PCR技术详解课件.ppt

PCR技术详解,一,二,三,四,五,PCR简史,定义,基本原理,反应要素,PCR的类型,六,PCR反应流程,目录,八,常见问题分析,九,PCR技术应用领域,七,PCR产物检测,一、PCR简史,1971年，Khorana提出：经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。但由于测序和引物合成的困难，以及70年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能，所以，Khorana的设想被人们遗忘了,1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应（PCR）最初采用E-coliDNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错，未能推广1988年，Saiki等人从嗜热杆菌(thermusaquaticus)中提出TaqDNA聚合酶，使得PCR技术得以广泛应用1993年，Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖,二、定义PCR(聚合酶链式反应）是利用DNA在体外高温（95左右）时变性成单链，低温退火（经常是60左右）时引物与单链按碱基互补配对原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(53)的方向延伸合成互补链,三、基本原理PCR技术模拟DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物,该原理主要包括3个基本反应过程：模板变性引物退火新链延伸,重复13步2530轮,目的DNA片段扩增100万倍以上,DNA双螺旋,DNA单链与引物复性,DNA变性形成2条单链,子链延伸DNA加倍,理想拷贝数=2nn：循环次数实际拷贝数=(1+x)nX：平均效率,约为0.85n：循环次数,四、反应要素,热稳定DNA聚合酶引物模板dNTP二价阳离子维持pH的缓冲液,热稳定DNA聚合酶,目前有两种TaqDNA聚合酶供应：天然酶：从栖热水生杆菌中提纯基因工程酶：大肠杆菌合成一个典型的PCR反应约需酶量2.5U（指总反应体积为100l时）；浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。,2.引物引物是PCR特异性反应的关键,PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度；引物浓度一般为0.1-0.5mol/L，浓度过低影响产量，偏高引起错配和非特异性产物增加，且可增加引物二聚体的产生几率,引物长度：15-30bp，常用为20bp左右；引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb；引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列；,引物设计原则：,避免引物内部出现二级结构：避免两条引物间互补，特别是3端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带；引物3端的碱基应严格要求配对：特别是最末及倒数第二个碱基，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败；引物的熔解温度（Tm值），指把DNA的双螺旋结构热变性过程中紫外吸收值达到最大值的1/2时的温度。DNA中GC含量越高，Tm值越高，引物对之间的Tm值相差不超过23，经验公式Tm=2(A+T)+4(G+C)，引物的退火温度通常低于Tm值510；引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性；引物量：每条引物的浓度0.10.5M，以最低引物量产生所需要的结果为好引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会,3.模板,模板即DNA片段,其量的多少及其纯度的高低,是PCR成败与否的关键环节之一单、双链DNA均可不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类对于哺乳动物基因组DNA开说，每个反应需要的模板量是1g，对于酵母染色体、细菌染色体和质粒等模板的通常用量分别是10ng、1ng、1pg,4.dNTP,dNTP在温度较高时容易失活,因此需要-20下冰冻保存,以保证dNTP的质量。在PCR反应中,dNTP浓度应为200250mol/L,尤其重要的是4种dNTP的体积浓度要相等,否则就会引起错配过低浓度降低PCR产量，过高浓度的dNTP(大于4mmol)可能会淬灭Mg2+，从而抑制PCR反应,5.二价阳离子,通常为Mg2+，Mg2+是DNA聚合酶的激活剂，当dNTP浓度为200mol时，Mg2+浓度在1.5mmol/L2.0mmol/L为宜Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降；Mg2+过高影响反应特异性Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度,6.维持pH的缓冲液,室温下pH调到8.38.8的Tris缓冲液常用于PCR反应，浓度在10mmol66mmol，当72时（延伸温度），反应缓冲液的pH会降到约7.2，缓冲液中加入KCl，可以促进引物的退火,2019/12/15,19,可编辑,五、PCR的类型,标准PCR热启动PCR反向PCR巢式PCRLAPCR不对称PCRRTPCR实时荧光定量PCR,多重PCR差异显示PCR锚定PCR原位PCR重组PCR免疫PCR,1)反向PCR(reversePCR),是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段，对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。可对未知序列扩增后进行分析,如探索邻接已知DNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长cDNA的克隆,扩增基因文库的插入DNA；建立基因组文库。,已知序列,未知序列,未知序列,限制酶,限制酶,连接酶,2）不对称PCR目的：扩增产生特异长度的单链DNA。方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物，其最佳比例一般是0.010.5M，关键是限制性引物的绝对量。用途：制备核酸序列测定的模板制备杂交探针基因组DNA结构功能的研究,高浓度引物,低浓度引物,3）多重PCR：在一个反应体系中使用一对以上引物的PCR称为多重PCR。其结果是产生多个PCR产物，用于检测特定基因序列的存在或缺失。,电泳,引物,4）实时定量PCR(real-timePCR):该技术是在常规PCR基础上加入荧光标记探针来实现其定量功能的，特定设计的PCR仪器来实时检测PCR扩增过程每一轮循环产物的累积荧光值，可以很好的推算模板的起始浓度,实时PCR技术原理,探针设计一般应符合以下条件：探针长度应在2040个碱基左右，保证结合特异性。GC碱基含量在40%60%，避免单核苷酸序列的重复。避免与引物发生杂交或重叠。探针与模板结合稳定程度要大于引物与模板结合的稳定程度，因此探针的Tm值要比引物的Tm值至少高出5。另外，探针的浓度、探针与模板序列的同源性，探针与引物的距离都对实验结果有影响。,6、PCR反应流程,1、温度与时间的设置,设置变性-退火-延伸三个温度点标准反应中采用三温度点法，双链DNA在9095变性，再迅速冷却至4060退火，然后快速升温至7075延伸，对于较短靶基因（长度100300bp）可采用二温度点法，将退火与延伸温度合二为一，一般采用94变性，65左右退火与延伸。,变性温度与时间：,一般9394，1min足以使模板变性若低于93则需延长时间但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。,退火(复性)温度与时间：,退火温度是影响PCR特异性的重要因素退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基因序列的长度对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55作为选择最适退火温度的起点较为理想,在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性,延伸温度与时间：,延伸温度：一般选择在7075之间常用温度为72过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。延伸反应时间：根据待扩增片段长度而定1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min（足够）34kb的靶序列需34min扩增10kb需延伸至15min延伸时间过长会导致非特异性扩增对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些,2、循环次数,循环次数决定PCR扩增程度循环次数主要取决于模板DNA的浓度循环次数：选在30次左右循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多,七、PCR产物检测,琼脂糖凝胶电泳最常用聚丙烯酰胺凝胶电泳层析技术高效液相色谱（HPLC）离子交换层析（IEC）分子杂交限制性内切酶酶切分析PCR扩增产物的直接测序,八、常见问题分析,不出现扩增条带分析原因：模板、酶失活或污染、引物对的质量和浓度、PCR产物电泳检测时间一般为48h内2.假阳性分析原因：模板或扩增产物的交叉污染3.非特异性扩增带分析原因：引物与靶序列未完全互补或引物聚合形成二聚体、镁离子浓度过高、退火温度