初始污染菌检测讲义修订.ppt

2008年5月 1 一次性使用医疗用品初始污染菌检测 江苏省医疗器械检验所一次性器具室 2008年5月 2 微生物基础知识 微生物基础知识无菌技术初始污染菌检测关键步骤致病菌检查 2008年5月 3 2008年5月 4 微生物基础知识 微生物与微生物学 自然界中存在着一个数量极其庞大 个体微小和结构简单的生物类群 即微生物 微生物大多数为单细胞 必须借助光学显微镜放大千倍或电子显微镜放大数万倍才能肉眼可见的一类微小生物的统称 微生物学是研究微生物的形态结构 分类 生理代谢 遗传变异 生态分布和微生物与人类 动植物关系等的一门学科 我们对微生物深入研究的目的在于更好地开发微生物资源 充分利用微生物有利于人类生活方面 控制微生物的有害方面 使之更好地为人类服务 2008年5月 5 微生物的分类 2008年5月 6 细菌形态特征 细菌个体形态 细菌是一类细胞细而短 细胞直径约0 5 m 0 5 5 m 结构简单 细胞壁坚韧以二等分裂方式繁殖和水生性较强的原核微生物 分布广泛 形态图 细菌菌落形态 单个或少数细菌细胞生长繁殖后 会形成以母细胞为中心的一堆肉眼可见 有一定形态构造的子细胞集团 这就是菌落 细菌菌落常表现为湿润 粘稠 光滑 较透明 易挑取 质地均匀以及菌落正反面或边缘与中央部位颜色一致等 细菌的菌落特征因种而异 可作为鉴定细菌种的依据 菌落图 2008年5月 7 细菌形态特征 2008年5月 8 细菌形态特征 粘质沙雷氏菌的菌落特征 2008年5月 9 细菌形态特征 铜绿假单孢菌的菌落特征 2008年5月 10 细菌形态特征 金黄色葡萄球菌营养要求不高 在普通培养基上生长良好 需氧或兼性厌氧 最适生长温度37 C 最适生长pH7 4 平板上菌落厚 有光泽 圆形凸起 直径1 2mm 血平板菌落周围形成透明的溶血环 2008年5月 11 细菌形态特征 金黄色葡萄球菌的单个菌落在Baird Parker琼脂平板上呈圆形 表面光滑 凸起 湿润 直径2 3mm 灰黑色至黑色 有光泽 常有浅色 非白色 的边缘 周围绕以不透明圈 沉淀 其外常有一清晰带 当用接种针触及菌落时具有黄油样粘稠感 2008年5月 12 细菌形态特征描述 大小 直径形状 圆形 假根形 不规则型隆起形状 扩展 苔状 低凸 凸面 乳头状边缘 整齐 波状 裂叶状 圆锯齿状 有缘毛表面状态 光滑 皱褶 颗粒状 龟裂状 同心环状表面光泽 闪光 不闪光 金属光泽质地 油脂状 膜状 脆透明程度 不透明 半透明 细菌菌落的常规描述 2008年5月 13 细菌形态特征 细菌基本结构 荚膜 细胞壁 胞浆膜 核蛋白 核质 2008年5月 14 细菌形态特征 革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌的细胞壁结构比较 脂多糖 LPS 包括脂蛋白A 核心多糖和特异性多糖三个部分 LPS对动物具有毒性作用 它牢固地结合在细胞表面 只在菌体融解时才释放 称为细菌内毒素 其中脂蛋白A是内毒素的主要生物学活性组分 2008年5月 15 真菌形态特征 霉菌个体形态 霉菌亦称丝状真菌 是在分类学上很不相同的许多真菌的一部分 凡是生长在营养基质上形成绒毛状 蜘蛛网状或絮状菌丝体的真菌 统称为霉菌 霉菌为真核微生物 其结构比细菌复杂 酵母菌个体形态 酵母菌是单细胞真核微生物 酵母菌细胞的形态通常有球形 卵圆形 腊肠形 椭圆形 柠檬形或藕节形等 比细菌的单细胞个体要大得多 一般为1 5微米 5 30微米 酵母菌无鞭毛 不能游动 酵母菌具有典型的真核细胞结构 有细胞壁 细胞膜 细胞核 细胞质 液泡 线粒体等 有的还具有微体 2008年5月 16 霉菌形态特征 由于霉菌的菌丝较粗而长 因而霉菌的菌落较大 有的霉菌的菌丝蔓延 没有局限性 其菌落可扩展到整个培养皿 有的种则有一定的局限性 直径1 2厘米或更小 菌落质地一般比放线菌疏松 外观干燥 不透明 呈现或紧或松的蛛网状 绒毛状或棉絮状 菌落与培养基的连接紧密 不易挑取 菌落正反面的颜色和边缘与中心的颜色常不一致 2008年5月 17 酵母菌形态特征 啤酒酵母的菌落 大多数酵母菌的菌落特征与细菌相似 但比细菌菌落大而厚 菌落表面光滑 湿润 粘稠 容易挑起 菌落质地均匀 正反面和边缘 中央部位的颜色都很均一 菌落多为乳白色 少数为红色 个别为黑色 2008年5月 18 微生物群体生长规律 将少量单细胞纯培养接种到一恒定容积的新鲜液体培养基中 在适宜的条件下培养 定时取样测定其细菌含量 可以看到以下现象 开始有一短暂时间 细菌数量并不增加 随之细菌数目增加很快 既而细菌数又趋稳定 最后逐渐下降 如果以培养时间为横坐标 以细菌数目的对数或生长速度为纵坐标作图 可以得到一条曲线 称为繁殖曲线 通常又称为生长曲线 生长曲线代表了细菌在新的适宜的环境中生长繁殖直至衰老死亡全过程的动态变化 根据细菌生长繁殖速率的不同 可将生长曲线大致分为延迟期 对数期 稳定期和衰亡期四个阶段 规律的描述 规律示意图 2008年5月 19 微生物群体生长规律 延迟期 少量细菌接种到新鲜培养基后 一般不立即进行繁殖 生长速度近于零 处于延迟期细菌细胞的特点是分裂迟缓 代谢活跃 对数期 对数期又称指数期 这一阶段突出特点是细菌数以几何级数增加 代时稳定 细菌数目的增加与原生质总量的增加 与菌液混浊度的增加均呈正相关性 稳定期 又称恒定期或最高生长期 处于稳定期的微生物 新增殖的细胞数与老细胞的死亡数几乎相等 整个培养物中二者处于动态平衡 此时生长速度又逐渐趋向零 衰亡期 稳定期后如再继续培养 细菌死亡率逐渐增加 以致死亡数大大超过新生数 群体中活菌数目急剧下降 出现了 负生长 此阶段叫衰亡期 2008年5月 20 微生物操作技术 无菌环境是前提 主要是指在微生物实验工作中 控制或防止各类微生物的污染及其干扰的一系列操作方法和有关措施 其中包括无菌环境设施 无菌实验器材等 统称为无菌技术 无菌环境的应用是一个完整的操作技术体系 若其中的任何一个环节污染 那么其他环节虽是无菌操作 也将完全失去意义 无菌技术概念 无菌环境 无菌环境是指人们用物理的或化学的方法 在某一可控的空间内使微生物数量降低到最低限度 接近于无菌的一种空间 2008年5月 21 试验环境的要求及无菌操作 环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内进行 阳性实验室 检查间分离 严格按无菌操作 防止实验室的培养物被其他外来微生物污染 避免操作者自身被微生物感染 无菌操作在有洁净级别的实验室中进行 与试验相关的金属器械 玻璃器皿 稀释剂等应经过灭菌处理 其他的材料应经过表面消毒 紫外线照射消毒后 再带入实验室 2008年5月 22 无菌技术 技术培训和考核制度仪器和试剂的校对制度实验记录制度结果质疑和核对制度技术方法的规范制度 实验室安全制度 安全通则生物安全 微生物检验质量控制制度 2008年5月 23 无菌技术 菌种 菌种保藏原理 保藏的原则是根据微生物的菌种生理 生化特性 在人工创造的条件下尽量降低微生物细胞的代谢强度 使细胞基本上处于休眠状态 生长繁殖受到抑制但又不至于死亡 以降低菌种的变异率 菌种保藏步骤 选择典型菌落 确定菌体形态 选择保藏方法 定期检查 菌种保藏方法 2008年5月 24 无菌技术 琼脂斜面低温保存法 方法 适用范围 特点 注意事项 将经常使用的菌种的典型菌落接种在斜面上 按规定的温度和时间培养 待充分生长后 把培养好的新鲜菌种管用牛皮纸包好 4度冰箱保藏 每隔1个月移种一次 继续进行保藏 本法适用与经常使用的细菌 酵母菌等 1 优点 简便 易推广 一般不需要另选则保藏用培养基 对大多数都适用 2 缺点 保藏期短 传代次数多 易变异和污染 1 保藏菌种的选择 2 定期检查 3 做好记录 2008年5月 25 无菌技术 半固体石蜡保存法 方法 适用范围 特点 注意事项 用石蜡让培养物与空气隔绝 以降低菌种的生理生化水平 并可防止水分蒸发 从而延长菌种的保藏时间 本法适用与部分霉菌 酵母菌和放线菌等 对细菌的效果较差 1 优点 简便 易推广 1 液体石蜡的高度 2 定期检查 3 做好记录 2008年5月 26 无菌技术 斜面培养基接种技术 方法 左手持分离培养的平板培养基 右手持接种环 经火焰烧灼 冷却后在平板上挑取菌落 左手立即放下平板 换持斜面培养基 用右手小指和无名指拔出管塞 夹持于手指之间 将管口在火焰上通过两三次 但勿烧烫 再迅速将挑取有菌的接种环伸进斜面内 从斜面的底部向上划一条接种线 又自下而上蜿蜒接种成曲线 退出接种环 塞上管塞 接种环经火焰灭菌后放置 培养后 沿接种线长出菌苔 非接种线的部位应无细菌生长 2008年5月 27 无菌技术 分离技术 划线分离法 分段划线法 组段间接种环的灭菌 冷却 2008年5月 28 无菌技术 金黄色葡萄球菌的保藏 一般为冻干粉剂 安瓿瓶密封包装 选择性培养基分离菌种 增菌性培养 选择性培养基分离菌种 斜面接种 培养 低温保藏 2008年5月 29 无菌技术 无菌器材 凡是检验中使用的器材 能灭菌处理的 必须灭菌处理 如 玻璃器皿 吸管 培养基 稀释剂 无菌衣 口罩等 在使用前必须经过适当方法灭菌 并在较洁净的环境中保存备用 凡检验用器材无法灭菌处理的 使用前必须经消毒处理 如 无菌室的桌凳 天平 工作台以及工作人员的手等 2008年5月 30 无菌技术 无菌操作 基本概念 无菌操作一般是指在无菌环境条件下 使用无菌制品或无菌器材进行检验或实验的过程中 能防止微生物污染与干扰的一种常规操作方法 操作目的 1 保证检验物品不被环境中的微生物的污染 2 防止被检微生物在操作中污染实验人员和实验环境 主要方面 1 实验前的准备 2 实验中的操作 3 意外事故的处理 2008年5月 31 无菌技术 进入无菌室的控制 1 定期检查无菌环境的空气是否符合规定 2 无菌室在使用前开启紫外线灯30 60min进行空气消毒 3 在进行接种倾注琼脂平板均需在无菌室超净工作台或接种罩内操作3 检查一切进入无菌环境的器材灭菌 消毒的标志物是否完备 4 洗手消毒 首先用肥皂涂在手上揉搓10 15s 肥皂虽不杀菌 有去污作用 然后用流水彻底冲洗 可有效除去手上大多数暂住菌 如连续洗2 3次 视手的污染程度 使残余的微生物减少到最低水平 再用消毒液洗手 如洗必泰 苯扎溴铵 碘伏 乙醇 过氧乙酸等 5 操作人员将手部消毒后 再穿戴无菌工作服 包括鞋 帽 口罩等 严格的无菌服应是戴帽套头的无扣的上衣 颈部 脸部及袖口是紧口的 以保护身体 防止污染 一般的无菌衣是背开口 围胸部 紧扣颈部与长袖紧口的 以保护身体 防止污染 6 在进入无菌室后 进一步用浸有消毒液的棉球或泡沫塑料物消毒手 然后可进行检验或实验操作 2008年5月 32 无菌技术 检验过程的控制 1 在所有操作中均不应大幅度或快速动作 以免搅动空气中尘埃微粒 2 使用玻璃器皿应轻取轻放 避免破损 以防培养物扩散 3 在近火焰区操作 4 使用金属接种器具 用前 用后均需燃烧灭菌 5 应用橡胶乳头套在吸管上端 吸吹供试液或培养液等 切勿用嘴直接吸吹吸管 6 用注射器吸取样品 培养物时 注射器内应无空气 装卸针头时应用灭菌的镊子 从密封容器内抽取液体时 应注入无菌空气 带液体的针筒针头应向上倾斜 并用75 乙醇棉球 挤干 保护针头根部 注射时勿用力过猛 以免内容物喷出或针头脱落使溢出液体污染灭菌器材或环境 7 当灭菌瓶塞或试管塞掉落在工作台上 一般不宜再用 应另换无菌塞 或通过火焰处理后再用 2008年5月 33 无菌技术 意外事故的控制 1 假定无菌衣受污染 应脱下翻转包裹 使污染部分包在内部 送往消毒 经灭菌后 洗涤再用 2 因偶然打破盛有培养物的器皿 致使病原性的菌毒种外溢 污染了工作室及操作者的衣物及体表时 当事人应冷静 切勿乱动以免扩大污染面 应唤他人用浸透消毒液的毛巾或纱布覆盖于碎片上 或将消毒液倒在污染区 浸没一定时间 先从外至内逐步清理污染源 最后将衣物彻底灭菌 清理时应避免用手指收集玻璃碎片 以防污染皮肤 造成病原性微生物感染事故 3 对一般小面积的污染可自行处理 较大范围的污染则请人协助 2008年5月 34 消毒灭菌技术 消毒disinfection 消毒基本概念 消毒是杀灭清除传播媒介上病原微生物 但不能杀死芽孢等全部微生物 所以消毒是不彻底的 不能代替灭菌 消毒方法 见下页 灭菌sterilization 灭菌基本概念 凡能杀灭物体中所有活的微生物的作用称为灭菌 常用灭菌方法 湿热灭菌法 干热灭菌法 辐射灭菌法 气体灭菌法等 2008年5月 35 消毒灭菌技术 2008年5月 36 消毒灭菌技术 2008年5月 37 培养基的基础知识 培养基的概念 培养基是人工配制的生物营养物质 即用人工的方法将多种物质按各种微生物生长繁殖的需要配成的一种混合营养物 培养基的主要成份 培养基的分类 2008年5月 38 培养基的基础知识 培养基制备 常用仪器的准备 2008年5月 39 培养基的基础知识 培养基制备 溶化 校正酸碱度 热过滤 分装 灭菌 1 先将卵磷脂加入少量蒸馏水低温加热溶解溶 再加吐温80混匀 加入琼脂 静置15分钟 高压灭菌前培养基的pH可比最终pH值调高0 2左右 灭菌后基本合适 营养琼脂 调PH7 1 7 4 营养琼脂一般采用121 103 42kPa蒸汽灭菌30min 液体培养基用滤纸过滤 固体培养基用纱布块中夹薄层脱脂棉过滤 2008年5月 40 细菌计数 基本概念 细菌数测定是微生物的定量检查 对非规定灭菌产品中污染的活菌数量进行测定 通常以每克或每毫升供试品作为计量单位 限制条件 平板菌落计数法的特点是先使细胞分散 定位 增生可见菌落后计数 它是一种有条件的计数法 其限制条件大致如下 以菌落数为基础 CFU colonyformingunits 一个菌落就是一个细菌形成单位 它可以由一个也可以由多个菌细胞形成 受特定培养基和培养条件限制 有繁殖能力的菌细胞才能认定 活菌 2008年5月 41 初始污染菌检测 初始污染菌检测 目前使用标准GB15980 一次性使用医疗卫生标准 本标规定了一次性使用医疗用品灭菌 消毒前 后的卫生标准 本标准对一次性使用医疗用品 包括灭菌的和消毒的一次性使用医疗用品 生产 装配 包装车间等生产过程和生产工人手提出卫生的质量控制 引用标准 GB7918 2 GB8368 GB8369 中华人民共和国药典 2008年5月 42 初始污染菌检测 指标含义 测定检品细菌总数可用来判明检品细菌污染的程度 以及生产单位所用的原料 工具设备 工艺流程 生产人员的卫生状况 是对检品进行卫生学评价的综合依据 方法主要步骤 采样 供试液制备 培养 菌落计数 2008年5月 43 初始污染菌检测 采样方法 供试液制备 供试品是敷料 可以破坏性类可用无菌手续称取10g 放入100ml灭菌生理盐水中充分振荡后取样 作为1 10的供试液 2 供试品是液体取10ml加至100ml灭菌生理盐水中充分振荡后取样 作为1 10的供试液 3 对供试品不能采用破坏性取样可用浸有无菌生理盐水拭子涂抹采样 被采表面积为100cm2 加入灭菌生理盐水100ml 作为1 10的供试液 4 可用破坏性方法取样供试品 参照中华人民共和国药典2005年规定进行 5 采样数量 各类产品每批随机抽取10件样品 6 检验方法 将每样取5份平行样 参照GB7918 2规定进行 2008年5月 44 初始污染菌检测 7 结果计算公式 平均菌落数 稀释倍数菌数菌数 每件次 或g 件次或重量 g 注意事项 供试品的取样必须在万级环境中100级净化条件下 无菌操作 防止污染 应严格遵守无菌操作 同时消除抑菌成份的干扰 2008年5月 45 初始污染菌检测 供试液制备 推荐的制备方法 样品制备 供试液制备 梯度稀释 加样 用灭菌剪刀将纱布剪成小块 称取10g 移入100ml稀释剂中 保温于45 水浴中5 10min 不时振摇 作为1 10供试液 供试液10倍递减稀释 尽量避免丝线等杂物的混入 1 每个稀释级各吸取1ml至每个灭菌平皿 每个稀释级注2个平皿 2 经灭菌完毕的营养琼脂培养基冷却至45 50 时 倾注上述各个平皿15ml 另倾注一个不加样品灭菌空平皿作空白对照 以顺时针或逆时针方向快速转动平皿 使供试液与培养基充分混匀 纱布模拟 2008年5月 46 初始污染菌检测 梯度稀释 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 供试液 9mlNacl 9mlNacl 1 10 1 100 1 1000 2008年5月 47 2008年5月 48 初始污染菌检测 培养 将已经凝固的平板倒置于37 培养箱中 一般培养48 2h 菌落计数 计数方法 将平板置菌落计数器或从平板的背面直接以肉眼用标记笔点计 以投射光衬以暗色背景 仔细观察 计数 必要时可以借助于放大镜 菌落计数器 菌落特征 形态特征 常为白色 灰白色或灰色 亦有淡褐色 淡黄色 如果培养基中加入0 1 TTC试剂 菌落为红色 边缘整齐或不整齐 表面有光滑 粗糙 皱褶 突起或扁平 大小差异很大 2008年5月 49 初始污染菌检测 菌落计数 菌落计数基本规则 1 选取平均菌落数在30 300之间的稀释级作为报告菌落数测定范围 如只有1个稀释级平均菌落数在30 300之间 则将稀释级的菌落数乘以稀释倍数报告 2 如有两个相邻稀释级的平均菌落数在30 300之间 则先计算两稀释级菌落数的比值 高稀释级的平均平板菌落数 稀释倍数比值 低稀释级的平均平板菌落数 稀释倍数当比值 2时 则以2个稀释级的平均菌落数均值报告 当比值 2时 则以低稀释级的平均菌落数乘以稀释倍数报告 3 如各稀释级平均菌落数均在300以上 则按最高平均菌落数乘以稀释倍数报告 如各稀释级平均菌落数均在30以下 则按最低平均菌落数乘以稀释倍数报告 2008年5月 50 初始污染菌检测 菌落计数 菌落计数基本规则 4 如各稀释级平均菌落数均不在30 300之间 则以最接近30或300的稀释级平均菌落数乘以稀释倍数报告 5 如各稀释级平均菌落数均无菌落生长或最低稀释级平均菌落数小于1时 应报告菌数为 10个 g或ml 6 如有3个稀释级平均菌落数均在30 300之间 则以后2级计算级间比值报告 7 菌落计数的报告 菌落数在10以内时 按实有数值报告 大于100时 采用二位有效数字 在两位有效数值后面 应以四舍五入法计算 在报告菌落数为 不可计 时 应表明样品的稀释度 2008年5月 51 初始污染菌检测 菌落计数 细菌计数结果及报告方法 2008年5月 52 控制菌的检查 参照 药典 2005版 GB15979 20021 大肠埃希菌BL增菌培养 MUG培养 靛基质试验具体检查见表1 结果判断MUG阳性 靛基质阴性 或MUG阴性 靛基质阳性 则应取胆盐乳糖培养基的培养物划线接种于曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基的平板上 培养18 24小时 若平板上无菌落生长 或生长的菌落与表3所列的菌落形态特征不符 判供试品未检出大肠杆菌 若有可疑菌落 进行IMVic 2008年5月 53 表3大肠埃希菌菌落形态特征 2008年5月 54 表1大肠杆菌的检查 2008年5月 55 表2结果判断 2008年5月 56 2 金黄色葡萄球菌营养肉汤增菌培养 平板 高盐 划线培养 观察 血浆凝固酶试验具体检查方法见表3 2008年5月 57 表3金黄色葡萄球菌的检查 2008年5月 58 表4金黄色葡萄球菌菌落形态特征 平板上无菌落生长或生长的菌落不同于表4所列特征 判供试品未检出金黄色葡萄球菌 平板上生长的菌落与表4所列的菌落特征相符或疑似 应挑选2 3个菌落 分别接种于营养琼脂培养基斜面上