（生理学专业论文）人醇脱氢酶（adh）相关等位基因的克隆与序列分析.pdf

人醇脱氨酶( a d i i ) 相关等位基因的克隆与序列分析 摘要 目的：克隆人i 型醇脱氢酶( a d h ) 等位基因的编码区序列，为构建 i 型a d t t 单个等位基因的真核表达系统做准备。利用生物信息学技术区分 i 型a d t l 基因的不同等位基因并分析其单核苷酸多态性。方法：根据从 g e n b a n k 数据库中检索到的a d h l b 基因c d n a 的r e f s e q 序列，用p r i m e r 5 软件在编码区两侧设计一对引物，其中上游引物中有一起始密码子并在5 端加上一个x b ai 限制性酶切位点，下游引物中有一终止密码子并在5 端加上一个e c o ri 限制性酶切位点，使扩增产物包含完整编码区序列。 取人癌旁正常肝组织，用t r i z o l 试剂盒提取总r n a 后，利用两步法 r tp c r 先获得i 型a d h 等位基因的c d n a ，然后p e r 扩增出大量的i 型 a b 等位基因编码区序列。再用双酶切得到目的基因并定向克隆到p u c l 9 载体上。经过蓝白筛选后，用限制性酶谱和d n a 测序以及b l a s t 比对分 析进行鉴定，另外还用s n pb l a s t 比对分析和查询d b s n p 数据库分析克 隆到的i 型a d h 等位基因的单核苷酸多态性。结果：用r t p c r 方法 扩增出与预期大小相符的a b h 基因片段：经蓝白筛选获得了带 p u c l 9 - a d h 重组质粒的白色菌落；用限制性酶谱分析表明所克隆片段与 预期的a d h 基因编码区大小相符； d n a 测序后的克隆序列编码区与 g e n b a n k 数据库中i 型a d h 三个基因c d n a 的r e f s e q 序列编码区用 b l a s t 进行两序列比对分析，结果表明送测的几个重组质粒中，成功克隆 了i 型a d h 基因中的a d h i c * i ，a d h l c * 2 和a d h i b * 2 三个等位基因； 用b l a s t 两序列比对分析表明，a d h i c * j 等位基因与a d h i cc d n a 的r e f s e q 序列有2 个碱基不一致，而其编码的氨基酸序列完全一致，并且 克隆序列所编码氨基酸序列的第2 7 2 位是精氨酸，第3 5 0 位是异亮氨酸。 根据以上分析可确定本克隆序列为a d h l c * i 等位基因。用s n p b l a s t 比 对分析和查询d b s n p 数据库，确定两个不一致的碱基都是同义单核苷酸多 态性。用b l a s t 两序列比对分析表明，a d h i c * 2 等位基因与a d h i c e d n a 的r e f s e q 序列有6 个碱基不一致，而其编码的氨基酸序列有3 个氨 基酸不一致，并且克隆序列所编码氨基酸序列的第2 7 2 位是谷氨酰胺，第 3 5 0 位是缬氨酸。根据以上分析可确定本克隆序列为a d h l c * 2 等位基因。 用s n pb l a s t 比对分析和查询d b s n p 数据库，确定有3 个不一致的碱基 是同义单核苷酸多态性，而另外3 个不一致的碱基是非同义单核苷酸多态 性，特别是第2 7 2 位密码子的第二位碱基和第3 5 0 位密码子的第一位碱基 的这种非同义单核苷酸多态性是区分a d h l c * i 和a d h i c * 2 两个等位基 因的依据；用b l a s t 两序列比对分析表明，a d h l b * 2 等位基因与a d h l b e d n a 的r e f s e q 序列有2 个碱基不一致，而其编码的氨基酸序列有1 个氨 基酸不一致，并且克隆序列所编码氨基酸序列的第4 8 位是组氨酸，第3 7 0 位是精氨酸。根据以上分析可确定本克隆序列为a d h l b * 2 等位基因。用 s n pb l a s t 比对分析和查询d b s n p 数据库，确定其中1 个不一致的碱基 是同义单核苷酸多态性。而另一碱基的不一致目前并未查到其属于单核苷 酸多态性。这种碱基变化使克隆的a d h l b * 2 等位基因第2 3 位密码子代表 的是脯氨酸，而r e f s e q 相应位置代表的是丝氨酸。推测其可能是p c r 反 应产生的突变，也可能是一种新的非同义单核昔酸多态性，这需要通过进 一步的实验证实。结论：本研究用常规的基因克隆技术和新的生物信息学 方法，证实所克隆片段为a d h i c * i ，a d h l c * 2 和a d h l b * 2 三个等位基 因完整的编码区序列，并构建了p u c l 9 - a d h l c * 1 ，p u c l 9 - a d h l c * 2 和 p u c l 9 - a d h l b * 2 三个重组质粒。由于克隆序列两端分别加上了一个x b a i 和e c o ri 限制性酶切位点，可以定向克隆到适当的真核细胞表达载体 中，进一步探循其分子作用机制。序列分析证实a d h i c 和a d h l b 两个基 因的核苷酸序列和氨基酸序列都很相似，特别是编码区两侧碱基序列完全 一致，因此用一对引物克隆了两个基因的等位基因。另外，通过s n p 分析 证实a d h l c 和a d h l b 两个基因的部分碱基位点存在着单核苷酸多态性。 关键词：醇脱氢酶；a d h l c 基因；a d h i b 基因：基因克隆：序列分 析；s n p c l o n i n ga n d s e q u e n c ea n a l y s i so ft h ec o r r e l a t i v e a l l e l e so ft h eh u m a na l c o h o ld e h y d r o g e n a s e ( a o n ) g e n e a b s t r a c t 0 b j e c t i v e ：t oc l o n et h ec o d i n gr e g i o ns e q u e n c eo f t h ec l a s si a l c o h o ld e h y d r o g e n a s e 似d 加a l l e l e so fh u m a nf o rp r e p a r i n gt h ec o n s t r u c t i o n o fe u k a r y o t i ce x p r e s s i o ns y s t e mi nt h ef u t u r e a n dt h ed i f f e r e n ta l l e l e so ft h e c l a s sia d h g e n e sa r ei d e n t i f i e da n dt h e i rs i n g l en u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m s ( s n p ) a r ea n a l y z e db yb i o i n f o r m a t i c st e c h n o l o g y m e t h o d s ：a c c o r d i n gt ot h e e d n a r e f s e qo fa d h i bg e n er e t r i e v e df r o mg e n b a n kd a t a b a s e ，ap a i ro ft h e p r i m e r sl o c a t e do nt h et w os i d e so ft h eg e n ec o d i n gr e g i o l lw a sd e s i g n e dw i t h t h ep r i m e r5s o f t w a r e t h eu p s t r e a mp r i m e rh a db e e nd e s i g n e da ni n i t i a t i o n c o d o na n di n s e r t e da nx b air e s t r i c t i o ne n d o n u c l e a s es i t ea ti t s5 7 t e r m i n a l ，a n d t h ed o w n s t r e a mp r i m e rh a db e e nd e s i g n e dat e r m i n a t i o nc o d o na n db ea d d e da l l e c o rir e s t r i c t i o ne n d o n u c l e a s es i t ea ti t s5t e r m i n a ls ot h a tt h ea m p l i f i e d p r o d u c t sw o u l dc o n t a i nt h ei n t a c tc o d i n gr e g i o ns e q u e n c eo fa d hg e n e s t h e t o t a lm r n aw a se x t r a c t e df r o mh u m a nn o r m a ll i v e rt i s s u e sb e s i d ec a n c e rw i t h t r i z o lr e a g e n tk i ta n du s e da sat e m p l a t et oa m p l i f ye d n ao ft h ec l a s si a l c o h o ld e h y d r o g e n a s e ( a d h 3a l l e l e sb yt h et w os t e pr t - p c r t h e nt h e f r a g m e n t so ft h ec l a s s ia d hg e n eb e t w e e nt w oe n d o n u c l e a s es i t e sw e r e o b t a i n e da n dc l o n e dd i r e c t l yi n t op u c l 9v e c t o r s b yt h eb l u e w h i t es c r e e n i n g ， t h er e c o m b i n a n tp l a s m i d sw i t ht h ec l a s sia d ha l l e l ew e r es e l e c t e da n d i d e n t i f i e db yr e s t r i c t i o nm a p p i n g ，d n as e q u e n c i n ga n db l a s ta l i g n m e n t 4 a n a l y s i s i na d d i t i o n ，t h es n p so ft h ec l a s s ia d ha l l e l e sw e r ea n a l y z e db y s n pb l a s ta l i g n m e n ta n ds e a r c h i n gf o rd b s n p r e s u l t s ：t h ef r a g m e n t s i z eo f a d h g e n ea m p l i f i e db yr t - p c r w a sm a t c h e dw i t ht h ee x p e c t e dr e s u l t w h i t eb a c t e r i a lc l o n e sw i t hp u c1 9 - a d hw e r eo b t a i n e db yt h eb l u e w h i t e s c r e e n i n g t h ec l o n i n gf r a g m e n ts i z ew a sm a t c h e dw i t ht h ee x p e c t e dr e s u l t b yr e s t r i c t i o nm a p p i n ga n a l y s i s d n as e q u e n c i n g a n d t w o - s e q u e n c e a l i g n m e n ta n a l y s i sw i t ht h er e f s e qo ft h r e ec l a s sia d hg e n ec d n a si n g e n b a n kd a t a b a s e b y b l a s tp r o v e dt h a t a d h i c + j ，a d h l c * 2a n d a d h i b 4 2a l l e l e sw e r ec l o n e ds u c c e s s f u l l yi ns e q u e n c i n gr e c o m b i n a n tp l a s m i d s t w o s e q u e n c ea l i g n m e n ta n a l y s i sb yb l a s t i n d i c a t e dt h a tt h ea d h l c 书j a l l e l eh a s2i n c o n s i s t e n tb a s e sw i t ht h er e f s e qo ft h ea d h i cg e n ee d n a ，b u t i t sc o d i n ga m i n oa c i ds e q u e n c ew a sc o m p l e t e l yc o n s i s t e n t ，a n di nt h ea m i n o a c i ds e q u e n c ec o d e db yt h ec l o n i n gs e q u e n c e ，t h e2 7 2 4a m i n oa c i dr e s i d u ew a s a r g i n i n ea n dt h e3 5 0 ma m i n oa c i dr e s i d u ew a si s o l e u c i n e t h e r e f o r et h e c l o n e ds e q u e n c ew a si d e n t i f i e da sa d h l c + a l l e l ea c c o r d i n gt ot h ea b o v e a n a l y s e s ，a n dt w oi n c o n s i s t e n tb a s e sw e r ed e t e r m i n e da ss y n o n y m o u ss n p sb y s n pb l a s ta l i g n m e n ta n a l y s i sa n ds e a r c h i n gf o rd b s n p t w o s e q u e n c e a l i g n m e n ta n a l y s i sb yb l a s ti n d i c a t e dt h a tt h e r ew e r e6i n c o n s i s t e n tb a s e s m a t c h i n gt ot h er e f s e qo f t h ea d h i c g e n ee d n ai nt h ea d h l c + 2 a l l e l e b u t i ni t sc o d e da m i n oa c i ds e q u e n c et h e r ew e r e3a m i n oa c i d sn o tt ob e i n c o n s i s t e n t ，a n di nt h ea m i n oa c i ds e q u e n c ec o d e db yt h ec l o n i n gs e q u e n c et h e 2 7 2 n dw a sg l u t a m i n ea n dt h e3 5 0 mw a sv a l i n e s ot h i sc l o n e ds e q u e n c ew a s i d e n t i f i e da st h ea d h l c + 2a l l e l eb yt h ea b o v ea n a l y s e s b ys n pb l a s t a l i g n m e n ta n a l y s i sa n ds e a r c h i n gf o rd b s n p , 3i n c o n s i s t e n tb a s e sw e r e d e t e r m i n e da s s y n o n y m o u ss n p sa n d o t h e r3i n c o n s i s t e n tb a s e sw e r e n o n s y n o n y m o u ss n p g e n e r a l l y , t h en o n s y n o n y m o u ss n p s a tt h es e c o n db a s e o ft h e2 7 2 硼c o d o na n dt h ef i r s tb a s eo ft h e3 5 0 t hc o d o nw e r ep r o o f st o 一， ， d i s t i n g u i s h e da d h l c + jf r o ma d h l c + 2a l l e l e t w o s e q u e n c ea l i g n m e n t a n a l y s i sb yb l a s ti n d i c a t e dt h a tt h ea d h l b 4 2a l l e l eh a d2i n c o n s i s t e n tb a s e s m a t c h i n gt ot h er e f s e qo ft h ea d h l bg e n ee d n a ，b u ti t sc o d e da m i n oa c i d s e q u e n c eh a s 1a m i n oa c i dn o tt ob ei n c o n s i s t e n t ，a n di nt h ea m i n oa c i d s e q u e n c ec o d e db yt h ec l o n e ds e q u e n c e ，t h e4 8 mw a sh i s t i d i n ea n dt h e3 7 0 mw a s a r g i n i n e t h e r e f o r et h i sc l o n es e q u e n c ew a si d e n t i f i e da sa d h l b + 2a l l e l eb y t h ea b o v ea n a l y s e s ，a n d1i n c o n s i s t e n tb a s ew a sd e t e r m i n e da s s y n o n y m o u s s n pb ys n pb l a s ta l i g n m e n ta n a l y s i sa n ds e a r c h i n gf o rd b s n p b u tt h e o t h e ro n ei n c o n s i s t e n tb a s eh a d n tb e e nd e t e r m i n e da sn o n s y n o n y m o u ss n p u n t i ln o w t h i sv a r i a t i o nw o u l dc a u s et h a tt h e2 3 mc o d o no ft h ec l o n e d a d h i b + 2a l l e l e r e p r e s e n t e dap r o l i n e ，b u tt h ec o r r e s p o n d i n gp o s i t i o no f a d h l be d n ar e f s e qw a ss e r i n e i tw a sp r e s u m e dt h a tt h ev a r i a t i o nw o u l db e am u t a t i o nc a u s e db yp c ro ran e wn o n s y n o n y m o u ss n p s ot h ef u r t h e r c o n f i r m a t i o nt h r o u g he x p e r i m e n tw a sn e e d e d c o n c l u s i o n ：t h i sr e s e a r c hh a s c o n f i r m e dt h a tt h ec l o n e df r a g m e n t sc o n t a i nt h ei n t a c tc o d i n gr e g i o ns e q u e n c e o f a d h l c + j ，a d h l c + 2a n da d h i b 4 2a l l e l e sa n dt h r e er e c o m b i n a n tp l a s m i d s ， i n c l u d i n gp u c l 9 - a d h l c + j ，p u c l 9 - a d h i c * 2a n dp u c l 9 - a d h l b * 2h a v e b e e nc o n s t r u c t e d s u c c e s s f u l l yb yu s i n g t h ec o n v e n t i o n a l g e n ec l o n i n g t e c h n o l o g y a n dm o d e mb i o i n f o r m a t i c sm e t h o d b e c a u s ei nt h ec l o n e d 6 s e q u e n c e s ，a nx b aia n da ne c o rir e s 仃i c t i o ne n d o n u c l e a s es i t e sh a v eb e e n i n s e r t e do nt w os i d e sr e s p e c t i v e l y , t h e yc o u l d b e d i r e c t l ys u b c l o n e di n t o e u k a r y o t i ce x p r e s s i o n v e c t o r sf o rf u r t h e r r e s e a r c h i n g t h e i rm o l e c u l a r m e c h a n i s m s t h es e q u e n c ea n a l y s e sh a v ec o n f i r m e dt h a tt h en u c l e o t i d e s e q u e n c e sa n da m i n oa c i ds e q u e n c e so fa d h l c a n da d h i bg e n e sa r ev e r y s i m i l a r e s p e c i a l l yt h eb a s e so nt w os i d e so ft h ec o d i n gr e g i o na r ec o n s i s t e n t c o m p l e t e l ys ot h a tt w oa l l e l e so fa d h i ca n da d h l bc o u l db ec l o n e dw i t ha p a i ro fs a m ep r i m e r s i na d d i t i o n ，i th a sb e e nc o n f i r m e dt h a ts o m eb a s es i t e si n t h ea d h i ca n dt h ea d h l b g e n e sh a v es n p st h r o u g hs n pa n a l y s e s k e yw o r d s ：a l c o h o ld e h y d r o g e n a s e a d h l cg e n e a d h i bg e n e g e n e c l o n i n g s e q u e n c ea n a l y s i s s n p 7 前言 乙醇脱氢酶乙醇氧化体系是在肝脏中代谢乙醇的一条主要途径。乙醇 脱氢酶乙醇氧化体系包括醇脱氢酶( a l c o h o ld e h y d r o g e n a s e ，a d h ) 和醛脱 氢酶( a l d e h y d e d e h y d r o g e n a s e ，a l d h ) 。国内外研究发现a d h 和a l d h 都 是多个同工酶组成的大家族，现在的研究已发现a d h 基因家族包括 a d h l a 、a d h i b 、a d h l c 、a d h 4 、a d h 5 、a d h 6 和a d h 7 共7 个基因【1 。2 】。 编码a d h 的人类a d h 基因位于4 号染色体的长臂，可编码同源或异源二 聚体的a d h 同工酶吲。已知至少有2 0 余种同工酶。根据它们的电泳泳动 度、动力学特性、对酒精的亲和力和是否受四甲基毗唑的抑制将a d h 分 为5 型，a d h l a ，a d h l b 和a d h l c 为i 型，a d h 4 ，a d h 5 ，a d h 7 和 a d h 6 分别为i i ，i i i ，和v 型。i 型a d h 基因中的a d h i b 和a d h l c 两 个基因存在不同的等位基因，其基因具有多态现象，这些等位基因编码的 酶对乙醇有不同的氧化率【4 】。可见整个a d h 基因家族及其同工酶组成比较 复杂，而且国内外的研究已表明其同酒精性肝病、酒精中毒、帕金森病和 心肌梗塞等多种疾病相关。 我们的研究希望克隆i 型a d h 基因单个等位基因并逐步探寻其分子 作用机制。 材料与方法 1 实验材料 1 1 菌株和质粒 1 1 1 感受态j m l 0 9 大肠杆菌菌株：购于宝生物工程( 大连) 有限公司。 1 1 2 p u c l 9 载体：购自宝生物工程( 大连) 有限公司，质粒大小为2 ， 6 8 6 b p 。 2 主要试剂和试剂盒 2 1 总r n a 提取试剂盒t r i z o l 购于g i b c o b r l 公司。 2 2t a k a r a r n a p c r k i t ( a m v ) v e r 3 0 ，限制性内切酶，t 4 d n a 连接 酶，琼脂糖凝胶d n a 片段回收试剂盒均购自宝生物工程( 大连) 有限公 司。 2 3 d n a 纯化试剂盒e z n a c y c l e - p u r ek i t 购自o m e g a 公司。 2 4p c r 引物合成：设计的一对上下游引物p l 、p 2 由宝生物工程( 大连) 有限公司合成，各2 个o d 值。 2 5 i p t g 和x g a l ：均购自宝生物工程( 大连) 有限公司。 2 6 胰蛋白胨、酵母提取物和琼脂粉均购于成都天泰生命科技有限公司。 2 7 核酸分子量标准物：m x l 7 4 h a ei i id i g e s td n am a r k e r 购自宝生物工 程( 大连) 有限公司。 2 8l b 培养液：每1 0 0 m ll b 培养液中加入1 0 0 m g m l 的氨苄青霉素6 0 9 l 。 2 9l b 固体培养基：加热完全融化l b 固体培养基，自然冷却至5 5 。c 后 加入1 0 0 m g m l 氨苄青霉素至终浓度为6 0 9 9 ml ，混匀后迅速平铺于经高压 蒸汽消毒的培养皿中，3 7 。c 孵育备用。 3 主要实验仪器 3 1p c r 仪德国e p p e n d o r f 公司5 3 3 1 型。 3 2t g l 1 6 g 高速台式离心机产于湖南。 3 3 5 4 1 7 r ( 1 6 0 0 0 r p m ) 低温高速离心机为德国e p p e n d o r f 公司出品。 3 4z f 9 0 型多功能暗箱式紫外透视仪产于上海。 3 5d y y i i l 5 型电泳仪产于北京六一仪器厂。 3 6 凝胶成像分析系统由美国g e n e 公司出品。 3 7 紫外分光光度计u v l1 0 0 北京瑞利公司。 3 8 空气浴振荡器h z q c 哈尔滨东朕公司。 4 实验方法 4 1目的基因核酸序列的检索以及引物的设计 4 1 1 根据从g e n b a n k 数据库中检索到的a d h i b 基因e d n a 的r e f s e q 序列自行设计。应用p r i m e r5 软件设计引物序列，其序列如下： 上游引物2 9b d 5 g c ct c t a g ata t ga g c a c a g c a g g aaa a g 3 7 下游引物3 0 b p 57 一g c ag aa t t cat c aa a a c ( n a g g a c g g t a c 一3 7 在上游引物序列中有一起始密码( 单下划线处) ，另加有一个x b ai 限 制性酶切位点( 双下划线处) 和3 个保护碱基。在下游引物序列中有一终 止密码子( 单下划线处) ，另加有一个e c o ri 限制性酶切位点( 双下划线 处) 和3 个保护碱基。引物合成由宝生物工程( 大连) 有限公司完成。 4 2 人肝组织总r n a 提取 人肝组织取白手术切除的癌旁正常肝组织，总r n a 按g i b c o b r l 公 司提供的操作说明书提取，经紫外分光光度法测定和甲醛变性胶电泳确定 所获得r n a 的浓度、纯度和完整性。 4 3 两步法r t p c r 扩增a d h 基因的c d n a 4 3 1 反转录反应合成a d h 基因的c d n a 为了取量方便，先扩大到4 倍的量来配制，然后分成1 0 0 1 反应体系： r n a s ef r e eh 2 0 1 5 山 10 xrt缓冲液401 m g c l 28 0 1 d n t pm i x t u r e ( 各10 mm)41d r n a s ei n h i b i t o r10 1 a m vr e v e r s et r a n s c r i p t a s e 2 0 a o l i g od t - a d a p t o rp r i m e r 4 0 1 提取的人总r n a 4 0 1 将以上溶液轻轻混匀后，分成4 个小管，每管1 0 0 1 。 按以下条件进行反转录反应： 4 2 3 0 m i n 、 9 9 5m i n1 个循环 5 。c 5m i n j 4 3 2p c r 反应 为了取量方便，先扩大到4 倍的量来配制，然后分成4 0 0 , 1 反应体系， 按下列组成配制p c r 反应液： 灭菌蒸馏水1 1 5 0 a 5 x p c r 缓冲液4 0 0 1 上游特异引物 2 9 l 下游特异引物 2 9 l t a k a r ae xt a q t mh s l g l 将以上溶液轻轻混匀后，在反转录反应结束后的4 管溶液中每一管加 入上述混合后的溶液4 0 9 l ，轻轻混匀，配成5 0 山的p c r 反应体系。 按以下条件进行p c r 反应： 9 4 。c2m i n 1 个循环 9 4 3 0s e c、 5 5 。c 3 0s e c 3 2 个循环 7 2 1m i n1 0s e cj 反应结束后，取1 0 9 lp c r 产物，在含0 5 吲l 溴化乙锭的1 琼脂 糖中电泳，在紫外透射仪下观察结果。电泳结果用d n a 成像系统照相并 打印结果。 4 3 3 r t p c r 扩增产物的纯化 用o m e g a 公日 的d n a 纯化试剂盒e z n a c y c l e p u r ek i t 纯化p c r 产物。 4 3 3 1 用琼脂糖凝胶溴化乙锭电泳分析r t - p c r 产物。 4 3 3 2 确定r t p c r 产物的体积，转移至1 5 m l 的离心管中，并加入等量 的n c p 缓冲液。 4 3 3 3将样品移入到一个套在干净的2 m l 收集管中的h i b i n d d n a 吸附 柱内，并在室温1 0 ，0 0 0 g 离心1 分钟。弃液体。 4 3 3 4 加入用无水乙醇稀释的s p w 缓冲液7 0 0 ；t l 洗涤吸附柱，在室温1 0 ， 0 0 0 x g 离心1 分钟。 4 3 3 5 弃液体，然后另外加s p w 缓冲液7 0 0 p 1 重复第4 步。 4 3 3 6 弃液体，用空吸附柱1 0 ，0 0 0 xg 离心1 分钟以干燥柱子。这一步 对获得好的d n a 量相当重要。 4 3 3 7 把吸附柱放入一个干净的1 5 m l 的离心管中。加入3 0 - 5 0 0 a ( 取 决于期望的最终浓度) 灭菌蒸馏水( 或者t e 缓冲液) 到吸附柱，1 0 ，0 0 0 g 离心1 分钟以洗脱d n a 。 4 4 双酶切反应 4 4 1a d h 基因双酶切体系： 限制酶x b ai 2 9 l 限制酶e c o ri 2 9 l 1 0 x m 缓冲液4 m r t - p c r 纯化后产物3 0 u l 灭菌蒸馏水 2 1 a l 配制成4 0 山反应体系，轻轻混匀，酶切作用时间4 h 。 4 4 2 p u c l 9 载体双酶切体系： 限制酶x b ai1 m 限制酶e c o r i1 “l 1 0 m 缓冲液2 山 p u c l 9 载体 1 “l 灭菌蒸馏水1 5 山 配制成2 0 9 l 反应体系，轻轻混匀，酶切作用时间4 h 。 4 4 3 纯化双酶切后产物 用o m e g a 公司的d n a 纯化试剂盒e z n a c y c l e - p u r ek i t 分别纯化 a d h 基因和p u c l 9 载体双酶切产物( 操作方法见4 3 3 ) ，并用电泳简单定 量。 4 5连接反应 根据电泳结果分析，确定以以下量来配制2 5 1 x l 连接反应体系： 纯化后的双酶切r t - p c r 产物 5 1 t l 纯化后的双酶切p u c l 9 载体5 山 1 0 x t 4d n a 连接缓冲液 2 5 山 灭菌双蒸水 1 1 5 m t 4 d n a 连接酶1 u l 把此连接反应体系放入冰箱4 c 静置过夜。用o m e g a 公司的d n a 纯化试剂盒e z n a c y c l e - p u r ek i t 纯化连接反应产物( 操作方法见4 3 3 ) ， 然后用电泳结果证明出现了与理论结果大小相近的片段。 4 6 转化 4 6 1 把从一7 0 冰箱中取出的感受态细菌置于冰浴中融化。 4 6 2 取出6 0 p l 感受态细菌移至灭菌处理的e p 管内。再加入1 0 i t l 连接液。 冰中放置3 0 分钟，4 2 c 放置4 5 6 0 秒，然后再在冰中放置2 3 分钟。 4 6 , 3 加入3 7 c 预温好的不含氨苄青霉素的l b 培养基，使终体积至 1 0 0 0 1 x l ，3 7 c 振荡培养l 小时( 1 6 0 - - 2 2 5 r p m ) 。 4 6 4 取适量( 每个9 0 m m 平板达2 0 0 p 1 ) 涂布于琼脂培养基上。将平板 置于室温直至液体被吸收后，倒置平板，于3 7 c 培养，1 2 1 6 小时可出现 菌落。 4 7 蓝白筛选 4 7 1 在一个预先铺好的l b 琼脂平板( 加相应适量抗生素) 上，加4 r d2 0 0 m g m li p t g 和4 0 1 t l2 0 m g m lx g a l ，用灭菌玻璃铺菌器均匀涂布在平板上， 正向放置于3 7 。c 培养箱3 小时左右备用。 4 7 2 取适量( 每个9 0 m m 平板达2 0 0 p 1 ) 涂布于琼脂培养基上。将平板 置于室温直至液体被吸收后，倒置平板，于3 7 。c 培养，1 2 1 6 小时可出现 菌落。转化后的细菌能在含氨苄青霉素的l b 培养基上生长。 4 8 质粒抽提 4 8 1 细菌的扩大培养 4 8 1 1 挑取l b 琼脂平板上的单个白色菌落，接种于5 m ll b 培养液中( 含 适量的抗生素) ，3 7 ，2 0 0 r m p 振荡培养过夜。 4 8 1 2 取菌液1 1 5 m l ，1 0 ，0 0 0 r m p 离心3 0 秒，弃上清，用1m l s t e 悬浮 菌体沉淀，再离心回收菌体。 4 8 2 碱裂解法提取质粒d n a 4 8 2 1 将细菌沉淀悬浮于1 0 0 1 d 冰预冷的溶液i 中，打散。 4 8 2 2 加入2 0 0 1 d 溶液i i ，盖严管盖颠倒微型离心管5 次，以混合内容物， 不要强烈振荡，放置冰上3 分钟左右。 4 8 2 3 加入1 5 0 1 溶液，将管盖朝下温和振荡1 0 秒，冰上放置3 5 分钟。 4 8 2 41 2 ，0 0 0 g ，4 。c 下离心5 分钟，取上清液至1 个新的离心管中。 4 8 2 5 加入等体积酚氯仿( 1 ：1 ) ，振荡混匀，1 2 ，0 0 0 xg ，4 。c 下离 心1 2 分钟，取上清液至1 个新的离心管中。 4 8 2 6 加入2 倍体积乙醇( 室温) ，振荡混匀，室温下放置2 分钟，1 2 ， 0 0 0 xg ，4 。c 下离心5 分钟。 4 8 2 7 弃上清，加入l m l7 0 ( 4 ) 乙醇振荡漂洗沉淀，1 2 ，0 0 0 g ， 4 c 下离心2 分钟。 4 8 2 8 弃上清，将管倒置放在滤纸上，室温下蒸发痕量乙醇1 0 一1 5 分钟。 4 8 2 9 加入5 0 1 x l t e ( p h 8 o ) ( 含无d n a 酶的r n a 酶2 0 i t t g m 1 ) ，溶解 d n a ，短暂振荡5 分钟后可进行酶切实验或一2 0 贮存。 4 9 酶切鉴定： 4 9 1 按以下条件配制双酶切体系： 限制酶x b a i1 山 限制酶e c o r il 山 1 0 x m 缓冲液2 山 提取的重组质粒1 0 m 灭菌水6 1 d 配制成2 0 p 1 反应体系，3 7 。c ，酶切4 小时。 4 9 2 取5 u l 酶切溶液进行电泳鉴定，拍照并打印。 4 1 0 测序鉴定： 重组质粒送宝生物工程( 大连) 有限公司检测目的基因碱基序列组成。 结果 1r t - p c r 扩增目的基因的c d n a 利用合成引物，以人肝脏提取的总r n a 为模板，经r t p c r 反应并 纯化后，获得a d h 片断，取5 mr t p c r 产物电泳，其大小约为1 2 k b ， 与预期值相符，未发现非特异条带( 见图1 ) 。 图1i 型a d h 基因r b p c r 产物的电泳结果 1 i 型a d h 基因r t - p c r 产物 2 o x l 7 4 - h a e d i g e s td n a m a r k e r f i g 1 e l e e t r o p h o r e s i sm a p p i n go f t h ec l a s sia d hg e n eb yr t - p c r 1 r t - p c r p r o d u c to f t h e c l a s sia d h g e n e 2 x 1 7 4 一h a ei i id i g e s td n a m a r k e r 2 i 型a d h c d n a 的克隆及酶切鉴定 挑选单个白色菌落经扩大培养后，提取质粒，用x b ai 和e c o ri 双酶 切所得的片段，凝胶电泳结果显示和r t - p c r 产物大小一致( 见图2 ) 。 图2x b ai 和e e o ri 双酶切重组质粒p u c l 9 - a d h 鉴定 1 x b a i 和e e o r i 双酶切p u c l 9 质粒 2 x b ai 和e e o ri 双酶切重组质粒p u c l 9 - a d h