（分析化学专业论文）基于磁性微粒的巨磁阻抗生物传感器的制备研究.pdf

学位论文独创性声明 本人所呈交的学位论文是我在导师的指导下进行的研究工作及 取得的研究成果。据我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文 不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重 要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确说明并表示谢意。 作者签名： 学位论文授权使用声明 本人完全了解华东师范大学有关保留、使用学位论文的规定，学 校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电 子版和纸质版。有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论 文进入学校图书馆被查阅。有权将学位论文的内容编入有关数据库进 行检索。有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在 解密后适用本规定。 学位论文作者签名：眺 呲趟酆 导师签名： 日期： 训匍 i _ 【 越) 中文摘要 摘要 基于磁性微粒的巨磁阻抗生物传感器的制备与应用研究 巨磁阻抗( g m i ) 传感器是基于非晶磁性材料高灵敏巨磁阻抗效应的一类新 型传感器。g m i 效应是1 9 9 2 年日本名古屋大学毛利佳雄教授首先发现的，该效 应是指一些具有软磁特性的非晶磁性材料的交流阻抗( z ) 随着外加磁场( h ) 的改变而显著变化的现象，灵敏度( 等h ) 可达4 0 1 0 0 0 e 。g m i 效应自 么 发现以来，其巨大的应用前景吸引了很多科学工作者的注意，在实验和理论上都 作了很多工作。基于g m i 效应的巨磁阻抗传感器具有以下特点：灵敏度极高、 外加磁场低、稳定性好、线性度好、使用寿命长、仪器成本低、易微型化。 在本论文中，我们利用g m i 效应较大的巨磁阻抗材料，研制出符合生物传 感器要求的探头，并设计了一套体积小、稳定性好的g m i 测量系统，从而研制 出集成式、高灵敏度的g m i 生物传感器；作为g m i 生物传感器的应用研究之一， 为将该传感器应用于生物免疫分析，研究了磁性微粒的表面修饰，并以氨基未端 磁珠为基体，进行固定b s a 蛋白的研究，拟将此新型磁性微粒应用于巨磁阻抗 生物传感器中，作为夹心免疫反应的标记物，并可使其同时起到捕获与富集的磁 性分离功能。 该g m i 生物传感器研制成功后，其高灵敏度可以满足在分子水平上研究各 种生命现象的要求，可应用于蛋白质结构与功能的研究、d n a 与蛋白质的相互 作用研究、药物和生物大分子相互作用的研究、重大疾病生物标志物的分析等领 域，具有重要的研究意义和实际应用价值。 本论文主要研究内容如下： 1 研制了非线性非对角化g m i 传感器探头，制成的探头灵敏度达到 2 3 m v m g s ( 2 3 m v a m 。1 ) 。并研究探讨了灵敏度和线圈参数的关系，得到如 中文摘要 下结论：灵敏度与线圈的直径、长度和匝数，也与线圈导线直径相关。其中， 与线圈的匝数成正比，与线圈长度、直径及导线直径成反比。 2 设计并制作了g m i 生物传感器的测量系统。此g m i 生物传感器的测量系统 由产生均匀外加磁场的亥姆霍兹线圈、产生高频电流的标准信号发生器、交 直流转换器、隔离变换器、可变电流源、电平放大单元、数模转换卡接口 等部分组成。此测量系统直流信号的量程在+ 4 0 0 m g s ( + 4 0 0 a m 1 ) ，在量程范 围内其线性度达到了0 9 9 9 9 ，其灵敏度达到了斜率为5 4 6 ( 即灵敏度达到 5 4 6m v m g s ( 5 4 6 m v a m 。) ) ，分辨率达到了1 0 一t 。通过数据采集将电压 信号转换为数字信号。 3 以3 氨丙基三乙氧基硅烷作为修饰剂，对具有永磁性的n d f e b 磁性粒子进 行了表面修饰，使之表面带有活性小m 2 基官能团，然后利用戊二醛二步法将 牛血清白蛋白( b s a ) 固定至n h 2 末端磁粒上。结果表明：在适当的条件下( 离 子强度、p h 、时间) ，利用戊二醛固定蛋白有较高的偶联效率。此实验有助 于更加方便快捷地利用功能化磁性复合微粒进行g m i 生物传感器蛋白质的 分离与检测。 关键词：磁性微粒；巨磁阻抗效应；生物传感器 a b s t r a c t a b s t r a c t s t u d yo nt h ep r e p a r a t i o na n da p p l i c a t i o no fg i a n t m a g n e t o i m p e d a n c e b i o s e n s o rb a s e do nm a g n e t i cb e a d s g i a n tm a g n e t o i m p e d a n c e ( g m i ) s e n s o ri san e wt y p eo fs e n s o rb a s e do n a m o r p h o u sm a g n e t i cm a t e r i a l s 晰t h1 1 i 曲l ys e n s i t i v eg i a n tm a g n e t o i m p e d a n c ee f f e c t g m ie f f e c tw a sd i s c o v e r e df i r s t l yi n19 9 2b yj a p a n e s ep r o f e s s o rm a o r io fn a g o y a u n i v e r s i t y t h ee f f e c t i st h a ta ci m p e d a n c e ( z ) o fs o m ea m o r p h o u sm a g n e t i c m a t e r i a l sw i t hs o f tm a g n e t i cp r o p e r t i e ss i g n i f i c a n t l y c h a n g e s w i t ht h ee x t e r n a l 竺 m a g n e t i cf i e l d ( h ) t h es e n s i t i v i t y ( zh ) r e a c h e d4 0 10 0 o e s i n c eg m i e f f e c th a sb e e nf o u n d ，t r e m e n d o u sp r o s p e c t sf o rt h ea p p l i c a t i o na t t r a c t e dal o to f a t t e n t i o no fs c i e n t i f i cw o r k e r s ，a n dal o to fs t u d yh a sb e e nd o n eb o t ho ne x p e r i m e n t a n do nt h e o r y g m ie f f e c to nt h eg i a n tm a g n e t o i m p e d a n c es e n s o rh a st h ef o l l o w i n g c h a r a c t e r i s t i c s ：h i g hs e n s i t i v i t y , n e e dl o we x t e r n a lm a g n e t i cf i e l d ，g o o ds t a b i l i t y , g o o d l i n e a r i t y , l o n gl i f e ，l o wc o s t ，e a s yt om i n i a t u r i z a t i o n i nt h i sp a p e r , w eu s e dg i a n tm a g n e t o - i m p e d a n c em a t e r i a l sw i t hl a r g e rg m ie f f e c t ， t od e v e l o pt h ep r o b ew i t ht h er e q u i r e m e n t so fb i o s e n s o r s ，a n dd e s i g n e das m a l l ，s t a b l e g m im e a s u r e m e n ts y s t e m w ed e v e l o p e da i n t e g r a t e d ，h i g hs e n s i t i v eg m i b i o s e n s o rt h a tc a nc a r r yo u tq u a n t i t a t i v ea n a l y s i s a so n eo fa p p l i c a t i o no fg m i b i o s e n s o r , f o ru s i n gt h es e n s o r si nt h ea n a l y s i so fb i o l o g i c a li m m u n i t y , t h es u r f a c e m o d i f i c a t i o no ft h em a g n e t i cp a r t i c l e sw a ss t u d i e d w eu s e dt h ea m i n o - t e r m i n a lb e a d a sm a t r i x ，t of i xb s a p r o t e i n w ep r o p o s e dt ou s en e wt y p eo fm a g n e t i cp a r t i c l e si n t h i sg i a n tm a g n e t o i m p e d a n c eb i o s e n s o r s ，a sm a r k e r so fs a n d w i c hi m m u n er e s p o n s e ， a n da tt h es a m et i m ei tc a nc a p t u r e da n de n r i c h e dt h eb i o m o l e c u l ei nt h em a g n e t i c a b s t r a c t s e p a r a t i o n i ft h ed e v e l o p m e n to ft h eg m ib i o s e n s o r si ss u c c e s s f u l ，i t sh i g hs e n s i t i v i t ym a y m e e tt h ev a r i o u sr e q u i r e m e n t so ft h es t u d yo ft h el i f ep h e n o m e n o nb yt h em o l e c u l a r l e v e l i tc a nb e u s e do nt h es t u d yo ft h es t r u c t u r ea n df u n c t i o no fp r o t e i n ，t h e i n t e r a c t i o no fd n aa n d p r o t e i n ，t h e i n t e r a c t i o no f d r u g a n d b i o l o g i c a l m a c r o m o l e c u l e s ，a n a l y s i so ft h ef a t a ld i s e a s eb i o m a r k e r ，a n do t h e rf i e l d s i tm a yh a v e i m p o n a n ts i g n i f i c a n c ea n dp r a c t i c a la p p l i c a t i o nv a l u e t h i sp a p e rs t u d i e da sf o l l o w s ： 1 w ed e v e l o p e dan o n l i n e a rn o n d i a g o n a lg m is e n s o r , t h ep i c k u pc o i lp a r a m e t e r s ， i n c l u d i n gt h el e n g t h ，t h ed i a m e t e ro fc o i lt u b e ，t h en u m b e ro ft u r n sa sw e l la st h e d i a m e t e ro ft h ec o i lw i r e ，i nr e l a t i o nt ot h es e n s o rs e n s i t i v i t ya r ei n v e s t i g a t e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h es e n s i t i v i t yi sd i r e c t l yp r o p o r t i o n a lt ot h ea cd r i v i n g f r e q u e n c y , a n dt h en u m b e ro ft u r nd e n s i t yo ft h ep i c k u pc o i l w i t hs m a l l e rw i r e d i a m e t e r , s m a l l e rc o i ld i a m e t e ra n ds m a l l e rc o i ll e n g t h ，t h es e n s o rs e n s i t i v i t y i m p r o v e s u s i n gc o - b a s e dg l a s s c o a t e da m o r p h o u sm i c r o w i r e s2 3g mi n d i a m e t e ra ss e n s i n ge l e m e n t ，t h es e n s i t i v i t yi su pt o2 3 m v m g s ( 2 3 m v a m 。1 ) 2 w ed e s i g n e da n dp r o d u c e dam e a s u r e m e n ts y s t e mo fg m i b i o s e n s o r u s i n gt h e p h a s es e n s i t i v ed e t e c t i o nm e t h o d ，t h eo u t p u ts i g n a li nv a r i a t i o nw i t ht h ee x t e r n a l m a g n e t i cf i e l dw a sc o n v e r t e dt oad cs i g n a l t h em e a s u r i n gr a n g eo ft h ef i e l di s 士4 0 0m g s ( 4 0 0 a m 。1 ) t h el i n e a r i t yc o e f f i c i e n ti s0 9 9 9 9 ，t h es e n s i t i v i t yi s5 4 6 m v m g s ( 5 4 6 m v a m 1 ) ，t h er e s o l u t i o nr e s p o n s ei su pt o10 8t b yu s i n gad i g i t c i r c u i t ，t h es i g n a lc a nb ec o n v e n e dt ot h ed i g i t a ls i g n a l 3 i no r d e rt o c o n j u n c tt h en d f e bw i t ha c t i v ei n h 2g r o u p s ，t h es u r f a c e m o d i f i c a t i o no fn d f e b p e r m a n e n tm a g n e t i cp a r t i c l e sb y 3 - a m i n o p r o p y l t r i e t h o x y s i l a n e ( a p e s ) w a ss t u d i e di nt h i sp a p e r t h es u r f a c e f u n c t i o ng r o u p so ft h em o d i f i e dn d f e bm a g n e t i cp a r t i c l e sw e r ei n v e s t i g a t e db y 4 a b s t r a c t f t i r ，d s c t g ，t e ma n dm a g n e t i ch y s t e r e s i sl o o pm e a s u r e m e n t s ，a n dt h e e x p e r i m e n t a lr e s u l t ss h o w e dt h a tm a g n e t i cp a r t i c l e se f f e c t i v e l y m o d i f i e db y a m i n o s i l a n ew e r eo b t a i n e du n d e rt h eo p t i m u me x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n s w e f i x e db o v i n es e r u ma l b u m i n ( b s a ) t o - n h 2e n do fm a g n e t i cp a r t i c l e s ，c h o o s e d i f f e r e n tr e a c t i o nm e d i u m ，o p t i m i z et h er e a c t i o nc o n d i t i o n st or e d u c et h e n o n s p e c i f i ca d s o r p t i o no fp r o t e i na n dt h em a g n e t i cp a r t i c l e s ，i n c r e a s e dc o u p l i n g e f f i c i e n c y , a f t e rc o u p l i n g ，s e p a r a t e dt h er e a c t i o ns o l u t i o na n do b t a i n e dt h eu p p e r p o r t i o na n dm e a s u r e dt h eo d 2 8 0v a l u e s ，j u d g e m e n tc o u p l i n ge f f i c i e n c y t h e r e s u l t ss h o wt h a t ：u n d e rt h ep r o p e rr e a c t i o nc o n d i t i o n s ( i o n i cs t r e n g t h ，p h ，t i m e ) ， u s i n gg l u t a r a l d e h y d ef i xp r o t e i nh a sh i g h e rc o u p l i n ge f f i c i e n c y t h i se x p e r i m e n t w i l lh e l pt od e v e l o pm o r ec o n v e n i e n ta n de f f i c i e n tm e t h o d st ou s ef u n c t i o n e d m a g n e t i cp a r t i c l e st os e p a r a t ea n dd e t e c tp r o t e i nb yg m i b i o s e n s o r k e y w o r d s ：m a g n e t i cp a r t i c l e s ；g i a n tm a g n e t o i m p e d a n c e ；b i o s e n s o r 第一章绪论 1 引言 第一章绪论 随着现代信息科学技术的迅速发展，新搴芎料、新技术、新方法不断的广泛应 用，人们对电子领域的传感和存储器件的大小、灵敏度、测量范围、热稳定性、 功耗及成本等提出了越来越高的要求，尤其是电磁测量领域，过去的一些传统器 件已经难以满足要求。 1 9 9 2 年日本名古屋大学的k m o h r i 等人【1 】在c o f e s i b 软磁非晶丝中发现了 巨磁阻抗( g i a n tm a g n e t o i m p e d a n c e ，g m i ) 效应。遂过对g m i 效应十多年的研究， 该效应在材料种类、样品形式以及理论解释等方面均取得了很大的突破。 理论研究方面，g m i 效应可以通过经典电动力学理论来解释。外磁场可以 影响材料内部的等效场，使材料的有效磁导率发生变化，从而导致材料的趋肤深 度发生变化，而趋肤深度变化意味着驱动电流流过样品的有效面积发生了变化， 从两萼| 起样品的有效阻抗发生变化，最后导致巨磁阻抗效应的产生。高频时，其 机理涉及到磁感应效应、趋肤效应和铁磁共振效应等 2 5 】。 利用非晶及纳米晶软磁材料的这种g m i 特性，可制作各种磁敏传感器，与 其他磁传感器相比，g m i 传感器灵敏度高，且是唯一能溺时满足高灵敏度、尺 寸微型化、响应速度快、功耗低和磁滞小等要求的磁传感器 6 1 4 。由于具有性 能稳定、几乎无磁滞、高灵敏度、响应速度快、非接触、可批量生产等优点，随 着甄磁阻抗效应研究的深入，基于g m i 效应的磁敏传感器越来越多【1 5 2 5 】，可 广泛用于生产各种与之性质相关的电磁传感器件，如测量磁场、电流、位移、数 控机床、汽车测速、旋转编码器、振动传感器、抽速度传憋器等多个环境参数的 监测【2 6 3 3 】。 现在巨磁阻抗( g m i ) 效应的传感器研究十分活跃 3 4 4 1 ，已经成为现代磁电 子学的研究热点，并已有了一些经典的臣磁阻抗效应的传感器电路f 4 2 4 4 。 6 第一章绪论 巨磁阻抗效应简介 2 1 巨磁阻抗效应的发展历史 1 9 9 2 年日本名古屋大学的k m o h r i 等人 1 在c o f e s i b 软磁非晶丝中发现了 巨磁阻抗( g i a n tm a g n e t o i m p e d a n c e ，g m i ) 效应，即当对软磁非晶丝通以交流电流 时，细丝两端感生的交流电压随着丝纵向所加的一很小的外磁场的变化而灵敏变 化。在高频下，趋肤效应发生作用，这时阻抗中的电阻分量和电感分量同时受外 磁场影响，而称为巨磁阻抗效应。g m i 阻抗变化达7 5 ，室温时拉应力退火的 丝的阻抗变化比为9 0 以上，灵敏度达1 0 o e ，比g m r 高很多。通过对g m i 效应十多年的研究，该效应在材料种类、样品形式以及理论解释等方面均取得了 很大的突破。早期对g m i 效应的研究主要集中在具有零或负磁致伸缩系数的c o 基非晶软磁合金丝【4 5 - 4 9 】，很快研究范围扩展到c o 基薄带 5 0 5 2 薄膜 5 3 ，5 4 。 因为f e 基材料比c o 基材料更经济、实用、更有研究价值，而后，在材料上扩 展到了以f e c u n b s i b 及n i f e 等为代表的f e 基材料 5 5 6 0 。在样品种类上也进 一步扩展到了薄带、薄膜、粉术、复合结构丝和复合结构薄膜 6 1 6 7 。复合结构 丝有玻璃包裹丝、b e c u 丝外电镀者化学镀软磁镀层等形式；复合结构薄膜则包 括有三明治薄膜、多层膜、带导电层与铁磁层间引入绝缘层的三明治薄膜等 【6 8 7 3 】。 由于巨磁阻抗效应在磁记录头和传感器的巨大应用前景，非晶丝巨磁阻抗效 应的研究最近几年引起了广泛的关注。美国波士顿大学教授h u m p h r e yfb 、瑞 典阜家工学院r a okb 、日本u n i t i k a l t d 公司对g m i 效应的产生机制作了深入系 统的分析研究，就实验数据做了理论解释。 我国从1 9 9 3 年就开展“f e s i b 系非晶丝的制备和应用”的研究。目前，我 国自行研制成直径3 0 岬的冷拔和张应力退火的g m i 非晶丝，大幅度地增强了 丝的g m i 效应。该材料填补了国内空白，g m i 性能指标达到了国际先进水平。 但国内利用非晶丝的巨磁阻抗效应研制的新型磁场传感器还处于初步阶段。 7 第一章绪论 2 2 巨磁阻抗效应的基本理论 g m i 效应可以通过经典电动力学理论来解释：当交流电流通过导体时由于 趋肤效应，趋肤深度为吒=。式中心为丝的环向磁导率，为电流角频 率，硝电导率。外磁场可以影响材料内部的等效场，使材料的有效磁导率发生 变化，从而导致材料的趋肤深度发生变化，而趋肤深度变化意味着驱动电流流过 样品的有效面积发生了变化，从而引起样品的有效阻抗发生变化，最后导致巨磁 阻抗效应的产生，这就是g m i 效应的基本来源。高频时，其机理涉及到磁感应 效应、趋肤效应和铁磁共振效应等 7 4 - 7 7 】。 g m i 效应自发现以来，其巨大的应用前景吸引了很多科学工作者的注意， 在实验和理论上都做了很多工作，g m i 的理论分析对更好的理解现有实验结果 以及指导研究具有g m i 效应的新材料有着重要的意义。 2 3 巨磁阻抗效应的基本特点 ( 1 ) 在低场范围( h 一w ： 一n 一甜 c b c i # 啦c h = = n 一司 图4 i 戊二醛偶联原理 f i g4 lg l u t a r a l d e h y d ec o u p l i n g p r i n c i p l e 第4 章氮基末端磁珠的制备及其固定b s a 蛋白的研究 2 实验部分 2 1 氨基硅烷修饰n d f e b 永磁微粒 2 1 1 实验原理 硅烷化是一种表面修饰方法，硅烷偶联剂遇水会发生水解反应： r s i x 3 。3 h 2 0 一r s i ( o h ) 3 式中r 为不能水解的有机官能团- n h 2 ( c h 2 ) 3 ；x 为可水解的烷氧基团 ( o c 2 h 5 ) 3 。通过上述反应，烷氧基( o c 2 h 5 ) 3 发生了水解，形成了硅醇一s i ( o h ) 3 。 一般情况下，磁粉表面会在空气中吸附少量水分，从而存在一定量的羟基。当硅 烷与磁粉混合时，硅烷化试剂水解形成的硅醇和被修饰物表面的羟基脱水形成共 价键，硅醇之间也可以形成s i o s i 共价键，偶联剂分子与磁粉之间以及偶联剂 分子之间通过化合反应相互连接在一起。最终偶联剂将以化学吸附的方式在磁粉 表面形成一层网状的薄膜 17 】，从而形成一个硅层。如果硅烷化试剂含有功能基 团( - n h 2 ，一c o o h ，s h 等) ，那么经修饰后，表面就形成丰富功能基的单分子层。 o e t h i h + n h 2 m 舀一o e t h i o e t 2 1 2 实验方法 图4 2n d f e b 磁粉表面硅烷化修饰示意图 f i g 4 2t h es k e t c ho f s i l a n em o d i f y i n gn d f e b 按1 ：1 比例配制乙醇水溶液作为分散介质。称取lg n d f e b 磁粉( 粒径多 数约为o 1 5r t m ) ，加入到分散介质中，在室温下超声处理3 0r a i n 以除去磁粉 表面杂质。待超声分散的n d f e b 磁粉沉积后，用磁铁吸住烧杯底部倒出上层清 4 7 心 心 心 附 卅 m &9谢o，确 勺 o 第4 章氨基末端磁珠的制各及其固定b s a 蛋白的研究 液，加入分散介质，使悬浮液体积达到4 0m l 。加入1 n 儿氨丙基三乙氧基硅烷 偶联剂( k h 5 5 0 偶联剂) ，搅拌均匀后转移至三口烧瓶中，保持系统密闭，以 免溶剂挥发，在6 0 c 恒温条件下强烈搅拌1 0h 。反应结束后，用乙醇和水分别反 复沈涤，6 0 烘干。 2 1 3 分析表征 n i c o l e tn e x u s6 7 0 ( t h e r m on i c o l e t ) 傅立叶红外光谱( f t - i r ) 检测偶联剂修饰前 后磁粉表面官能团变化； n d f e b 磁粉的差示扫描量热( d s c ) 、热重( t g ) 曲线在 瑞士梅特勒一托利多( m e t t l e r - t o l e d o ) t g a s d t a 8 5 l e 综合热分析仪上进行，升 温速度为1 0 。c m i n ，气氛为空气。振动样品磁强计测量改性后磁粉的磁性。日本 j e o l 公司的j e m 1 0 0 c x 透射电子显微镜检测磁粉的包裹情况。 2 2 氨基末端磁珠固定b s a 蛋白 2 2 1 主要试剂 戊二醛( 2 5 水溶液) ，s i g m a 公司产品；北京鼎国；n a h 2 p 0 4 * 2 h 2 0 ，西安化 学试剂厂，分析纯；n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 0 ，西安化学试剂厂，分析纯：牛血清白蛋 i 刍( b s a ) ，1 0m g m l ，北京鼎国； 2 2 2 主要仪器 紫外分光光度计，美国a g i l e n h 恒温振荡器，国华企业：离心管、移液枪， 德国e p p e n d o r f ：搅拌器，德国i k a ：电子恒温水域锅，天津泰斯特仪器厂； 分 析天平，瑞士m e t t l e rt o l e d o ：精密p h 计，上海精密仪器有限公司；超纯 水仪，e l g a ( m a x i m a ) ( 所有实验用水均为超纯水) ；数显恒温磁力搅拌器，英 国j e n w a y 。 第4 章氮基末端磁珠的制各及其同定b s a 蛋白的研究 2 3 3 戊二醛二步法- n h 2 末端磁粒固定b s a 蛋白 2 2 3 1 反应介质的选择 分别取5 0 0l x ln h 2 末端磁粒，置入5 个离心管里，将介质换成磷酸盐缓冲 液( p bb u f f e r ) ，浓度依次为o 5m ，o 1m 和0 0 1m ( p h = 7 4 ) ，第四个管中介质换 为水，第五个管中介质换为0 0 1m 醋酸盐缓冲液( p h = 5 o ) 。分别向每管中加入 5 0 t lb s a 蛋t 刍( 1 0m g m l ) ，放到恒温振荡器上反应6 h 后( 1 5 0r m i n ，r t ) ，分离上 层清液，在紫外分光光度计上测o d 2 8 0 值。 2 2 3 2 醛基化处理 取3 0m l n h 2 末端磁性微粒，用0 1m 的n a h c 0 3 洗涤3 次，再用0 0 1m 的p b s 缓冲液( p h = 7 4 ) 洗涤3 次，最后分散在0 0 1m 的p b s 中，加入1m l 2 5 的戊二醛，室温下在摇床上反应6h ( 1 5 0r r a i n ) ，反应完毕后用p b s 洗3 5 次， 再分散于p b s 中备用。 2 2 3 3b s a 偶联结果 取5 0 0u l 醛基化处理的磁粒于1 5m l 的离心管中，加入5 0p lb s a 蛋白， 放入摇床室温反应6 h ，速度1 5 0r m i n ，反应完毕，磁性分离，通过紫外可见分 光光度计检测上层清液在2 8 0n m 处的吸收，最后用5m l 的n a c i 清洗，检测 o d 2 8 0 。 4 9 第4 章氨基末端磁珠的制各及其固定b s a 蛋白的研究 3 结果与讨论 3 1 氨基硅烷修饰效果的分析 3 1 1f t - i r 分析 岳 嚣 翟 誊 i 。- - 7 2 i 一吾善墨 l , - 。一 - 。 ：z 一，。= * - ， 4硼t d w a v e n u m b e r s ，c t n 一 图4 3 偶联剂包覆磁粉前后的红外光谱图a 包覆前：b 包覆后 f i g 4 3f t - i rs p e c t r ao fn d f e ba n dn d f e bm o d i f i e db ys i l a n e an d f e b ；bn d f e bm o d i f i e db ys i l a n e 利用红外光谱检测了k h 5 5 0 偶联剂在n d f e b 磁粉表面的包覆状态，结果如 图4 3 所示。图中分别为n d f e b 磁粉、偶联剂包覆磁粉的红外吸收光谱。从图 中可以看出，3 4 3 5c l l l 。1 和1 6 3 6c m 。处的吸收峰分别是磁粉表面缔合。o h 的伸缩 振动和样品中残余h 2 0 的变形振动，比较n d f e b 磁粉包覆前后的特征光谱，发 现包覆后出现了1 0 9 9c m 。和1 0 0 2c m 1 两个新的吸收峰。其中，1 0 9 9c m 一对应 氨基n h 2 ，1 0 0 2c m j 峰对应的是s i o 和s i o c 键。说明新的吸收峰是k h 5 5 0 偶 联剂的对应官能团特征吸收产生的，这表明n d f e b 磁粉表面吸附有k h 5 5 0 偶联 剂。此外样品在测试前经过乙醇溶剂的多次洗涤，由此推断n d f e b 磁粉表面与 k h 5 5 0 偶联剂是以化学键的形式在表面结合的。 5 0 第4 章氨基末端磁珠的制备及其周定b s a 蛋白的研究 3 1 2n d f e b 磁粉的综合热分析 图4 4 和图4 5 分别是未经过表面改性的n d f e b 磁粉和经过硅烷偶联剂表面 改性的n d f e b 磁粉的d s c 和t g 曲线。可以看出在相同条件下，未经过表面改 性的n d f e b 磁粉的明显热增重发生在3 6 0 处，最终增重率达到了3 8 4 2 5 4 ， 最大放热峰约为6 1 0 ；而经过偶联剂表面改性的n d f e b 磁粉的明显热增重发 生在3 8 0 处，最终增重率为3 6 7 5 3 9 ，最大放热峰约为6 9 0 。因此经过偶联 剂表面改性的n d f e b 磁粉的抗氧化性能明显优于未经过表面改性的n d f e b 磁 粉。 5 臣g 1 0 0i 1 0 03 0 0 4 0 0 s o o 6 0 07 0 0o 9 0 0 。c 】0 0 2 q 0 3 q q璺n n5 口d6 0 2 0 d安口q2 0 0： l | - ：m e t t l e rk l - t y l e f i f o l e o os t r $ 1 r r l t e m 图4 4 未经表面改性的n d f e b 磁粉 f i g 4 4d s c t gc h iv eo fn d f e b 蚺4 钮尊$ # m # 的制蔷# 目ib s a 自的研究 1 0 口 2 口d4 口 6 0 01 0 009 0 0 翻4 5 经过硅烷偶联女噼词瘦眭的n d f e b 磁粉 f i g45d s c t g r v eo f n d f e bm o d i f i e db ys i i a n e 31 3 透射电子显微镜分析 n d f e b 磁粉磁粉颗粒粒度范围较大，其中颗粒较小的颗粒透射电予显微镜 照片清晰。图46 为表面修饰后的n d f e b 磁粉的透射屯子显微镜照h 。从图中 看h 1 ，磁粉表面包裹了一层硅烷，包裹效果较好 吲4 6 硅烷修饰后的n d f e b 碰柑t e m 目 f i g46 t e m m i c r o g r a p bo f n d f e b m o d i f i e db ys i l a n e 第4 章氨基末端磁珠的制备及其固定b s a 蛋白的研究 3 i 4n d f e b 磁粉的磁性分析 图4 7 、图4 8 为通过振动样品磁强计测量到的经过硅烷偶联剂表面改性前 后的n d f e b 磁粉的磁滞回线图。从图中可知氨基硅烷表面修饰后磁粉的磁性能 变化不大，修饰后的n d f e b 磁粉的磁响应性依然良好。因为n d f e b 永磁材料的 磁性较强，粒径也较大，所以导致氨基硅烷表面修饰后磁性能没有明显降低。 p ， e 3 c 0 口 罱 弓 c 口 啊 芝 叩 厶 1 0 t 1 0 0g ，05 啷1 a p p l i e df i e l d ( o e ) 图4 7 未经硅烷偶联剂表面改性的n d f e b 磁粉的磁滞回线 f i g 4 7m a g n e t i ch y s t e r e s i sl o o po f n d f e b o 第4 章氨基末端磁珠的制备及其固定b s 蛋白的研究 詈 e 旦 墨 肖 拦 罟 留 乏 一 一 j - 1 0 0 0 05 0 0 005 0 0 0 1 0 0 0 0 a p p l i e df i e l d ( o e ) 图4 8 经过硅烷偶联剂表面改性的n d f e b 磁粉的磁滞回线 f i g 4 8m a g n e t i ch y s t e r e s i sl o o po f n d f e bm o d i f i e db ys i l a n e 3 2 氨基末端磁珠固定b s a 蛋白的分析 3 2 1b s a 蛋白在n h 2 末端磁粒的非特异性吸附 为了减少磁粒与蛋白质之间发生非特异性吸附，使更多的蛋白质与磁粒发生 共价偶联，就需要选择适合偶联反应的离子强度和p h 值，采用的方法是更换不 同的反应介质，改变磁粒表面的微环境。实验结果显示当介质为超纯水或醋酸盐 缓冲液( p h = 5 0 ) 时，上清的o d 2 s o 值为零，b s a 几乎全部被吸附；当介质为 p b s ( p h = 7 4 ) 缓冲液时，尽管缓冲液的浓度不同，b s a 发生不同程度的吸附( 表 4 1 1 a 。 第4 章氨基末端磁珠的制各及其固定b s a 蛋白的研究 介质癸塑p h 上清絮外吸授 h ，0 7 00 2 9 2 5 0 0 lmp b 7 40 5 0 9 9 0 imp b 7 40 5 3 2 6 o 5 mp b - 40 5 8 4 9 0 0lmh a e n a a c 5 00 0 0 2 l 表4 1 不同介质中的u v 吸收 由表4 1 中的结果可见：当缓冲液为o 5mp b s 时，b s a 和磁粒吸附最少。 但由于较大的盐浓度可能会引起蛋白质的盐析，况且p b s 浓度的变化对b s a 与 磁粒的吸附影响不是太大，所以选择o 0 1m 的p b s 溶液( p h = 7 4 ) 作为介质束进 行固定化。 3 2 2 戊二醛二步法固定b s a 蛋白的结果 用戊二醛作交联剂，采用两步反应法与蛋白偶联。第一步反应用戊二醛和磁 粒作用，戊二醛的一个c h o 和n h 2 发生s c h l f f 反应 t s l ，另一个醛基伸悬挂于磁 粒表面，该c h o 可以与加入的蛋白质上赖氨酸残基的。n h 2 发生s c h i f f 反应， 从而使蛋白质固定于磁粒表面。 洗脱液o d 2 8 0 c 第4 章氨基末端磁珠的制备及其固定b s a 蛋白的研究 b s a 标准液o d 2 8 0 。 上清液o d 2 8 0 b 图4 9 n h 2 末端磁粒与b s a 蛋白偶联的紫外光谱。 f i g 4 9u l t r a v i o l e ts p e c t r u m o f - n h 2e n dm a g n e t i cp a r t i c l e sc o u p l e dw i t hb s a 图4 9 中在2 8 0l l m 的吸收明显降低( 曲线a ，b ) ，可见偶联的效率很高，通过 下式计算偶联效率x ：x = ( o d 2 8 0 a o d 2 8 0 b o d 2 8 0 e ) o d 2 8 0 。x1 0 0 ，将数据代入可得： 反应四小时后，b s a 蛋白的相对偶联率约为6 3 。 5 6 第4 章氨基末端磁珠的制备及其固定b s a 蛋白的研究 4 结论 以氨丙基三乙氧基硅烷为偶联剂可对n d f e b 永磁性粒子表面进行有效的功 能化修饰，使之表面带有活性- n h 2 基官能团。该法试剂易得，操作简单，结果 稳定。 以氨基末端磁珠为基体，研究氨基末端磁珠固定b s a 蛋白的方法我们得到 以下结论： ( 1 ) 选择合适的反应介质是降低非特异性吸附，增加共价偶联的关键。 ( 2 )以戊二醛为