课题结题书

项目类别项目批准号附件3 华南农业大学大学生科技创新活动项目结题书项目名称：磷酸铝与IL-18作新城疫基因疫苗佐剂的探讨 申 请 人： 何英杰 吴思源 邓瑞林 所在院部： 兽医学院 专业年级： 动物医学 02级（4）班 联系电话：38675491 指导教师: 黄青云 职称 教 授 立项日期： 二五 年 四 月 十 日结题日期： 二六 年 四 月 二 日华南农业大学大学生科技创新活动项目指导中心 填 表 说 明 一、 填写结题报告书前，请先咨询指导教师或有关专业教师。结题书的各项内容要求实事求是，逐条认真填写。表达明确、严谨，一律要求用打印稿件。 二 、申请书书为A4复印纸，于左侧装订成册。一式三份（至少一份原件），由指导教师和所在院（部）审查并签署意见后报大学生科技创新活动项目指导中心。三 、一级标题三号宋体加粗，用“一、二、三”标示；二级标题四号楷体加粗，用“（一）（二）（三）”标示；三级标题四号仿宋加粗，用“1、2、3”标示；四级标题四号仿宋，用“”标示。示例：一、XXXX课题立项与研究的目的意义（一）XXXX课题立项与研究的目的的意义1、XXXX课题立项与研究的目的意义XXXX课题立项与研究的目的意义四、如表格不够，可以加附页。项目简况项目名称磷酸铝与IL-18作新城疫基因疫苗佐剂的探讨项目类别A、文科类； B、理科类；申请经费1500元起止年月2005.42006.4项目组成员姓 名性别出生年月年级专业班级所在学院上学年综合测评分项目中的分工本人签字何英杰男83.502动医4班兽医79.4DNA疫苗佐剂制备邓瑞林男80.202动医4班兽医77.8免疫，攻毒吴思源女84.702动医4班兽医80.9检测指导教师情况姓名黄青云性别男学位学士职称教授研究方向兽医微生物学与免疫学授课名称预防兽医学专业概论(学士生) 兽医免疫学（学士生） 高级兽医微生物学 （硕士生） 兽医免疫学与实验技术(硕士生) 分子免疫学（博士生）项目简介 黄青云教授前期指导研究生成功构建新城疫真核表达质粒pcDNA-F (简称NDV F基因疫苗)，鸡白介素18（IL-18）真核表达质粒pcDNAcIL-18 (简称IL-18)，且经过初步试验NDV F基因疫苗对鸡具有一定的基因疫苗免疫效果, IL-18作为分子免疫佐剂也对NDV F基因疫苗免疫效果具有一定的作用，但仍有待提高。本项目参考国内外最新文献报告，采取传统佐剂磷酸铝，探讨其提高NDV F基因疫苗免疫效果,及其与IL-18联合提高NDV F基因疫苗免疫效果的作用及条件。试验结果综合如下列表1,图1和图2:表1.免疫保护试验结果条件疫苗试验鸡数攻毒死亡数存活数保护率一免（7d龄）二免（21d龄）对照组pcDNA-FLog2pcDNA-F+磷酸铝Log2pcDNA-F+IL-18pcDNA-F+磷酸铝+ IL-18pcDNA-FpcDNA-F+磷酸铝pcDNA-F+IL-18pcDNA-F+磷酸铝+ IL-18弱毒疫苗C30（7d龄1次）C30一免+灭活苗二免非免疫组生理盐水（2次）99101012111211912107676856310102334466881202/9(22.2%)3/9(33.3%)3/10(30.0%)4/10(40.0%)4/12(33.3%)6/11(54.5%)6/12(50.0%)8/11(72.7%)8/9(88.9%)12/12(100%)0/10(0%)(Log2)注:免疫剂量为pcDNA-F，pcDNAcIL-18（简称IL-18）均每次200 ug/只；磷酸铝每次100 ug/只；弱毒苗1头份只；ND灭活苗1头份只；生理盐水每次0.2只(周)(周)(Log2) 图1.一免的血清NDV抗体检测情况 图2. 二免的血清NDV抗体检测情况注：图中曲线：a为NDVF ，b为 NDVF+磷酸铝 ，c为 NDVF+IL-18，d为 NDVF+IL-18+磷酸铝，e为传统疫苗，f为生理盐水试验结果综合表明：1. 表1.免疫保护试验表明：磷酸铝佐剂和IL-18联合与新城疫F基因疫苗经过二次免疫鸡的近期攻毒保护率达到8/11（72.7），比鸡单用NDVF基因疫苗一免的保护率2/9（22.2）、二免保护率4/12（33.3），分别提高了50.5和39.4，虽然仍比不上传统疫苗弱毒疫苗C30一次免疫88.9，C30灭活疫苗二免100的保护效果，但试验表明新城疫F基因疫苗具有进一步的研究开发及应用价值,也对其他DNA疫苗的开发应用研究具有参考价值.2. 从图1、图2可以看出：一免与二免后每周的血清抗体水平高低均依次为传统疫苗组 pcDNA-F+磷酸铝+ IL-18组 pcDNA-F+IL-18组 pcDNA-F+磷酸铝组 pcDNA-F 组 非免疫对照组，这与表1近期攻毒保护试验结果中各组鸡的保护情况相一致。三、项目研究的内容与方法1.重组质粒pcDNA-F、pcDNAcIL-18鉴定（PCR,电泳）2.重组质粒提取，含量测定，磷酸铝佐剂制备3.鸡体免疫(分组,一免,二免)4.血清NDV抗体检测，观察各免疫组Ab消长曲线。（各组固定5只鸡，标记,一免后第0，1，2，3，4周抽血分类血清做HI试验）5.攻毒保护试验(攻毒前测好NDV强毒的LD50)。一免组于一免后第28天 二免组于二免后第14天 6.统计分析结果。三、项目研究过程与资料查阅情况（一）研究主要过程： 1.实验室提取重组质粒 2.含磷酸铝佐剂的新城疫基因疫苗的制备 3.购买鸡苗，进行饲养管理工作 4.两周后进行鸡群分组，然后进行疫苗注射 5.每周每组抽出5只采血，进行血清抗体检测 6.测试NDV强毒的LD50 7.进行攻毒保护实验，剂量为30个LD50/只 8.结果统计分析（二）主要查阅资料：1. 谢安新.新城疫病毒F基因疫苗与鸡IL-18基因联合免役的探讨D.广州：华南农业大学.2004.1-532. 温纳相.白介素-18的基因克隆表达及生物学作用研究D.广州：华南农业大学，2003.97-1073. Kwissa M, Lindblad EB, Schirmbeck R. etal. Codelivery of a DNA vaccine and protein vaccine with aluminum phosphate stimulates a potent and multivalent immune response j .J Mol Med , 2003 ,81:5024. 梁增伟、任红、兰英华、李用国，磷酸铝对乙型肝炎DNA疫苗抗体应答的增强作用J.中华肝脏病杂志.2004年2月第12卷第2期.79-815. 吴艳涛，刘秀楚.新城疫基因工程疫苗研究J.中国兽药杂志.2001.35（4）：36-396. 金冬雁、黎孟枫等译，分子克隆实验指南第二版M，科学出版社.1996.24287. 靳彦文，马清钓.乙型肝炎尖病毒DNA疫苗的研究进展J.生物技术通讯.2004.15（4）：399-4048. 姜平主编，兽医生物制品学第二版M，中国农业出版社.2003.52569. 王世若，王兴龙，韩文瑜等.现代动物免疫学M.长春：吉林科学技术出版社，2001.155-162四、项目成果完成形式和价值发表论文1篇-.该篇文章的摘要已于2005年12月参加广东省微生物学会广东省遗传学会在珠海举行的,作大会报告及登于会议论文集.该论文计划在2006年内投国内相关核心刊物发表.本项目成果在高科技新型分子疫苗新型分子佐剂与传统疫苗佐剂联合应用方面作了创新探讨,使鸡注射新城疫F基因疫苗后的免疫保护率从22.2%提高到了72.7%,使新城疫F基因疫苗具有进一步的研究开发及应用价值,也对其他DNA疫苗的开发应用研究具有参考价值.五、经费使用情况实验鸡费 180元 饲料费 1500元试剂费 2800元 总计4480元六、申请人对该项目研究工作完成后的认识总结大学生创新活动的宗旨是培养大学生的创新能力，提高大学生的实践能力。本着这样一个目的，我们3人参加这次 的活动，经过一年多来的学习与实践，在黄青云教授和研究生师兄的悉心的指导下，我们完成了本项目的研究计划，达到了预期的研究成果，同时各方面能力得到了训练和提高，尤其在创新意识、团结合作、实事求是的科学态度等方面有新的体会与认识。 科技是第一生产力，创新研究应与生产实践紧密结合起来。只有对生产力有促进作用的研究结果才有真正的意义和价值。本课题在高科技新型分子疫苗，新型分子佐剂与传统疫苗佐剂联合应用方面作了创新探讨，使用磷酸铝佐剂和pcDNAcIL-18与新城疫F基因疫苗联合经两次免疫显著提高了NDVF基因疫苗的近期免疫保护效果，免疫鸡的保护率从只用F基因疫苗一次免疫的22.2提高到了72.7虽然仍比不上传统疫苗弱毒疫苗C30一次免疫88.9，C30一免灭活疫苗二免100的保护效果，但使新城疫F基因疫苗具有进一步的研究开发及应用价值,也对其他DNA疫苗的开发应用研究具有参考价值.在试验过程中，我们深刻认识到创新研究离不开扎实全面的理论知识和严谨的试验精神。整个课题的研究过程需要兽医微生物学、兽医免疫学、物解剖学、动物饲养管理学和家畜环境卫生学等知识的支持。我们查阅了大量的文献资料，综合应用了各方面的知识，才顺利完成研究试验及论文写作。科技创新研究要有团结合作精神。在试验过程中我们在黄青云教授、尹会方、王继文师兄、梁瑞玲同学等的指导与帮助下，分工合作，积极配合，一起解决遇到的困难及问题。特别在动物试验过程中，我们曾遇到各种问题，幸好得到黄老师和师兄的及时指导帮助，得以一个个的解决。 科技创新研究要发扬实事求是的作风和严谨的科学态度。在进行本项目的研究过程中，我们懂得了科学研究态度是应该严谨的、认真的及探索性的。客观的记录实验数据、及时做好数据的统计分析、得出试验的优缺点有何新的研究发现等等；这样才使我们的实践能力得到锻炼及创新能力得到提高。七、指导教师对项目完成情况的意见何英杰、吴思源、邓瑞玲三位同学开展的“磷酸铝与IL-18作新城疫基因疫苗佐剂的探讨”研究创新意义较大，成果明显。在国内外尚未见该研究报告。研究取得了可喜的成果，使NDV F基因疫苗的实验免疫效果从从22.2%提高到了72.7%，