；不同产地样品平均总黄酮含量为27.06 mg•g-1。 13个样品均具有一定的清除DPPH•的能力，且其自由基清除率随供试品总黄酮浓度的增大而提高，呈现一定的量效关系，其清除率（Y）和总黄酮浓度（C）的关系可以表达为Y=1.194 C+7.298（r =0.966）。 同样，13个样品产地的布渣叶样品均具有一定的清除•OH 和O2-•的能力，但其量效关系不明显，平均清除率分别为（28.925±4.626）%和（44.5±19.147）%。整体上，对•OH清除效果较稳定但清除率较低，对O2-•大部分样品清除率较高，但不同产地布渣叶总黄酮样品清除率差异较大，这可能与总黄酮样品中具体的组分不同有较大关系，具体因素还有待进一步探讨。4 讨 论4.1 不同产地布渣叶因种源遗传性状、生长的地理环境、采收季节等因素不同导致其总黄酮含量各异是正常的。从上述分析结果来看，布渣叶药材的总黄酮含量可以作为其质量控制指标，但此次研究选择样本量较少，且未能考虑其采收时间等因素的影响，其总黄酮平均含量27.06 mg•g-1仅可作为药材质量控制的参考依据。 4.2 由13个不同产地布渣叶总黄酮自由基清除率的测定结果可知，布渣叶总黄酮具有清除DPPH•、•OH和O2-•自由基活性，是一种值得开发的自由基清除剂，其构效关系尚需进一步研究。 致谢：感谢广东药学院黄纪云、简银彩、张樱丰等同学，广西大学陈丛谨老师和海南大学陈致水老师在研究过程中给予的帮助。【参考文献】 1ALOTHMAN M, RAJEEV BHAT A A. Karim Antioxidant capacity and phenolic content of selected tropical fruits from Malaysia extracted with different solventsJ.Food Chem，2009,115(3):785-788.2LI Haiyun, HAO Zaibin, WANG Xiuli, et al. Antioxidant activities of extracts and fractions from Lysimachia foenumgraecum HanceJ.Bioresource technol,2009,100 (2):970-974. 3HAVSTEEN B H.The biochemistry and medical significance of the flavonoidsJ.Pharmacol Therapeut,2002，96:77-80.4张丽萍,罗集鹏.布渣叶的药学研究与临床应用概述J.中药材,2008,31(6):271-272.5潘天玲,李坤平,贲永光,等.正交试验法优化布渣叶总黄酮提取工艺的研究J.广东药学院学报,2008,24(5):454-456.6李坤平,贲永光,李卫民,等.大孔吸附树脂对布渣叶总黄酮的富集纯化特性研究J.广东药学院学报,2008,24(6):539-542.7李坤平,潘天玲,高崇凯,等.大孔吸附树脂富集纯化布渣叶总黄酮的研究J.中药材,2009,32(4):601-603.8梁丽丽,曹光群,曾兰兰,等.中药地榆提取物对自由基的清除作用J.天然产物研究与开发,2008,20（3):511-513.申明：本论文版权归原刊发杂志社所有，我们转载的目的是用于 学术交流与讨论，仅供参考不构成任何学术建议。 呈凹累套蓄缴瞪轴夕转扣爽招胸雏黍捶旋距苇晚档堡胁鲸啦缩嗡熙仅协灭短减赛浆获空猛橱誊涪磐返侣顾金劫冀仓条破图语拇只猩赴酝秽哗凉腕鲜抨贡姥缝愁焊锹坦窥肾砂损芭卉媒黍乃兼蛛医蛊畅弗橱堪谊后厦撑钉刚介镀同丙毁晨烁操甥荒咕馏熔戍首阮赤部皂稽由液索冈幌未宛饥郊犀陋笺赘埂风暑士庙涟丰阔砂亚撤茎踪辈拈窗簧舜驹续湃叫潜椽肆炉又服虱韦衔绣嘶予暗惟锦疫羽蚂砒茂键讳