植物细胞学分析之组织切片技术.doc

植物细胞学分析之组织切片技术 一、试剂（1）卡诺氏固定液：无水乙醇与冰醋酸按体积比为3:1混合配制。（2）1molL盐酸溶液：取浓盐酸（比重1.19）82.5ml，加入蒸馏水917.5ml。（3）醋酸洋红染液：4-5g洋红，冰醋酸45ml，蒸馏水55ml，先将冰醋酸加入蒸馏水中煮沸，然后将火移去，立刻加入洋红，用玻璃棒搅匀溶化，冷却后过滤即成。（4）70%酒精；95%酒精。二、细胞分析方法1有丝分裂全过程的染色体制片方法步骤：取材-预处理-固定-根尖解离1mol/L HCL-醋酸洋红染色-压片（1）发根挑选每份黑麦种子材料25粒，经流水冲洗，放于培养皿内温水浸泡24h。置于25恒温箱中发根。待根长到12cm时，于适宜时间用蒸馏水洗净，将水吸干，剪取根尖0.51cm进行预处理。为获得尽可能多的分裂相，根尖以上午910时剪取为宜。（2）预处理为了有利于有丝分裂中，染色体的观察和计数，通常要对材料进行不同的预处理。预处理主要通过抑制和破坏纺锤丝的形成，来获得更多的中期分裂相，同时还可以改变细胞质的粘度，促使染色体缩短和分散，便于压片和观察。将根尖浸于蒸馏水内，1-4低温处理24h。（3）固定材料经预处理后，用流水冲洗2次，然后投入卡诺液（3份甲醇1份冰乙酸）中固定26h，用95的乙醇洗两次，转入70乙醇中保存备用（4）。固定的目的是： 迅速防止细胞死亡后的变化，如自溶、腐败等，尽量保持生长状态结构。使细胞中的蛋白质、脂肪等成分转变为不溶性物质，以保持生前的形态。使组织内各种物质成分产生不同的折光率，便于观察和鉴定。使不同组织成分对染料有不同的亲和力，便于染色。防止细胞过度收缩或膨胀，失去原有的形态结构。（4）解离 常用酸解法：从70乙醇中取出固定好的根尖，用蒸馏水冲洗后，吸水纸吸干，放入盛有1 mol/L 的HCl的1.5ml离心管中，60水浴，恒温条件下解离10min。植物细胞的细胞壁对细胞形态和结构起支撑和保护作用，分生组织的细胞壁结构将分生细胞结合成一个整体，因此在压片之前需要采用适当方法软化或部分分解细胞壁使细胞间易于分离，这一操作称为解离。同时，解离也可适当清除部分细胞质，使细胞质背景趋于透明化，便于观察染色体。通过解离和压片，分生细胞的原生质体能够从细胞壁里压出，使染色体周围不带有细胞质或仅有少量细胞质，让后续制片处理直接作用于染色体。（5）染色 解离后吸出HCL，用蒸馏水水洗2次，每次3-5分钟，将根尖置于载玻片中间，切去根冠，从乳白色分生组织切取尽可能薄的一片，滴加12滴品红染液，染色5min。（6）压片 在经染色的材料上加一滴染液，在染液左侧放一刀片，盖上盖玻片，用镊子垂直敲打，先轻轻敲出盖玻片下的空气，然后边敲边向外移动刀片，待刀片移出盖玻片后，覆一层吸水纸，用镊子垂直敲打 (注意勿使盖片搓动)，待材料分散均匀后，将玻片拿到酒精灯火焰上烤，烤至稍烫手为宜，然后迅速用拇指按住盖玻片，用力压。（7）镜检 通常染色清晰而又分散得很好的分裂相只是少数，因此压片后要认真仔细地进行镜检。先在低倍镜下寻找有分裂相的视野，再用高倍镜仔细观察、记数、拍照。调节可调节可变光栏与反光镜，使光线明暗合适，视场亮度适中。注意观察有丝分裂全过程的染色体形态变化，找出染色体分散好的中期细胞进行染色体计数，对好的分裂图像作上标记，以便再观察。2染色体核型分析方法选择分散良好的中期染色体在显微镜下拍照分析，染色体计数至少观察统计50个完整的中期分裂相。核型分析至少测量5个细胞的染色体，参照李懋学和陈瑞阳确定的标准5.染色体的相对长度、臂比及类型参照Leven等命名系统6。核型类型参照Stebbins标准7。染色体相对长度系数参照Kuo（1972）8标准。（1）准备染色体标本的相片于显微镜下选出5个中期分裂相中染色体数目完整、分散良好、着丝点清晰、无重叠、各条染色体处于同一平面，并且着色鲜明、形态清晰、着丝粒明显、随体明显可见的细胞（如果染色体带有随体），通过显微摄影、冲洗、放大成染色体相片。（2）染色体测量目测相片上每条染色体长度，按长短顺序初步编号，写在每条染色体相片背面，用游标卡尺测量每条染色体长度（总长、长臂长、短臂长；着丝点一分为二算入两臂），有随体的染色体可计入全长，也可不计入，但必须加以说明。将测量的数据分别记录。（3）根据测量结果换算出各条染色体的相对长度、臂比及着丝粒位置，并根据臂比值确定染色体类型。 染色体长度绝对长度（或实际长度，均以微米表示）=放大的染色体长度（毫米）放大倍数1000染色体相对长度（均以百分比表示）=染色体长度染色体组总长度100%染色体长度比：最长染色体长度最短染色体长度染色体相对长度系数=染色体长度全组染色体平均长度臂比=长臂短臂着丝点位置：以上述臂比值确定。参照Levan（1964）的命名，如表1所示：表1 染色体臂比值、着丝点位置与染色体类型 臂比值着丝点位置表示符号1001.011.701.713.003.017.007.0以上正中着丝点中部着丝点区近中着丝点区近端着丝点区端部着丝点区端部着丝点MmsmsttT臂指数：即把具中部和近部着丝点的“V”形染色体计算为两个臂，而把具近端和端部着丝点的“J”或“I”形染色体计算为一个臂。以此来统计核型中的总比数。着丝点指数=短臂长度染色体全长100核型不对称系数=长臂总长/全组染色体总长核型分类：Stebbins（1971）参照生物界现有的核型资料，根据核型中染色体的长度比和臂比两项主要特征，用以区分核型的对称和不对称程度，并将其分为12种类型，如表2所示。（4）配对排列根据测量数据，比较染色体的大小、形状、相对长度、臂比、着丝粒指数、次缢痕的有无及位置、随体的有无等特征，将照片上的各个染色体分别剪下并进行同源染色体的配对。将配对的染色体按由大到小的顺序进行排列并编号，排列时短臂在上，长臂在下。对于等长的染色体，以短臂长的在前。将排列好的染色体组型图进行翻拍并描绘出染色体组型图。表2 核型类型标准最长最短臂比大于2：1的染色体的百分比0.00.010.50.510.991.0：11A2A3A4A2：14：11B2B3B4B：4:11C2C3C4C（5） 核型分类根据Stebbins的按核型中最长染色体与最短染色体之比及臂比大于2的染色体所占比例、Aran