光合细菌的分离及初步鉴定.doc

光合细菌的分离及初步鉴定【摘要】利用从西南大学北校区崇德湖的边泥，富集分离得到两种光合细菌，该菌株厌氧培养后呈现出红色和绿色，革兰氏染色呈阴性，通过形态学观察及文献资料查询鉴定，初步鉴定为该菌株属于红假单胞菌属和蓝细菌。【关键词】光合细菌 富集 分离 鉴定目的初步了解无氧操作，学会无菌操作和革兰氏染色，掌握微生物实验的基本技能，学习分离厌氧光合细菌及初步鉴定的方法。原理 光合细菌在有光照缺氧的环境中能进行光合作用，利用光能进行光合作用，利用光能同化二氧化碳，与绿色植物不同的是，它们的光合作用是不产氧的。光合细菌在自身的同化代谢过程中，又完成了产氢、固氮、分解有机物三个自然界物质循环中极为重要的化学过程。从厌氧且能得到光照的环境采样，选用特定的富集和分离培养基，在厌氧并有光照的条件下进行培养，可分离到不同的光合细菌。材料与用具1、材料 崇德湖池塘边透光处采取淤泥2、培养基及试剂 光合细菌液体富集培养基（以下配方为500ml所用）：CH3COONa 1.5 g；CH3CH2COONa 0.15 g；NaCl 0.5 g；(NH4)2SO4 0.15 g；MnSO4 12.5 mg；K2HPO4 0.15g；KH2PO4 0.25 g；CaCl2 0.025 g；MgSO47H2O 0.1 g；FeSO47H2O 0.0025 g；酵母膏0.05 g；蛋白胨0.005 g；蒸馏水500 ml；pH 70光合细菌分离培养基（以下配方为500ml用）：CH3COONa 1.5g；CH3CH2COONa 0.15g；NaC1 0.25 g；NH4CI 0.5 g；MgSO47H2O 0.1g；K2HPO4 0.15g；KH2PO4 0.25 g；CaC12 0.025g；MnC124H2O 00015 g；FeSO4-7H2O 0.0025 g；酵母膏0.05g；蛋白胨0.005 g；谷氨酸0.0001 g；蒸馏水500 ml；琼脂10 g；pH 7.27.4无菌水、无菌液体石蜡3、仪器及用具 光照培养箱、超净工作台、高压蒸汽灭菌锅、酒精灯、三角瓶、培养皿、试管、接种环、接种针、玻璃珠等。操作步骤（一）采集含菌样品 从崇德湖湖边某向阳处挖取淤泥。（二）培养基的制作 按照给出的配方配制培养基。（二）富集培养 取已经灭菌的200ml的光合细菌液体富集培养基，加入少许玻璃珠，同时接入泥样10g，振荡混匀，液面注入0.5cm 高灭菌液体石蜡，棉塞封口，造成厌氧环境。在温度28、光照5000lx的生化培养箱中培养至培养液呈红棕色，并且在瓶底淤泥表面有深红色沉积物，使欲要分离的光合细菌成为优势种。（三）多次富集 取适量经初步富集的菌液于试管液体富集培养基中，再次富集，重复两次，使光合细菌进一步繁殖增多，成为绝对优势种。 （四）光合细菌的分离 采用混菌法，在无菌培养皿上滴加1ml富集培养液，然后倒入一层厚厚的分离培养基 (融化后的培养基应冷却至50后再覆盖)，混匀后置于光照培养箱中继续培养分离，直至得到纯的单个菌落。采用双层平板划线法和双层平板涂布发，即先在无菌培养皿上倒一层培养基，然后涂布和划线菌液，再在其表面倒一层培养基，形成无氧环境。继续培养至出现单菌落。待单菌落长出后，用穿刺法继续纯化目的菌，即用接种针在平板中挑取菌落为红色和绿色的菌落，插入培养基底部，继续培养后进行菌种鉴定。（五）光合细菌的初步鉴定 首先观察分离平板上生长的菌落形态及特征，对不同菌落进行革兰氏染色，显微镜下观察菌体形态特征。五、实验结果在富集培养基中，培养液刚开始逐渐成为红褐色，持续一段时间后变为绿色，并能看到明显的绿色藻状物。分离培养基底部得到了两种厌氧菌落，一种为红色菌落，菌落表面微光滑、突起、湿润、有光泽、不透明，菌落边缘整齐，革兰氏染色表明该菌株为革兰氏阴性菌，光学显微镜下细菌形态为杆状，长明显大于宽。另一种菌落呈绿色，表面光滑湿润，不透明，边缘整齐，革兰氏染色表明该菌株也为革兰氏阴性菌，光学显微镜下细菌形态为球状或链状。实验结果分析1、根据两种厌氧菌的形态观察和革兰氏染色结果，查文献初步判定红色菌落为红假单胞菌属，绿色菌落为蓝细菌，当然这只是初步的判断，还得经过系列实验才能得出具体结论，但由于实验条件有限，不能进一步鉴定其生理生化特征。2、鉴于光合细菌能进行光合作用自养，因此所用培养基含碳源和氮源甚少，不利于大多数微生物生长，所以培养基中杂菌很少，只在分离平板表面上出现一种乳白色、湿润、凸起、呈浆状的杂菌。3、在配置培养基的过程中遇到了麻烦，首次所配的液体培养基灭菌后出现了很多沉淀，猜想可能由于PH值未严格控制，或药品加入顺序不对，或各药品间会发生化学反应沉淀所造成，于是重配培养基，按要求调PH，查药品加入顺序，各药品先各自溶解再混合，但结果仍有沉淀，前后共配三次也未改变。不知原因出现在何处。由于观察发现光合细菌一开始是从瓶体的沉淀中长出（沉淀中出现红褐色），猜想可能光合细菌需要附着于类似泥的物体上才能生长。4、在目的菌未进行富集之前，做了一次双层平板划线，即先在平板上倒一层富集培养基，然后用接种环划线，最后再在上面倒一层培养基，结果底层无目的菌，表面长出了杂菌。富集后进行混菌法分离，即现在培养皿中加入菌液，然后倒入培养基，结果在培养基底部长出很多目的菌，说明所取材料中光合细菌含量不多，不经富集难以成为优势种，或说明在该实验中混菌法分离比双层平板法有效。6、穿刺分离法的效果很好，采用此法得到了非常干净的红色目的菌落，穿刺路径呈红色，为光合细菌，下面分布很多小菌落，无任何杂菌长出。5、整个操作过程中都要在无菌条件下进行，要么在酒精灯旁操作，要么在超净工作台中进行，且每次接菌前都应将灼烧接种环或接种针，避免杂菌污染，这是实验成功的关键之一。【参考文献】【1】 董艳珍，陈碧华，肖文渊. 一株光合细菌分离与初步鉴定【J】. 西昌学院学报自然科学版，2010 年9 月第24 卷第3 期.【2】 席寅峰, 张孟婧, 黄小帅, 郝燕佳. 1株光合细菌的分离鉴定及其脱氮能力研究【J】. 安徽农业科学, 2010, 38( 27) : 14847- 14849, 14875.【