高效液相色谱法测定维生素E胶囊中α-VE的含量(2015).doc

高效液相色谱法测定VE胶囊中-VE的含量1、 目的要求1 了解高效液相色谱仪的基本构造和工作原理。2 掌握高效液相色谱仪的正确操作方法。3 学习维生素E的定量分析方法。2、 实验原理色谱法的分离原理是：溶于流动相中的各组分经过固定相时，由于与固定相发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号被检测。高效液相色谱法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)。按分离机制的不同分为液固吸附色谱法、液液分配色谱法、离子交换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法。液液色谱法按固定相和流动相的极性不同可分为正相色谱法(NPC)和反相色谱法(RPC)。RPC一般用非极性固定相（如C18、C8），在现代液相色谱中应用最为广泛，约占整个HPLC应用的80%左右。维生素E又称生育酚，目前已经确认的有8种异构体，生育酚和生育三烯酚，天然存在的-生育酚的维生素E活性最强。-生育酚醋酸酯是-生育酚的酯化产品，常用在维生素胶囊中，具有很强的氧化稳定性。样品以乙醇溶解，采用RPC法，以乙醇为流动相，C18色谱柱分离，紫外检测器284 nm 波长检测，外标法定量，测定维生素E胶囊中-生育酚醋酸酯的含量。3、 仪器和试剂维生素E醋酸酯标准品、色谱纯乙醇、分析纯四氢呋喃、无水乙醇。HPLC高效液相色谱仪（日本岛津，LC-10A 泵，SPD-20A 紫外双波长检测器 ）、KQ5002B型超声波清洗器、紫外可见分光光度计。 4、 实验条件色谱柱为Eclipse XDB-C18柱( 150 mm 4. 6 mm，5 m i. d. ) ; 流动相为乙醇，流速0.5 mL /min; 进样量20 L; UV 检测器，检测波长为284 nm(通过紫外分光光度计扫描确定)。5、 实验步骤1、流动相过滤和脱气流动相乙醇用0.45m（或0.22m）有机滤膜滤过，以除去杂质微粒，然后超声脱气（一般500ml溶液需超声2030min方可）。超声时应注意避免溶剂瓶与超声槽底部或壁接触，以免玻璃瓶破裂，容器内液面不要高出水面太多。处理好的流动相贮存于玻璃、聚四氟乙烯或不锈钢容器内，恢复到室温后使用。2、标准溶液的配制储备液：准确称取标准品VE醋酸酯3 用无水乙醇溶解使浓度为10mg/mL。工作液：测定前用无水乙醇VE标准储备液稀释至1mg /mL。应用液：测定时用无水乙醇将工作液稀释成10、50、100、150、200g/mL浓度标准系列溶液。3、试样溶液的制备用针刺破维生素E 软胶囊称取油状物约0.1g，置10mL烧杯中，加入无水乙醇超声溶解后转移至25mL容量瓶定容，检测前再稀释后经0.45m有机滤膜过滤为待测液。4、开机接通电源，依次开启电源、泵、检测器，待泵和检测器自检结束后，打开电脑显示器、主机，最后打开色谱工作站。5、更换流动相并排气泡流动相的吸滤器放入装有准备好的流动相的储液瓶中；逆时针转动泵的排液阀180（不能超过180），打开排液阀；按泵的purge键，pump指示灯亮，泵大约以9.9ml/min的流速冲洗，3min（可设定）后自动停止；将排液阀顺时针旋转到底，关闭排液阀。如管路中仍有气泡，则重复以上操作直至气泡排尽。6、平衡系统打开“在线色谱工作站”软件，输入实验信息并设定各项方法参数后，按“下载”按钮。参数载入。启动泵，pump指示灯亮。用检验方法用流动相冲洗系统，一般最少需6倍柱体积的流动相。检查各管路连接处是否漏液，如漏液应予以排除。观察泵控制屏幕上的压力值，压力波动应不超过1MPa。如超过则可初步判断为柱前管路仍有气泡，检查管路后再操作。观察基线变化，如果冲洗至基线漂移0.01mV/min，噪声为0.001mV时，可认为系统已达到平衡状态，可以进样。7、进样、检测进样前按零点校正 按钮校正基线零点。用试样溶液清洗注射器，并排除气泡后抽取适量即可以进样了。含量测定的对照溶液和样品供试溶液每份至少注样2次 。8、色谱柱的清洗分析工作结束后，先关检测器。清洗进样阀中的残留样品，然后用乙醇以分析流速冲洗色谱柱15-30分钟，在甲醇冲洗时重复注射100-200l四氢呋喃