九龙江水大肠菌群的测定.doc

九龙江水大肠菌群的测定摘要：本文依据统计学原理及大肠杆菌的特性来测定九龙江水中是否含有大肠杆菌，并测定其含量有多少。关键词：大肠杆菌 发酵 革兰氏染色The assay of the Jiulong Rivers waters Escherichia coliAbstract：According to the statistics principle and the characteristics of the Escherichia coli in different concentrations to assay whether the water of the Jiulong River has the Escherichia coli and how much they are.Key words: Escherichia coli; ferment; Gram stain大肠杆菌（Escherichia coli，E.coli） 革兰氏阴性短杆菌，大小0.513微米。周身鞭毛，能运动，无芽孢。能发酵多种糖类产酸、产气，是人和动物肠道中的正常栖居菌，婴儿出生后即随哺乳进入肠道，与人终身相伴，其代谢活动能抑制肠道内分解蛋白质的微生物生长，减少蛋白质分解产物对人体的危害，还能合成维生素B和K，以及有杀菌作用的大肠杆菌素。1 材料与方法1.1 实验材料与培养基1.1.1 实验材料试管、吸头（1mL、5mL）、量筒、玻棒、烧杯、培养皿、水浴锅（箱）、培养箱、显微镜、锥形瓶、接种环、干燥箱、汉德氏管、高压灭菌器、单道移液器、电子分析天平1.1.2 培养基 乳糖胆盐蛋白胨培养基伊红美蓝琼脂（EMB）培养基1.2 3倍浓缩乳糖胆盐蛋白胨液体培养基的配制1.2.1 材料乳糖 30g 蛋白胨 60g 0.04%溴甲酚紫水溶液 75mL胆盐 15g蒸馏水 1000mL1.2.2 配制方法 将上述培养基成分加热溶解于1000mL蒸馏水中后，调pH7.27.4，加入0.04%溴甲酚紫水溶液25mL，充分混匀，分装于置有杜汉氏小管的试管内。115灭菌15min。1.3 伊红美蓝琼脂（EMB）培养基的配制1.3.1 材料 伊红美蓝琼脂（EMB） 37g1.3.2 配制方法 称取37g的EMB加1000ml的蒸馏水，加热溶解后分装于三角锥形瓶中，于LDZX-40B1不锈钢立式灭菌消毒器控制116灭菌20min。然后倒平板。2 操作步骤2.1 多管发酵（大肠菌群的测定）2.1.1 水样的采集用高温灭菌过的试剂瓶到九龙江取水，将瓶子连瓶盖一起伸到10-15厘米的深处打开瓶塞，等水满后盖上盖子后从水中取出。运送水样时应避免玻璃瓶摇动，水样溢出后又流回瓶中，从而增加污染。2.1.2 水样的稀释将灭菌的三根试管各装4.5mL的无菌水标上1、2、3的记号。充分振荡水样，从中吸取0.5mL于1号试管中，充分振荡即得1：1 0的稀释 液。同理配制1：100及1：1000稀释液。2.1.3 初步发酵试验在1个含有50ml 三倍浓缩的乳糖胆盐蛋白胨发酵烧瓶中，加入100ml 水样（轻度污染水的测定）。在2支含有5ml 三倍浓缩乳糖胆盐蛋白胨发酵管中，各加入10ml 水样（中、轻度污染水的测定各一支）。从原水样、1:10、1:100、的稀释液各吸取0.5mL于4支经过灭菌的装有5mL普通浓度乳糖蛋白胨中。（每吸取一次，吸头都要换一次。）原水样，1:10重复一次（中、轻度污染水的测定各一支）。将上述溶液混匀后，于36摄氏度培养24h，24h未产气的继续培养至48h。记录其稀释液的产气管数，进行复发酵试验。2.2 平板分离经24h 培养后，将产酸产气及48h 产酸产气的发酵管（瓶），分别划线接种于伊红美蓝琼脂平板上，再于37下培养18-24h，将符合下列特征的菌落的一小部分，进行涂片，革兰氏染色，镜检。2.3 复发酵试验经涂片、染色、镜检，如为革兰氏阴性无芽孢杆菌，则挑取该菌落的另一部分，重新接种于普通浓度的乳糖胆盐蛋白胨发酵管中，每管可接种来自同一初发酵管的同类型菌落1-3个，37培养24h，结果若产酸又产气，即证实有大肠菌群存在。证实有大肠菌群存在后，再根据初发酵试验的阳性管（瓶）数查表，即得大肠菌群数。3 革兰氏染色3.1 实验器材3.1.1 菌种 大肠杆菌24h48h营养琼脂斜面培养物3.1.2 染色剂革兰氏染色液3.1.3 仪器及其他用具 显微镜、酒精灯、载玻片、接种环、双层瓶（内装香柏油和二甲苯），擦镜纸、生理盐水等3.2 操作步骤3.2.1 制片（1）涂片：取干净载玻片一块，在载玻片中间加一滴蒸馏水，按无菌操作法取菌涂片，制成很薄的涂面，注意取菌不要太多。（2）晾干：让涂片在酒精灯火焰上方文火烘干。（3）固定：手执玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定（以不烫手为宜）3.2.2 初染（1）结晶紫色染色：将玻片置于干净的培养皿上，加适量（以盖满细菌涂面）的结晶紫染色液染色1-2分钟。（2）水洗：倾去染色液，用水小心地冲洗。3.3.3 媒染（1）用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1分钟。（2）水洗：用水洗去碘液。3.3.4 脱色 用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加95%的乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗。革兰氏染色成败的关键是脱色时间，如脱色过度，革兰氏阳性细菌也可被脱色而被误认为是革兰氏阴性细菌。而脱色时间过短，革兰氏阴性细菌则会被误认为是革兰氏阳性细菌。脱色时间的长短还受涂片的厚薄、脱色时玻片晃动的程度等因素的影响。脱色时间一般约20-30s。3.3.5 复染（1）用番红复染约2分钟。（2）水洗：用水洗去涂片上的番红染色液。（3）晾干：将染好的涂片用吸水纸吸干。3.3.6 镜检镜检时先用低倍，再用高倍，最后用油镜观察，并判断菌体的革兰氏染色反应性。被染成蓝紫色的是革兰氏阳性菌，被染成红色的是革兰氏阴性菌。4 结果与分析4.1 初发酵结果三角瓶、大试管以及所有小试管均产酸产气，培养结果，溶液呈发黄浑浊的颜色，溶液中的小导管中有小段气柱。4.2 平板划线结果平板上有三列交错画线的痕迹，其中一列为粗而明显的线条，而后还有相对较细但依旧连接成线的线条，最后是一列断断续续的点连接而成的虚线。且平板上产生紫黑色菌落，应为大肠菌落，但还需由镜检做最后确认。4.3 镜检结果经由革兰氏染色后可在油镜下找到被染成红色的大肠杆菌，以此最终确认九龙江水中确实含有大肠菌群。5 实验心得（1）通过本次实验，我们对大肠杆菌的基本特征有了一定的了解，并对革兰氏染色的原理有了一定的认识。（2）无菌操作是微生物实验中最重要也是最关键的一点。操作过程中一旦被感染，会使之前所做的一切努力全都白费，因而操作之前一定要对所要使用的器皿进行灭菌消毒，并且，在无菌工作台操作之前，要用75%的乙醇对双手及手臂进行杀菌。划平板及接种过程一定要在火焰周围进行，以免空气中的菌体侵入。（3）实验过程中，小组组员的协作配合至关重要，我们小组一共有三个人，三人分工合作，互相指正操作上的失误，以保证实验的顺利进行。6 附录：大肠菌群检数表表1：大肠菌群检数表(严重污染水)接种水样量/ml每升水样中大肠菌群数备注10.10.010.001238000大肠菌群检数表(中度污染水)接种水样量/ml每升水样中大肠菌群数备注1010.10.0190接种水样量为11.11(10,1,0.1,0.01个一份)+90+90+95+180+190+220+230