（生物化学与分子生物学专业论文）用于制备糖芯片新方法的研究.pdf

用于制备糖芯片新方法的研究1摘要研究背景近十年来，人们已经认识到细胞表面糖链与蛋白质的相互作用促进了细胞与细胞问的黏附，参与了脊椎动物胚胎发育。这种与糖链相互作用的蛋白被称为糖结合蛋白( 酉y c 锄- b i n d i n gp r o t e i l l ，g b p ) 。g b p 通过和糖蛋白糖链或糖脂糖链的相互作用调控细胞识别、信号传递、细胞内吞以及细胞生长、分化和凋亡等生物学行为。肿瘤发生时，蛋白质和脂分子糖基化的异常导致糖链发生了结构和数量的改变，相应地和这些糖链相互作用的g b p 的表达也发生异常改变。g b p 在生物学进程中扮演着十分重要的角色。但是目前仍然缺乏简便并能够用于糖链与蛋白质之间相互识别、相互作用的高通量研究方法。特别是缺乏类似于d n a 芯片和蛋白质芯片的研究工具，如与此相类似的糖芯片的研究，目前国际上仍处于探索阶段。糖芯片技术平台的建立将为高通量研究蛋白质与糖链作用的关系提供有效的工具。研究目的研究制备糖芯片的新技术；建立糖芯片应用平台体系，应用于糖链与蛋白质之间相互识别、相互作用的研究。实验方法采用了两种方法来制备羟基衍生化的玻片，通过糖链还原末端的半缩醛基与玻片表面的羟基形成糖苷键使糖链共价固定在玻片的表面：首先，玻片分别被环氧化和氨基化，然后用不同的表面化学修饰方法使玻片表面羟基化。利用羟基衍生化的玻片制备出糖芯片。研究结果开发出了一种新的便捷有效的方法来制备糖芯片，即利用了糖链的还原末端，以糖苷键的形式共价偶联其到羟基( o h ) 衍生化的玻片上，较好模拟了糖链在细胞表面的天然存在状态，生物活性稳定。这种制备糖芯片的新技术固定糖链的共价连接方式简单、快速、成本较低、实用。1 本课题受国家重点基础研究发展计划( 9 7 3 计划，课题编号n o 2 0 0 4 c b 5 2 0 8 0 2 ) 及国家高技术研究发展计划( 8 6 3 计划，课题编号b b 2 0 0 7 a a a 0 2 2 4 1 3 ) 资助。1 利用羟基化的玻片表面制备出了糖芯片，荧光标记的凝集素可以与糖芯片上固定的糖链特异性地结合，用于检测糖链在玻片上的固定效果。通过实验确定了4 羟基丁酸肼作为偶联剂修饰环氧化玻片，使玻片表面羟基化。优化了糖芯片技术平台的体系，确定了最佳的实验条件：a 最佳点样液是醋酸钠缓冲液。b 最佳封闭剂是3 t 0 pb l o c k 。c 最佳孵育液是中性或者弱碱性的磷酸盐缓冲液。d 最佳孵育时间为一个小时，最佳孵育温度为4 。e 最佳点样浓度为1m m o l i 。f 糖芯片储存条件为4 。2 应用所建立的糖芯片技术平台体系研究了肝脏相关糖结合蛋白，通过实验研究肝脏相关糖结合蛋白在不同的发育阶段以及不同样本中的分布差异以及丰度差异，为进一步研究肝脏中糖结合蛋白奠定了基础。3 应用所建立的糖芯片技术平台体系对健康人血清进行了抗糖抗体谱的初步研究，通过实验可知1 9 种糖链在人血清中存在与其相识别的抗糖抗体，只是丰度存在差异。为进一步发展基于糖芯片技术的疾病诊断新方法奠定了基础。关键词：糖芯片糖结合蛋白糖苷键羟基化修饰玻片表面缩略语英文简写英文全称中文全称a p t s3 - a m i n o p r o p y l t r i e t h o x y s i l 趾e3 氨丙基三乙氧基硅烷b s ab o v i n es e n l ma l b u m i n牛血清白蛋白c c dc h a r g ec o u p l e dd e v i c c电荷藕合器件图像传感器c o n ac 0 n c a n a v a l i i l a刀豆蛋白ac yc y a n i n e花菁色素染料d c cn ，n d i c y c l o h e x y l c a r b o d i i m i d e二环已基碳二亚胺d m fn ，n - d i m e t y l f o n n a m i d e二甲基甲酰胺d m s od i l i l e t h y l s u l f o x i d e二甲基亚砜e s i m se l e c t r o s p r a yi o n i z a t i o n m 弱s电喷雾电离质谱s p e c t r o m e t 巧g b pg l y c a n b i n d i n gp r o t e i n糖结合蛋白g cg a sc l 啪m a t o 黟a p h y气相色谱g p t s3 - 百y c i d y l o x y p r o p y l t r i m e t h o x y s i l 锄e3 缩水甘油环氧丙s i l a n e基三甲氧基硅烷h bh e m o 百o b i n血红蛋白m a id i t o fm a t l i 】【a s s i s t e dl a s e r基质辅助激光解吸d e s o 叩t i o l l i o n i z a t i o nt i m e - o f - n i g h t电离质谱m a s ss p e c c r o m e t r ym h cm a j o rh i s t o c o m p a t i b i l i t yc o m p l e x主要组织复合物m sm a s ss p e c t r o m e t r y质谱n h sn - h y d r o x y s u c c i n i m i d en 羟基琥珀酰亚胺p m tp h o t o m u l t i p l i e rt u b e光电倍增管w h ow b d dh e a l t ho 玛a n i z a t i o n世界卫生组织西北大学学位论文知识产权声明书本人完全了解西北大学关于收集、保存、使用学位论文的规定。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版。本人允许论文被查阅和借阅。本人授权西北大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所等机构将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库或其它相关数据库。保密论文待解密后适用本声明。学位论文作者签名：角幽指导教师签名：奎童茔6 髟年月f 乞日6 矿年石月f 湄西北大学学位论文独创性声明本人声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，本论文不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得西北大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：角功d 舻年占月i2 ，日刖罱1 本课题的研究目的糖生物学研究糖缀合物糖链的结构、生物合成和生物学功能的一门学科。其研究领域包括糖化学、糖链生物合成、糖链在复杂生物系统中的功能和糖链操作技术。糖生物学( 酉y c o b i o l o g y ) 这一名词是在1 9 8 8 年牛津大学d w e k 教授在当年的生化年评中撰写了以“糖生物学”为题的综述中提出的，这标志着糖生物学这一新的分支学科的诞生。糖生物学这门学科领域一经提出，便得到了科学界的广泛认同，并在西方发达国家受到高度重视。近1 0 年来，随着分析技术的进步和分子生物学的发展，糖的研究也取得了巨大进展，糖生物学研究正成为生命科学研究中又一新的前沿和热点。近十年来，人们已经认识到细胞表面糖链与蛋白质的相互作用促进了细胞与细胞间的黏附、参与了脊椎动物胚胎发育。这种与糖链相互作用的蛋白被称为g b p ( 百y c 锄- b i n d i n gp r o t e i i l ，g b p ) 。g b p 通过和糖蛋白糖链或糖脂糖链的相互作用调控细胞识别、信号传递、细胞内吞以及细胞生长、分化和凋亡等正常生物学行为【1 】。肿瘤发生时，一方面蛋白质和脂分子糖基化的异常而导致糖蛋白和糖脂中的糖链发生了结构和数量的改变，另一方面和这些糖链相互作用的g b p 的表达也发生改变。因此，开展肿瘤相关g b p 的研究对于阐明肿瘤发生和发展的分子机制，寻找和发现新的肿瘤标志物和靶点，对于肿瘤的诊断和治疗都具有非常重要的意义【2 川。原发性肝癌是全球常见和严重威胁人类生命的疾病。据最新w h o 报道，全球每年发病人数约为1 0 0 万，其中中国每年发病人数为3 4 6 万。目前我国肝癌死亡率在癌症死亡率中已升为第二位，每年约有3 2 2 万人死于肝癌。因此，寻找和发现新的肝癌标志物和靶点用于肝癌早期诊断和治疗显得尤为重要。近年来，肝癌组织中的一些糖蛋白已被提纯，通过研究其糖链结构并与正常肝细胞的同一糖蛋白相比，发现n 糖链的结构发生变化，如糖链分支数增加、n - 乙酰氨基乳糖重复顺序出现或增加、核心岩藻糖( f u c ) 增多和高甘露糖型增加等【3 6 。但是与这些糖链相互作用的g b p 的表达是如何发生变化的，则知道的较少。目前对多数肿瘤发生和发展过程中相关g b p 还了解不多，如美国功能糖组学协会的g b p 数据库中也只公布了不到2 5 0 个g b p 【羽。其主要原因之一是现有的常规研究g b p 与糖相互作用的技术和方法【9 - 1 1 】( 如荧光偏振法、气质联用仪( g c m s ) 、基质辅助激光解吸电离质谱( m a i ，d i 1 o f ) 和电喷雾电离质谱( e s l m s )等缺乏系统化、规模化的研究能力，无法对蛋白质与糖链之间相互识别、相互作用进行系统地研究。针对目前缺乏高通量研究g b p 的技术的情况。本项目将研究和开发一种新的含有多种单糖、双糖、三糖、寡糖的糖芯片技术和相应的应用技术平台体系。此平台体系可高通量、系统、灵敏地检测糖链与g b p 的相互作用。2 本课题的主要研究内容g b p 具有重要的生物学功能，包括细胞间通讯和识别，细胞与病原微生物的相互作用，细胞内蛋白的运输，蛋白间的相互作用，蛋白与受体的特异性结合等。随着基因组学和蛋白质组学的研究发展，人们已逐渐认识到g b p 的重要性。但目前对于g b p 的研究相对滞后。主要原因是缺乏高通量的技术和手段，特别是缺乏类似于d n a 芯片和蛋白芯片的研究工具。众所周知，d n a 芯片技术建立，极大地推动了功能基因组学的进程。蛋白质芯片技术的逐步完善也将促进蛋白质组学的发展。而与此相类似的糖芯片的研究，目前国际上仍处于探索阶段，由于糖芯片是研究g b p 与其糖配体相互作用最有效的高通量技术。该平台的建立将为高通量研究蛋白质间相互作用的机理，蛋白质与糖链作用的关系提供有效的工具。在建立糖芯片技术平台的过程中，要对固定化方法、封闭缓冲液以及反应时间进行选择和优化。肝脏中有多少g b p ? 他们的特性和功能是什么? 为加速对这一问题的研究，本项目将利用建立起的糖芯片技术平台对肝脏的g b p 进行初步的筛检，为进一步研究肝脏中糖结合蛋白奠定了基础。3 本课题的研究意义首先，几乎所有的生物都是由细胞组成的，而细胞表面为各种形式的多糖所覆盖，这些多糖有助于人们确定细胞的类型和状态。大多数多糖只起保护作用，防止外部的物理应激( 如冷冻) 和生化攻击( 如蛋白酶降解) ，而有些多糖( 如血型抗原) 则是主要组织复合物( m h c ) 抗原，是鉴定细胞类型的重要标志，在细胞一细胞识别过程中( 如发育，分化，转化，免疫和炎症等) 起着重要的作2用。其次，糖基化与磷酸化一样，是见于所有真核细胞蛋白的一种共翻译修饰或翻译后修饰机制。根据s w i s s p r o t 蛋白质数据库的最新统计，大约有5 0 以上的已知蛋白质是糖基化蛋白。从结构上看，蛋白质磷酸化非常简单，只有一种结构形式( - o p 0 3 2 ) ：而糖基化则极其复杂。因而，正如上文提到的，研究多糖面临诸多技术难题，遗忘的大多数蛋白质组研究方法往往忽视了蛋白质糖基化问题。第三，研究多糖在医学上具有实际意义。细胞表面的多糖对于生物体是必须的，同时也被各种微生物用来侵入和感染其宿主细胞。实际上，大多数细菌毒素，包括霍乱毒素，白喉毒素，结核毒素和v e r 0 细胞毒素等，可划分为a b 毒素，由有毒性的的a 链与g b p ( 1 e c t i n ，凝集素) b 链所组成的。例如，流感病毒含有血凝素( 姒) 凝集素，用以吸附和进入宿主细胞。未来糖组学研究的重点是分析g b p 与寡糖相互作用。这就需要解决糖组学中的一些最基本问题，如何在多糖芯片和蛋白质( 凝集素) 芯片中精确地用糖组学方法鉴定“弱的”( 而非强的) 亲和力。这点非常重要，因为多数凝集素多糖的相互作用相对较弱，通常在2 0 2 5 条件下，k d 仅在1 0 4 1 0 6 之间；而抗原抗体相互作用k d 一般可达1 0 6 1 0 9 。如此微弱的相互作用无法用定量的方式进行测定，有时因为需要重复洗涤而不能检测到。因此需要更精确的分析方法来测定g b p 与寡糖的微弱相互作用，以便区分细胞表面多糖的细微差别，了解细胞细胞识别事件。在这种情况下，用糖芯片的方法来分析可以很好的解决这个问题。3子、染色体蛋白，而且这种糖基化是可逆的动态调节，可以和磷酸化发生置换，这提示o g l c 址糖基化具有和蛋白质磷酸化相似的生物学意义。在会上，还出现了“免疫糖生物学”、“神经糖生物学”和“植物糖生物学”等新的分支学科、新的前沿领域。1 9 9 8 年5 月于德国召开“国际糖生物工程讨论会”，这次讨论会下设糖生物学、糖化学和糖生物工程3 个分支，一些发展中国家也对糖生物学给予一定的重视，并竞相主办国际性会议。1 9 9 7 年在爱尔兰的g a l w a y 曾召开过皇家化学学会糖类春季讨论会，并在1 9 9 9 年召开第1 0 届欧洲糖讨论会；1 9 9 7年在波兰华沙召开了鞘糖脂和鞘氨醇的结构、代谢和功能的国际讨论会；1 9 9 9年1 月印度在b 趾g a l o r e 主办第5 届国际真核细胞表面生物大分子生物功能讨论会。1 3 糖生物学研究的特点糖链与蛋白质和核酸在结构和功能方面有很多不同之处，如糖链的结构远比核酸和蛋白质要复杂，比如由3 个核苷酸碱基或3 个氨基酸组成的直链分子有6 种可能的序列，而由3 个己糖所构成的三聚糖，其可能的序列则可达1 0 5 6 2 7 6 4 8 种；且糖链的合成并不是有模板的复制，而是通过糖基转移酶和糖苷酶在内质网和高尔基体内合成的，除受酶基因表达的调控外，还受酶活性的影响，即便在同种分子的同一糖基化位点上，糖链的结构也有差异，有微不均一性，因此，很难得到结构均一的糖链，糖链结构测定和化学合成也远比核酸和蛋白质要困难，这就极大地限制了对其功能研究。糖链功能和调控的复杂性也制约了研究的速度，糖链功能的复杂性表现为：很难预知某一特定糖链的功能和对生物体的重要性；同一糖链在生物体的不同部位和不同的个体发育阶段功能不同；较为专一的生物作用通常是通过不寻常的糖链序列或常见糖链的不寻常表达或修饰来介导，而这些特殊的糖链也常常是毒素和病原体的识别目标。因此，对糖链的生物学作用只能逐个的分别研究。糖链调控的复杂性则表现为调控的细胞、组织特异性和发育阶段性；一种糖基转移酶只能合成一种糖苷键，同一糖苷键则可由不同的糖基转移酶合成【1 7 1 。1 4 西方各国对糖生物学研究的重视糖链自身具有上述这些特点，使得糖生物学研究的进度受到影响，但是世界各国对糖生物学研究都给予高度重视，几个主要西方国家在这一研究领域投6入了大量的人力和物力，并取得了相应的成绩。1 5 英国在糖生物学领域开展的工作英国牛津大学的生化系是世界上最大的生化系之一，拥有目前最先进的糖链结构测定的设备。分布于整幢大楼的十余台高分辨率核磁共振仪，数台试剂( 以外切糖苷酶为主、) 阵列分析法测定糖链结构的糖顺序仪以及快速原子轰击电离质谱和基质辅助的激光解吸电离飞行时间质谱等，再配合高分辨率x 线衍射，可在一周内测出糖链的全部结构甚至立体构象。1 9 8 8 年，牛津大学研制成功了n 二糖链的结构分析仪，且已商品化，牛津大学出版社则于1 9 9 1 年创刊了“g l y c o b i o l o g y ”专业杂志，1 9 9 2 年将生化系的g l y c o b i o l o g yu n i t 改称为糖生物学研究所。牛津大学借助于先进的仪器设备和雄厚的技术力量，在糖生物学领域作出了举世瞩目的工作，特别是在免疫糖生物学和病毒糖生物学领域的研究成果处于国际领先地位【1 8 】。1 6 日本在糖生物学领域开展的工作日本政府和学术界认为，他们在蛋白质和核酸等领域已落后于欧美发达国家，因而对糖类研究给予相当的重视，希望能在糖类这一学科上和欧美一争高下。在1 9 8 8 年日本就建立了一个论坛：“糖类正在来临的时代”，并创刊了糖科学和糖工程学动态杂志。此后还出版了很多专著和专辑。1 9 9 8 年1 2 月日文期刊蛋白质核酸酵素又出版了一期糖生物学专辑。在这一专辑中共刊登了5 3 篇文章，除了作为附录的最后一篇文章是介绍各种类型的糖链结构外，其它的文章被分为5 个专题：糖链信号的产生、糖链信号的破译、生物活性糖链和邻近方式的信号转导、参与分化和疾病发生的糖链识别及糖工程学和糖生物学的前沿和应用1 1 9 1 。日本政府对糖生物学的研究给予了大力支持，1 9 8 9 年日本政府科学技术厅提出关于“糖工程基础与应用研究推进战略”的咨询，经过专家评议提出了详尽的推进战略方案，并于1 9 9 1 年由科技厅、厚生省、农林水产省、通商产业省等联合实施“糖工程前沿计划”，这是投资数百亿日元的1 5年计划，包括糖工程和糖生物学( 分为“糖分子生物学”和“糖细胞生物学) 。同时，成立了“糖工程研究协议会”作为协调机构，主席为a k o b a t a ，该协议会编辑出版了糖工程学专著，由于日本对该领域的重视，已取得大量研究成果，走在该领域研究的国际前列。日本经济产业省又决定从2 0 0 1 年4 月起启动一7项人体细胞糖链的研究，寻找合成糖链的酶基因，然后解析糖链的功能，计划4 年完成，仅糖基转移酶的克隆就投资8 0 亿日元。1 7 美国在糖生物学领域开展的工作美国能源部资助佐治亚大学于1 9 8 6 年创建复合糖研究中心和复合糖结构数据库，其计算机计划称c a r b b a l l l 【p f o j e c t ，1 9 9 0 年底仅有糖结构数据6 1 03个，到1 9 9 6 年该数据库已有记录4 2 1 0 4 多个，目前该数据库已移至g l v c o m i n d s( w 吼g 1 y c o m i n d s n e t ) 。在线虫基因组研究完成后，作为基因组和蛋白质组研究的延伸，美国新罕布什大学化学系的结构生物学研究中心启动了一项“线虫糖组学研究”计划，分析测定线虫的糖组( g l y c o m e ) ( 定义为细胞内所有的糖链组分) 、开展糖组学( g l y c o m i c s ) 研究( 即研究糖链的表达和调控) ，目的在于确定基因所携带的遗传信息与其功能之间的关系。美国s 嘶p p s 研究所的p a u i s o n 和u s c d 的v a r k i 等几位著名糖生物学家组织了一个“功能糖组学”研究项目，向美国n i h n i g m 申请基金，于2 0 0 1 年9 月正式启动，参与该计划的4 1 位科学家来自美国、英国、德国、法国、加拿大、丹麦、瑞典和俄罗斯的2 7 个研究机构，是一个多学科、多机构的国际性计划，项目的总体目标是阐明由蛋白质糖链相互作用所介导的细胞通讯机制。其它包括印度、台湾等国家和地区也都有相应的计划。1 8 欧洲在糖生物学领域开展的工作欧洲也不甘落后，为协调欧洲的糖研究与开发，强化欧洲在糖的研究成果转化为商品方面与美日竞争的能力，1 9 9 3 年1 1 月欧盟成立了欧洲糖工作小组，其任务是起草“欧洲糖研究开发平台”的报告，该报告起草过程中广泛征询了欧洲从事糖研究与生产的研究机构和公司的意见，并于1 9 9 4 年6 月提交欧盟负责科技的第十二司d g x i i ；欧盟遂在其1 9 9 4 1 9 9 8 年的研究计划中启动了“欧洲糖研究开发平台”，由欧盟和企业投资，其二级平台有：天然多糖、有机原材料糖、分子识别过程中的糖缀合物、动物来源的糖聚合物、微生物来源的糖聚合物及糖和食品，平台的职能是：通讯、信息共享、协调及知识管理，该计划得到了欧洲研究机构和企业的大力支持。1 9 糖生物学研究的动向糖类研究已经渗透到生命科学的许多领域。在过去的数年中，各国科学家们81 1 2 3 糖链代谢疾病许多细胞生理功能所必需的蛋白质是糖基化修饰的，糖基化的不同又常导致蛋白功能的改变。许多疾病就与细胞表面糖基化的改变有关，如由糖基化先天缺损( c d g ) 所引起的临床综合症最初于1 9 8 0 年发现。目前已发现至少8 种不同的c d g ，被归纳为c d g i 和c d g i i 。c d g i 是n 糖链合成缺陷，c d g i i 是n 糖链加工缺陷，这些疾病引起多系统异常，中枢神经异常是主要症状。最近又发现3 例病人是g d p f u c 转运缺陷，这些病人缺少中性粒细胞s k x ，口服岩藻糖( f u c ) 治疗可改善其反复感染【勰捌。1 1 2 4 在中医药领域对多糖的研究中医药是中华民族优秀的文化瑰宝，为世界医药和人类健康做出了巨大贡献。多糖是中医药发挥独特疗效的重要物质基础，近年来提取出多种中药多糖，如：茯苓、云芝、灵芝和香菇多糖等，它们具有多方面的生物活性，药理作用甚广，从免疫药理的角度看，是一类非特异性的免疫增强剂，已用于临床【刈。目前，我国多糖研究在中药领域中的应用主要集中在以下几个方面：( 1 ) 多糖的一般化学分离和提取鉴定。现已完成了大量的基础性工作；( 2 ) 地道药材采集方面的应用。从多糖含量的变化来确定采收的最佳时间和部位，如根据商陆多糖含量变化选最佳采收期，以确保地道药材的质量【3 1 】。( 3 ) 中药多糖免疫药理学研究的开展；( 4 ) 中药多糖的临床应用。中药多糖在肿瘤与慢性肝炎的治疗方面的应用有着喜人的前景。随着对中药多糖结构和功能研究的深入，中药多糖类药物在临床上新的用途将得到充分地挖掘。在国外，尤其是在日本，历来重视中药研究，特别对中药多糖研究已经成为热点。日本学者采用先进手段对中药多糖化学结构中的活性决定簇进行研究【3 2 1 ，且在中药多糖高专属性的质量控制方法研究上获得突破【矧。美国在抗炎药物的开发研究中做的工作较多，如美国g l v c o m e d 公司，其研究人员对s k x糖链构象进行计算机模拟，然后根据模拟构象从化学合成和天然来源的化合物中筛选到几种s k x 糖链类似物，发现其中效果最好的是甘草素( 百y c y l l f h i z i n )可用于封闭血管内皮细胞表面呲择素，从而能抗判3 4 1 。甘草素来源于中药甘草，尽管中国人早就知道甘草有抗炎效果，但并不清楚其治疗机理，这一发现揭示了甘草抗炎的机制。影响人类健康的主要疾病均与糖缀合物糖链的合成与代谢相关，然而我们对疾病和发育过程中糖缀合物结构与功能关系的理解还非常有限。线虫和果蝇研1 1究的进展为我们了解发育过程中糖缀合物的功能提供了模式生物，另外蛋白质组学、基因组学和糖组学的现代研究方法研究糖基化与疾病的关系也将极大地推动糖生物学研究。1 1 3 糖生物学研究的动向目前糖生物学研究中要解决的关键技术问题是糖链结构分析和合成方法的建立。在糖链的分析上需要建立高分辨率、快速的序列测定和构象研究方法及模型；在合成上需要建立高效的方法。但糖链的结构分析和合成很难像核酸和蛋白质那样完全靠化学方法解决，因此化学方法和酶反应相结合是发展趋势；在功能研究方面，主要还是研究糖链合成与代谢途径和糖链在细胞内、细胞间的功能，其前沿领域为糖基化、蛋白质与糖链的相互作用及糖在微生物感染中的作用三个领域。为此，各国科学家都在致力于糖链结构分析和合成方法学上的突破，为糖链的功能分析提供技术支持，同时糖链的功能研究又集中在细胞水平上糖链的调控和识别机制的研究。著名生物学家铷i t 删指出：“在即将到来的后基因组学时代中，当人们来越多地将注意力集中到完整器官或生物体的发育和生理学的分子机制时，糖链生物学功能将会更加显而易见。糖链的生物学功能是通过糖链对蛋白质功能的修饰、糖缀合物糖链与蛋白质的识别来实现的。可以预见，随着糖链在生命活动中的功能和调控机制研究的深入，必将极大地促进功能基因组学和蛋白组学的研究。因此，糖生物学是全面揭示生命本质所不可缺少的分支，是2 1世纪生命科学研究的重要组成部分。2 生物芯片技术研究状况及其发展前景生物芯片是指通过微加工和微电子技术在固相基质表面构建微型生物化学分析系统，以实现对细胞、蛋白质、核酸以及其他生物分子等进行准确、快速、高通量检测1 3 5 1 。生物芯片的本质特征是利用微电子、微机械、化学、物理以及计算机技术，将生命科学研究中的样品检测、分析过程实现连续化、集成化、微型化。芯片上集成了成千上密集排列的分子微阵列或分析元件，能够在短时间内分析大量的生物分子，快速准确地获取样品中的生物信息，检测效率是传统检测手段的成百上千倍。生物芯片技术被认为是继2 0 世纪大规模集成电路之后的又一次具有深远意义的科学技术革命。按芯片固定的生物分子可以将生物芯片划分为基因芯片、蛋白芯片及芯片实验室。基因芯片，又称d n a 芯片，是在尼龙膜或玻片等固相支持物表面上，有规律地合成大量寡核苷酸片段或基因片段作为探针，或预先合成后由机械手点样于固相支持物表面构成微阵列，然后与标记的样品d n a 按碱基配对的原则进行杂交，通过放射自显影或激光共聚焦荧光检测系统对芯片进行扫描后，并配以计算机对杂交结果进行软件处理分析，获得杂交信号的强度及分布模式图，以此反映样品靶分子的数量及基因表达强弱的信息，达到疾病诊断、药物筛选、基因功能研究等目的。蛋白芯片0 f o t e i i lc h i p ) 是按预先设计的方式将抗原或抗体固定在玻片上，形成蛋白质的微阵列，即蛋白质芯片，带有特殊标记的蛋白质分子( 抗体或抗原)与之特异性结合，通过对标记物的检测来实现抗原抗体的互检。该技术所需蛋白质的量极少，反应相对较快，稳定性较好，灵敏度较高，在临床检测方面大有发展。芯片实验室( 1 a b 0 n c h i p ) 是一种更加复杂的芯片技术，在微小的硅材料表面，制造出能对微量样品进行变性、分离、纯化、电泳、p c r 扩增、加样、检测等微小结构，使过去一个实验的各个实验步骤，微缩于一个芯片上。由于技术的复杂目前制作生物芯片的方法主要有原位合成点阵法( i j p s h y z er ) 、合成后微量点样( c h e u n gv g ) 和电定位法。原位合成点阵法是由卿e t r i x 公司开发的基于微电子器件制作常用的光刻掩膜法在硅片上进行合成的技术。合成前需先对芯片表面进行处理，使之衍生出羟基或氨基并与光敏保护基共价连接，合成单体的一端用固相合成法活化，另一端与光敏保护基相连。在合成反应过程中，通过蔽光膜使特定的位点透光，其余位点不透光，只有受光的位点才能脱保护并与特定单体活化端相连，单体的光敏保护端露出，经过若干上述循环反应后，使每个位点按需要合成特定序列的探针【螂7 】。合成后微量点样芯片是将合成好的探针通过机械手直接打印或喷印于芯片上。采用打印法可使探针密度高，但定量准确性及重现性不够，打印针易堵塞且使用寿命有限。喷印法【3 8 】定量准确，重现性好，使用寿命长，但斑点大，探针密度低。电定位法是利用静电吸附的原理将d n a 快速定位在硅基质、导电玻璃上，其优点是在电力推动下可使杂交快速进行，但制作工艺复杂，点样密度低。生物芯片结果的分析和判定一般利用荧光扫描仪或激光共聚焦扫描技术进行扫描、图象分析、数据处理及检测结果判定【3 9 】，这一过程是生物芯片在应用时十分重要的一个环节。荧光标记是芯片信息采集中使用最多也是最成功的标志。杂交反应后的芯片上各个反应点的荧光位置、荧光强弱经过专门的荧光芯片扫描仪和相关软件可以进行分析，将荧光信号转换成数据，即可以获得有关生物信息。如果用同位素3 2 p 、3 3 p 作标记，其信号的检测可以通过压x 光片或直接用磷屏成像系统来完成。为了使结果的检验更加简便和快速，生物芯片的分析系统中可采用基因阵列扫描仪和专用的基因芯片工作站，对一幅包含数万个探针位点的基因芯片图样的分析仅需数分钟的时间。国家科技部起草的医药生物技术“十五”及2 0 1 5 年规划所列的1 5 个关键技术项目中，就有8 个项目( 基因组学技术、重大疾病相关基因的分离和功能研究、基因药物工程、基因治疗技术、生物信息学技术、组合生物合成技术、新型诊断技术、蛋白质组学和生物芯片技术) 要使用生物芯片，其中，生物芯片被单列为一个专门项目进行规划。2 0 0 2 年8 月国家科技部在8 6 3 高技术项目中正式启动了功能基因组和生物芯片重大专项。生物芯片技术在以往相关学科发展的基础上，将生命科学计算机技术激光共聚焦技术以及生物信息学等多学科综合为一体，形成了一门新兴学科生物芯片技术，为后基因组时代的研究提供了强有力的工具。随着研究的不断深入和技术的更加完善，基因芯片一定会在生命科学研究领域发挥出其非凡的作用。生物芯片最终的意义和目的不在于本身，而在于它极大地提高了人类认识生命本质的能力和手段，为揭示人类这个复杂网络系统打下基础。从某种意义上我们可以这样认为：基因的结构或种类决定物种；基因的功能或表达则决定生命，即生物的生、老、病、死。随着不同生物的探针库构建、微阵列制造、图象采集及资料分析等方面芯片网的建立，遗传病、传染病和肿瘤相关的芯片的应用，必将改变人类疾病的诊断和群体中发病风险。d n a 芯片技术发展的历史并不长，由于其花费较大、假阳性率偏高、样品制备和标记较复杂、所用仪器昂贵等因素，限制了它在研究和诊断中的应用，但1 4它的实际价值毋庸置疑。提高d n a 芯片的特异性，简化样品制磊嘤惶馐妻一前巍割；鏊薹囊璨皓。陶灞两谪糯囊刻刑削到墅蘸坛羹趔羹喾念些毯i潦前藤遴瑶售蘧俪犀砀澹省蓁生蓦刚副亭翼i 薪；剩豁羹鬟霉侣翼霎辔二托蓁錾藩弑茧苕官矧矧训磷嚆蓿。丁_ 戡甜亭蔚臻糯缀合物糖锯夭雾；奏剂越甏葡翮啦鳓嗣鳓傩魏季过糖基化影响蛋白质功能，更重要的是还与细胞通讯、信号传递密切相关。糖链的合成是由基因编码的酶催化的，据估计哺乳动物细胞基因组中约有0 5 1 o 的基因参与糖链的合成与代谢，同参与蛋白磷酸化的基因数量相当。而这些基因如何调控糖链的合成以及基因所编码的生命信息如何通过糖链来体现还是一个有待探索的命题。基因对细胞生命活动的调控是由基因所编码的蛋白质及其所合成的脂类和糖链来体现的，因此基因功能的阐明不仅需要进行功能基因组学研究，而且还必须开展功能蛋白质组学和功能糖组学研究。1 1 l 糖生物学在酶学领域的研究糖生物学与酶学的关系极为密切，研究表明：一方面，糖是酶作用不可缺少的成分【2 2 1 。另一方面，酶是进行糖生物学研究不可缺少的工具。糖生物学和糖工程中所有重大课题都离不开糖链的生物合成，而糖链的生物合成必须有糖基转移酶的参与。前面已提到糖链的合成受到酶基因表达的调控。因此，有关糖基转移酶的研究倍受人们的重视，成为酶工程领域的又一个热点课题【2 3 1 。目前发现的糖基转移酶有1 0 0 多种。有关糖基转移酶的分布和定位、分子结构和家族、分子克隆和表达、酶的调控和缺失等方面的研究，已经取得很多引人注目的成果。1 1 2都离不开糖链的生物合成，而糖链的生物合成必须有糖基转移酶的参与。前面已提到糖链的合成受到酶基因表达的调控。因此，有关糖基转移酶的研究倍受人们的重视，成为酶工程领域的又一个热点课题【231。目前发现的糖基转移酶有100多种。有关糖基转移酶的分布和定位、分子结构和家族、分子克隆和表达、酶的调控和缺失等方面的研究，已经取得很多引人注目的成果。1 1 2 糖生物学在医学领域的研究酰亚胺酯基团的亲水聚合体。由于玻璃片表面具有胺基活性，所以可共价连接硫酸化肝磷脂寡糖。2 0 0 6 年出现了一种制备糖芯片的新方法【6 2 】，此方法是鲤蛳；冀拶篓吐覆露蔺彗断。茎。妻囊翠移拍牖蠹| | | 雾擢经i 志型盂裂銎螽罐蹬濑缉晚；籍采! 萋塾悬谤；鎏：塑猫缫鞠伪麓啃群籀湔籀硝薹酗到粥娄”囊蔼蔫莲崔嘤忽翟嚣；喹曩霎疆恻螋甄埔霎綦评磁疗离残苠墼法。但糖链的结构分析和合成很难像核酸和蛋白质那样完全靠化学方法解决，因此化学方法和酶反应相结合是发展趋势；在功能研究方面，主要还是研究糖链合成与代谢途径和糖链在细胞内、细胞间的功能，其前沿领域为糖基化、蛋白质与糖链的相互作用及糖在微生物感染中的作用三个领域。为此，各国科学家都在致力于糖链结构分析和合成方法学上的突破，为糖链的功能分析提供技术支持，同时糖链的功能研究又集中在细胞水平上糖链的调控和识别机制的研究。著名生物学家铷i t 删指出：“在即将到来的后基因组学时代中，当人们来越多地将注意力集中到完整器官或生物体的发育和生理学的分子机制时，糖链生物学功能将会更加显而易见。糖链的生物学功能是通过糖链对蛋白质功能的修饰、糖缀合物糖链与蛋白质的识别来实现的。可以预见，随着糖链在生命活动中的功能和调控机制研究的深入，必将极大地促进功能基因组学和蛋白组学的研究。因此，糖生物学是全面揭示生命本质所不可缺少的分支，是2 1世纪生命科学研究的重要组成部分。2 生物芯片技术研究状况及其发展前景生物芯片是指通过微加工和微电子技术在固相基质表面构建微型生物化学分析系统，以实现对细胞、蛋白质、核酸以及其他生物分子等进行准确、快速、高通量检测1 3 5 1 。生物芯片的本质特征是利用微电子、微机械、化学、物理以及计算机技术，将生命科学研究中的样品检测、分析过程实现连续化、集成化、微型化。芯片上集成了成千上密集排列的分子微阵列或分析元件，能够在短时间内分析大量的生物分子，快速准确地获取样品中的生物信息，检测效率是传统检测手段的成百上千倍。生物芯片技术被认为是继2 0 世纪大规模集成电路之后的又一次具有深远意义的科学技x结构的糖分子提供了新的方法【吲，因而可为糖芯片提供更多种类的探针分子。另外，糖蛋白质数据库及蛋白质数据库等的建立与完善为糖芯片的高通量分析提供强有力的支持【明。糖芯片分析自动化、表面等离子体共振光谱( s p r ) 分析f 鲫、芯片与质谱或其他分析手段联用等能使糖芯片分析更准确、更快速。相信随着糖化学研究的深入，糖芯片必定会大大促进糖生物学及糖组学的研究。另外，糖类在生物发育，肿瘤发生，细胞黏附和免疫识别中发挥重要作用，并且日益成为某些治疗方法的重要靶标。已经发现，复合糖( 糖肽，糖脂，粘多糖和蛋白多糖) 与炎症，细胞细胞相互作用，信号传导，繁殖和发育有关。用免疫系统的g b p ( 抗体，选择素，细胞因子，趋化因子) 以及一些植物血凝素进行的验证性试验表明，糖( 单糖，寡糖和复合糖) 微阵列可大大促进具有糖结合活性的蛋白质鉴定，同时也有助于阐明其配体。开发糖微阵列对于高通量分析多糖及其他生物分子的相互作用是十分重要。寡糖和复合糖微阵列技术将大大革新蛋白质的糖结合活性研究。多糖和糖蛋白质微阵列在血清学研究以及筛选和检测抗体和g b p 中也有用武之地。序列和空间位置明确的寡糖微阵列对于确定g b p 的表位和配体也十分常有用的。总之，糖微阵列可望在探索与糖蛋白质相互作用有关的生物学途径的新线索，及发现新的治疗靶标等生物医学研究领域取得重要成果。1 9第二部分研究内容第一章羟基化糖生物芯片基本技术平台的建立1 糖芯片作用原理许多细胞细胞间的作用与细胞表面糖缀合物的多个作用点之间化学键的同时作用有关，从而使得作用力与单个化学键相比对糖分子结构的特异性提出更高要求【4 1 1 。然而，由于生物分子结构的复杂性使得许多糖蛋白质分子特异作用的机制并不清楚。随着d n a 芯片和蛋白质芯片在生物和医学研究领域中广泛应用，高通量、微样品的芯片分析方法得到更深入的扩展。基于糖蛋白特异作用而制备的糖芯片开始引起人们研究的兴趣。糖芯片是将多个不同结构的糖分子通过共价或非共价作用固定于经化学修饰的基质上，进而对糖蛋白等待测样品或糖分子探针本身进行测试、分析的手段。与芯片上糖探针存在特异作用的样品分子会被吸附，其他无特异作用的分子则在清洗液的冲洗下被洗掉。通过荧光染色等检测方法可以简单、快速地筛选出存在特异作用的分子，从而在分析糖蛋白结构和作用等方面起到重要作用。1 1 载体的选择1 1 1 载体选择要求用于连接、吸附或包埋各种生物分子使其以水不溶状态行使功能的固相材料统称为载体。制作糖芯片的载体材料必须符合下列要求：载体表面必须有可以进行化学反应的活性基因，以便于g b p 分子进行偶联；使单位载体上结合的g b p 分子达到最佳容量；载体应当是惰性的并且有足够的稳定性，包括物理、化学和机械的稳定性。载体具有良好的生物兼容性。目前适合于作生物芯片载体的材料包括玻璃片、硅片、金片、聚丙烯酞胺凝胶膜、尼龙膜等。在选择固相介质时，应考虑其荧光背景的大小、化学稳定性、结构复杂性、介质对化学修饰作用的反应，介质表面积及其承载能力以及非特异吸附的程度等因素【5 7 1 。1 1 2 本实验的载体选择目前应用最多的固相载体是载玻片，载玻片作为一种最常见的糖芯片的基质材料，由于有吸附非特异性蛋白的性质，必须进行预处理和使用阻断剂来减少2 0背景信号。常用的方法包括醛基化、环氧基化、氨基化、羟基化等，也有在载玻片表面覆盖一层膜性物质以形成三维芯片( 如聚丙烯酰胺凝胶、硝酸纤维素、琼脂糖等) 。与其他方法相比，以载玻片为基质制备糖芯片有许多优点：来源方便，价格低廉；检测液体不会扩散到玻片内部；发生孵育反应后的清洗步骤简单快速；信号点更均一；和现有芯片检侧仪器及软件容易配套，有利于图像的采集和数据处理。本文就以载玻片为标准基底材料，研究了适合糖固定的衍生化芯片。为了制备出性能稳定和高质量的糖芯片，我们首先针对国内外不同品牌的载玻片进行了比较，并从中选择了g o l ds e a l t m 商业载玻片( 2 5 m mx7 5 m m ) 作为我们的常规芯片基质材料。每一张玻片在使用前必须经过外观检查：去除载玻片，在非阳光直射条件下进行目测观察。要求基片表面透明平整，无缺角、无明显划痕。经过质检的基片即可进入玻片清洗步骤。清洗处理的主要作用是除去玻片表面的污物，另外还能使玻片表面生成一层裸露的羟基层。载玻片的表面基团除了s i 0 2外，还含有一定的n a 2 0 和c a o 等碱金属氧化物，因此在清洗处理时除了可以使玻片表面的硅氧键( s i o ) 断裂生成硅羟基( s i o h ) 外，和可以使接近表面的碱性物质溶出，从而生成一个稳定均一的表面，这对于后续的化学修饰是很有帮助的。为了构建糖芯片，糖与玻片的共价联接的化学结构必须符合以下的标准：能够联接蛋白质分子的一个末端；该联接要足够长以避免载体和生物分子之间的空间位阻。玻片表面的修饰一般采用含有至少两个功能基团的有机分子，利用有机化合物与糖之间形成的共价键，将糖分子固定于玻片表面，加强样品和基底表面的吸附，使得被固定的糖分子不易从玻片表面脱落，并可能更适合于不同条件下的生物化学反应过程。本实验中两种方法来制备羟基衍生化玻片：g p t s 途径通过环氧化玻片来制备羟基化糖芯片硅烷偶联剂是一种常用的手臂分子。它的烷氧基可与载体表面的羟基反应，形成硅醇键，使硅烷分子有序地偶联在表面上。玻片的表面有丰富的羟基，故选用带环氧基的硅烷对玻片进行修饰，使玻片表面改性为富含环氧基的表面。然2 1乙酸乙酯中，配制成5 0 i i l l ，2 0 m m 的溶液，将氨基化修饰的玻片浸泡其中，孵化3 h ，温度为2 5 用无水乙醇洗两次，每次2 m i n ，离心5 m i n ，5 0 0 印m ，2 0 甩干，4 保存。2 2 2 糖的固定用设计好的点样缓冲液溶解甘露糖，浓度为o 1 m m 。点样缓冲液体系为醋酸盐缓冲液( 2 0 0 m mp h 5 5 ) ，用晶芯4 8 点样系统在玻片上点成6 6 的矩阵，室温湿度6 0 固定2 h ，温度6 0 固定1 h ，然后在干燥器中保存过夜。2 2 3 糖芯片的封闭3 t 0 p b l o c k 将点样后的玻片浸泡在其中，3 7 温育4 5 m i n ，1 p b s 洗玻片2 m i n ，再用超纯水洗2 m i n ，离心5 分钟，5 0 0 印m ，2 0 ，甩干，备用。2 2 4 糖结合蛋白( c o n a ) 的c i y 3 标记吸取1 m 咖lc o i a2 5 u l 至2 0 0 u lp h = 7 0 的磷酸盐溶液中，温和反应4 5 m i n ，4 终止反应1 0 m i n ，g 2 5 柱分离纯化：洗柱平衡一过样收集一检测。2 2 5 糖芯片的孵育c o i a2 0 u l 覆盖点样区，加盖玻片，4 孵育1 h ，l p b s 洗3 次，每次1 0 m i i l ，摇床1 1 0 r p m ，离心5 m i n ，5 0 0 印m ，2 0 ，甩干。2 2 6 数据的扫描与分析用g e n e p i 】【4 0 伽i a 芯片扫描仪扫描芯片，光电倍增管( p m t ) 设为7 0 ，先进行预扫描，然后选定结果好的区域，进行精确扫描，图像存为1 i f f 格式。用g e n e p i 】【3 o 软件从扫描结果图中获取荧光信号强度值和背景值等重要信息进行分析。3 结果与讨论两种芯片修饰途径的对比通过对结果数据的对比，发现g p 髑途径的修饰要比a p t s 途径的修饰结果好，如图4 示，并且发现在g p t s 途径的修饰中，用4 羟基丁酸肼修饰的结果比4 羟基苯甲酰胺修饰的结果稍好。8 0 0 07 0 0 06 0 0 0基5 0 0 0口s4 0 0 0a蛊3 0 0 0oj2 0 0 01 0 0 00圆圈c r o s s 上l r 出e r图4 两种芯片修饰途径的对比4 本章小结我们开发出了一种新的便捷有效的方法来制备糖芯片，即在羟基化修饰的玻璃表面上通过糖还原末端的醛基与羟基反应形成糖苷键来将糖固定载玻片上，结果显示这种方法是可行的，更重要的是，固定的糖无须进行修饰，所形成的糖连接也是自然界中存在的。这种方法的优点主要包括操作简单，糖无须修饰，惰性的芯片表面以及定量分析。另外，这种芯片的优点还体现在它使用的仪器与现行的芯片方法所使用的仪器相一致。在后续的实验中我们选定g p l s 途径作为我们的羟基修饰途径，并且选定4 羟基丁酸肼修饰作为我们的偶联剂。第二章羟基化糖生物芯片相关的条件优化1 引言生物芯片现已成为快速、高效、高通量取得相关信息的重要手段。随着糖生物学及糖组学研究的进展，一种全新的生物芯片一糖芯片正逐渐发展，并开始成为糖生物学及糖组学新的研究手段。由单糖、寡糖或多糖等与蛋白质或脂类连接形成的糖化合物广泛地存在于生物体中，在生命活动