论文：奶牛隐性乳房炎的诊断方法与细菌学研究.doc

山东农业大学 2007本科生学位论文奶牛隐性乳房炎的诊断方法与细菌学研究 院系：动物科技学院 学科专业：动物医学 导师：吴玉泉 教授 学生：林栋 中国山东泰安 2007年6月 奶牛隐性乳房炎的诊断方法与细菌学研究 目录综述.6摘要 .7ABSTRACT 8引言 .81.奶牛乳房炎的流行病学与危害情况 .9 1.1奶牛乳房炎的流行病学 .9 1.2奶牛乳房炎的危害 .92.乳房炎的分类及临床症状 .10 2. 1国内对乳房炎的分类 .103.隐性乳房炎的病因 .10 3. 1致病微生物感染 .10 3. 1. 1细菌 .10 3. 1. 2真菌 .11 3. 1. 3病毒 .11 3. 2动物机体因素 .11 3. 2. 1体型 .11 3. 2. 2年龄 .11 3. 2. 3遗传 .11 3. 2. 4防御机能的影响 .11 3. 3饲养管理因素的影响 .11 3. 3. 1饲料及饲喂 .11 3. 3. 2挤奶 .12 3. 4环境因素的影响 .124.乳房炎的监测与诊断 .12 4. 1直接检测法 .12 4. 1. 1体细胞直接计数法 .12 4. 1. 2荧光电子细胞计数法 .12 4. 2间接检测法 .12 4. 2. 1化学检测法 .12 4. 2. 2物理学方法 .125.奶牛乳房炎的防治 .13 5. 1预防措施 .13 5.1.1免疫预防 .13 5.1.2药物预防 .13 5. 1. 3综合预防 .13 5. 2乳房炎的治疗方法 .136.实验的目的和意义 .13材料与方法 .141.实验材料 .14 1. 1乳样 .14 1. 2参考菌株 .14 1. 3分离与选择性培养基 .14 1. 4生化鉴定培养基 .14 1. 5药品及试剂 .14 1. 6药敏试验药品 .14 1. 7实验器材 .142.奶牛隐性乳房炎诊断方法研究 .15 2. 1奶牛隐性乳房炎诊断方法的比较 .15 2. 1. 1乳样的采集 .15 2. 1. 2嗅鹰香草酚兰(B. T. B)试验 .15 2. 1. 3尼氏现场检验法(N. F. T) .15 2. 1. 4加州乳房炎试验(C. M. T) .16 2. 1. 5体细胞直接计数法 .163.奶牛隐性乳房炎的细菌学研究 .17 3. 1乳样的采集 .17 3. 2正常乳汁和隐性乳房炎乳汁的细菌学调查 .17 3. 2. 1细菌的分离培养 .17 3. 2. 2菌落计数 .17 3. 2. 3细菌的鉴定 .17 3. 2. 3. 1选择性培养基的优化试验 .17 3. 2. 3. 2革兰氏染色镜检 .17 3. 2. 3. 3培养特性鉴定 .17结果 .171.流行病学调查结果 .172.奶牛隐性乳房炎不同诊断方法的比较 .18 2. 1 B. T. B检测结果 .18 2. 2 N. F. T检测结果 .18 2. 3 C. M. T检测结果 .18 2. 4体细胞直接计数法检测结果 .193.奶牛隐性乳房炎细菌学研究 .19 3.1乳样的采集结果 .19 3.2乳样中细菌的分离培养结果 .19 3. 3菌落计数结果 .19 3. 4分离细菌的鉴定 .20 3. 4. 1选择性培养基优化试验结果 .20 3. 4. 2革兰氏染色镜检结果 .21 3. 4. 2. 1固体培养物染色镜检结果 .21 3. 4. 2. 2革兰氏阳性球菌肉汤培养物染色镜检结果 .22 3. 4. 3各种细菌的培养特性结果 .22 3. 4. 4正常乳汁和隐性乳房炎乳汁中的细菌种类和分布情况 .22讨论 .231. 奶牛隐性乳房炎流行病学情况及危害情况分析 .232. 隐性乳房炎诊断方法分析 .24结论 .241.通过流行病学调查发现 .242.通过几种诊断方法的比较发现 .25致谢 .25参考文献 .25 Table of ContentsAbstract .8INTRODUCTION .81. Cow Mastitis Epidemiology and hazard .91.1Cow Mastitis epidemiological .91.2 Cow Mastitis hazards .92. Mastitis classification and clinical symptoms .10 2.1 Mastitis on the domestic classification .103. Hidden Causes of Mastitis .10 3.1 Pathogenic microorganisms infection .10 3. 1. 1 Bacteria .10 3. 1. 2 Fungi .11 3. 1. 3 Virus .11 3. 2 Animal Organism factors .11 3. 2. 1 Body .11 3. 2. 2 Age .11 3. 2. 3 Genetic .11 3. 2. 4 Function of defense .11 3. 3 Feeding and management factors influence .11 3. 3. 1 Feed and Feeding .11 3. 3. 2 Milking .12 3. 4 The influence of environmental factors .124. Mastitis monitoring and diagnosis .12 4. 1 Direct detection .12 4. 1. 1 Somatic cell count .12 4. 1. 2 Fluorescence electronic cell counting method .12 4. 2 Indirect detection .12 4. 2. 1 Chemical Detection .12 4. 2. 2 Methods in Physics .125. Cow mastitis control .13 5. 1 Preventive measures .13 5.1.1 Immune prevention .13 5.1.2 Drug prevention .13 5. 1. 3 Comprehensive prevention .13 5. 2 Mastitis Treatment .136. The purpose of this experiment and significance .13 Materials and Methods .141. Experimental material .14 1. 1 Milk samples .14 1. 2 Reference strains .14 1. 3 Isolation and selective medium .14 1. 4 Biochemical Identification medium .14 1. 5 Drugs and reagents .14 1. 6 Drug susceptibility testing .14 1. 7 Experimental equipment .142. Cows Mastitis Diagnostic Method .15 2. 1 Cows Mastitis methods of diagnosis .15 2. 1. 1 Milk kind of Acquisition .15 2. 1. 2 Sniffing vanilla blue eagle (B. T. B) Test .15 2. 1. 3 Nissl-site test (T N. F.) .15 2. 1. 4 California mastitis test (C. M. T) .16 2. 1. 5 Somatic cell count .163. Cows Mastitis Bacteriology Research .17 3. 1 Milk kind of Acquisition .17 3. 2 Normal milk and milk recessive mastitis investigation of bacteriology .173. 2. 1 Bacteria isolated and cultured .17 3. 2. 2 Colony counting .17 3. 2. 3 Identification of bacteria .17 3. 2. 3. 1 Selective medium optimization test .17 3. 2. 3. 2 Gram stain .17 3. 2. 3. 3 Training characterization .17Results .171. Epidemiological findings .172. Cows Mastitis different methods of diagnosis .18 2. 1 B. T. B test results .18 2. 2 N. F. T test results .18 2. 3 C. M. T test results .18 2. 4 Somatic cell count test results .193. Cows Mastitis Bacteriology Research .19 3.1 Milk kind of acquisition results .19 3.2 Milk samples were isolated and cultured the bacteria results .19 3. 3 Colony counting results .19 3. 4 Identification of bacteria isolated .20 3. 4. 1 Selective medium optimization results .20 3. 4. 2 Gram stain results .21 3. 4. 2. 1 Solid culture stain results .21 3. 4. 2. 2 Gram-positive cocci broth culture stain results .22 3. 4. 3 Various characteristics of bacterial culture results .22 3. 4. 4 Hidden normal milk and milk mastitis bacteria types and distribution of .22Discuss .231. Cows Mastitis epidemiology and hazard analysis .232. Subclinical mastitis diagnosis method .24Conclusion .241. Epidemiological survey found .242. Several diagnostic methods through the comparison .25Thanks .25References .25综述 本实验针对几个大中型奶牛场和个体养殖户，进行流行病学调查，研究隐性型乳房炎的发病率;对隐性乳房炎的常用方法的效果进行了比较，选择出效果最好的诊断方法，对隐性型乳房炎乳汁和正常乳汁进行细菌分离鉴定、细菌计数和隐性乳房炎主要分离菌的体外药物敏感试验的研究，探讨奶牛隐性型乳房炎的发病情况、主要致病菌的类型、抗生素对乳房炎的主要致病菌的抑制效果，比较正常乳汁和隐性乳房炎乳汁分离菌的种类、所占比例和数量，科学地指导临床用药，治疗乳房炎疾病。通过本次调查发现，隐性乳房炎感染率的高低与饲养管理、卫生条件、病原菌致病力强弱等因素均有直接的关系，大型奶牛场的管理水平和卫生条件较好，感染率较低;而农户散养的奶牛由于饲养管理、卫生条件差，环境性病原菌大量滋生，引起隐性乳房炎的感染率较高。奶牛乳房炎特别是隐性乳房炎，使奶牛业蒙受重大经济损失。在一个牛群中，大多数乳房炎(大约90%)是隐性乳房炎，造成经济损失的主要是隐性乳房炎，其损失占母牛每年总生产能力的1011960隐性乳房炎诊断方法主要分为直接法和间接法，直接法在我国最常用的为体细胞计数法，而间接法主要采用尼氏现场试验、嗅磨香草酚蓝试验、加州乳房炎试验。本实验通过对相同分别用澳康香草酚兰试验(B. T. B) , N. F. T,氯化物硝酸银试验、C. M.T法和体细胞直接计数法进行检测，比较澳赓香草酚兰试验、N. F. T,氯化物硝酸银试验和C.M.T法与体细胞直接计数法的符合率。经过比较发现，B. T. B, N. F. T和氯化物硝酸银法与体细胞直接计数法的隐性乳房炎阳性乳区检查数符合率较低，差异显著(P0. 05)，是能和体细胞计数法完全相符的一种适用于临床现场快速诊断的方法，其有价廉、操作简单，快速等优点。总之，C. M. T试验结果与体细胞直接计数法符合率达10096，可以作为一种临床快速诊断方法使用，而其他几种方法的阳性乳区检出率明显偏低，可以作为辅助方法，不宜中独使用。对本实验所分离出的9种主要致病菌做了9大类巧种常见药物的体外纸片法药敏试验，结果显示，对于葡萄球菌属的致病菌，青霉素类、哇诺酮类、头饱菌素类、大环内酷类、利福霉素类和氨基糖普类中的庆大霉素、卡那霉素、新霉素等药物的效果比较好;对于链球菌属的致病菌，头饱菌素类、氨基糖营类中的新霉素、哇诺酮类中的丙氟呱酸等药物的效果较好。本实验同时用10种药物做试管法体外药敏试验，并从定量角度，计算出每种药物对不同细菌的最小抑菌浓度(MIC，结果表明不同的判断方法，结果差异较大。由于除对照管外每只试管均接种细菌，未达到杀菌作用的药物浓度，其肉汤进行培养仍然可见细菌的生长。而葡萄糖酚红肉汤法则只要有细菌生长就会发生颜色的变化。所以相比较而言，葡萄糖酚红肉汤法的结果更接近最小抑菌浓度，而肉汤培养法的结果则更接近杀菌浓度。纸片法和试管法药敏试验分别从定性和定量的角度，分析了各种分离细菌的抗药性，为临床预防和治疗乳房炎提供资料。实验结果说明:各种快速诊断方法中以C.M.T效果最佳，所研制的Q. M. T诊断试剂与C.M.T和体细胞计数的阳性乳区检出符合率很高，差异不显著(P0. 05 )。引起本地区奶牛隐性型乳房炎的主要致病菌类型葡萄球菌和链球菌，抗生素中丙氟呱酸、新霉素、先锋霉素V的抑菌效果较高。 摘要 本实验通过流行病学调查，研究奶牛临床型和隐性型乳房炎的感染情况:比较几种奶牛隐性乳房炎临床诊断方法，寻求最适于本地区的诊断方法;并对隐性型乳房炎乳汁和正常乳汁进行细菌分离鉴定、菌落计数和主要分离菌的体外药物敏感试验的研究，比较正常乳汁和隐性乳房炎乳汁分离菌的种类、数量和所占比例，探讨引起奶牛隐性乳房炎主要致病菌的类型，研究抗生素对乳房炎的主要致病菌的抑制效果，科学地指导临床用药，治疗乳房炎。通过对临床常用的快速诊断方法的效果进行比较，结果表明B. T. B, N. F. T和氯化物硝酸银法与体细胞直接计数法的隐性乳房炎阳性乳区检查数符合率较低，差异性显著(P0. 05);并对诊断液的稳定性进行了检测，结果表明Q.M.T诊断液稳定性良好。 本实验对99份正常乳汁和155份隐性乳房炎乳样进行细菌的分离培养，结果正常乳样中共分离到细菌184株，隐性型乳房炎乳样共分离到各种细菌335株，其中隐性乳房炎的分离菌主要为葡萄球菌和链球菌，所占比例为81. 7900 药敏试验结果表明，喳诺酮类、头抱菌素类和氨基糖营类药物的效果较好。每种药物对不同细菌的最小抑菌浓度(M工C)差异较大。关键词:奶牛；隐性乳房炎；诊断方法；细菌；分离；鉴定；药敏试验 The diagnostic method and bacteriological study of subclinical mastitis for dairy cow Abstract: The infection of clinical mastitis and subclinical mastitis were researched through epidemiology investigation in several large and middle scale cattle farm of Guizhou Province. Compared several diagnosis method for dairy cow subclinical mastitis in order to find the best method. The bacteria causing clinical mastitis were isolated and identified. The reasch of drug susceptibility testing was also operated in vitro. And reseached the category of bacterium, the number of bacterium and drug susceptibility for these bacterium of normal and subclinical mastitis milk to discuss the main type of bacterium in subclinical milk, the best antibiotic for the bacterium. In a certain herd (310 cows), the incidence of the subclinical and clinical mastitis was collected by an Epidemiology investigation. As the investigation showed, the cow infection rate of clinical mastitis is 2.26% (7 of 310); that of subclinical mastitis is 57.78% (181 of 310). The GVFBXquarter infection rate of subclinical mastitis is 30.99% (371 of 1197). Compared several clinical fast diagnosis methods, the consequence indicates the difference is remarkable (P0.05) between B.T.B, N.F.T, chlorine nitric acid silver test and SCC，But the accordant rate between C.M.T and SCC is 100%. The subclinical mastitis diagnosticum一Q.M.T which is compounded by one kind of anion surface active agent is as good as C.M.T and SCC in the diagnosis of subclinical mastitis. 184 bacterial strains were isolated from 99 normal milk samples of subclinical mastitis,and 335 bacterial strains were isolated from 155 milk samples of subclinical mastitis,the main bacterial strains is staphylococci and streptococci(2741335,81.79%). The drug susceptibility testing indicates that Quinotones, Cephazolins and Aminoglycosides have good inhibitory effection. The difference of the MIC is big for each kind of bacteria to different drugs. Key Words: dairy cow； subclinical mastitis； diagnosis method；bacterium； separate； checkup；drug susceptibility testin 引言 奶牛乳房炎(Mastitis)是奶牛乳腺受到物理、化学、微生物等因素刺激所引起的奶牛乳房的炎症，表现为乳汁发生理化性质及细胞学性质的变化、乳腺组织发生病理学变化，是奶牛的常发病之一。根据乳房和乳汁有无临床可见的变化将乳房炎分为临床型乳房炎(Clinical Mastitis)和隐性型乳房炎(Subclinical Mastit.is)o隐性乳房炎表现为患牛的乳房和乳汁肉眼观察无异常，需要通过体细胞计数或借助其他诊断方法才能发现的乳房炎症。国外对奶牛乳房炎的研究己有一百多年的历史，取得了较大的成果，我国对乳房炎的研究起步比较晚，八十年代才开始进行较深入的研究。奶牛乳房炎不仅对奶牛养殖业的经济效益带来巨大损失，而且有些乳房炎病原菌易产生各种有害产物，引起乳产品的污染，对人类健康带来巨大危害。1奶牛乳房炎的流行病学与危害情况 1. 1奶牛乳房炎的流行病学 据国际奶牛联合会统计，20世纪70年代，奶牛临床型乳房炎患病率约2%,隐性乳房炎病牛高达50% (Heringst.ad, 2000)。我国乳房炎的发生率更高，一般在20%-70%。中国农科院中兽医研究所对西北、华北、东北、华南地区22个城市32个奶牛场1037头成年泌乳牛进行临床型乳房炎病因及发病情况调查，并对其中5个地区20个奶牛场3384头泌乳牛用兰州乳房炎实验(L. M. T)进行隐性乳房炎调查，结果表明临床型乳房炎发病率为33. 41%，隐性乳房炎奶牛头阳性率为73. 9190，阳性乳区检出率为44. 7490(潘虎，1996)。据蒋次升(1988)报道，北京和天津地区的隐性乳房炎阳性率为50%-80%;兰州和太原的隐性乳房炎的发病率为50%左右。王应安等(1988)的调查结果表明青海省某奶牛场隐性乳房炎的乳头患病率和乳区患病率分别为54. 08%和25. 8990。多位研究人员(孙福先，1996;萧乾庆，1997;单志贵等，1996;杨章平，1998:李国江，1998)报道，我国奶牛隐性乳房炎头阳性率为46. 4%-85. 7%。双金等(1998)对内蒙古大黑河奶牛场泌乳牛283头次1078个乳区检测出隐性乳房炎为61. 84%综上所述，奶牛乳房炎在世界范围内感染率都很高，在我国奶牛乳房炎的感染情况也相当严重，乳房炎感染类型主要以隐性型为主。1. 2奶牛乳房炎的危害 乳房炎对奶牛养殖业、牛奶的营养价值和食品安全带来巨大的危害。首先乳房炎引起严重的经济损失，国外对奶牛乳房炎引起的经济损失的传统估计是根据奶产量的降低，奶的丢失、药费开支、兽医费用和劳动力费用等的增加来统计。据报道，英国每年治疗奶牛乳房炎的平均花费为每头奶牛187英镑，美国每年用于每头奶牛乳房炎的花费为177-182美元，芬兰、挪威、瑞典每年因乳房炎问题淘汰的奶牛占淘汰奶牛的35%, 19%和22%(储明星等，2002)，可见乳房炎的发生给奶牛养殖业带来的经济损失巨大。在这些经济损失中，由于产奶量的降低引起的损失占70%，由于患病而使奶牛提早淘汰占1490，废弃乳汁占7%，治疗及兽医费用占8%等，而且经济损失主要来自于隐性乳房炎。其次，乳房炎使乳的品质大大下降，乳中含有丰富的蛋白质、脂肪和糖类，在乳房炎疾病期间，致病菌损害乳腺的分泌细胞，引起乳腺组织损伤，某些营养成分丢失，使营养成分不全而降低牛奶的保健作用(赵兴绪，2002) o隐性乳房炎乳汁中氨基酸总量也由平均2. 2387g/ 100m1(健康乳)降低了21%，其中蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸5种必需氨基酸及组氨酸、精氨酸显著降低;乳糖、酪蛋白、脂肪、Ca, P3, K等有益成分的含量均降低或明显降低;而免疫球蛋白、酉旨酶、炎性因子、致病菌及其产生的毒素等有害成分的含量则增加，热稳定性降低(赵兴绪，2002)。此外，奶牛患有乳房炎疾病后所产的乳汁中含有大量的炎性因子、致病菌及其产生的毒素(陈家璞，1992)，如果饮用了消毒不严或搀杂了含有致病菌的牛奶，则会使人感到身体不适，严重者可诱发疾病。在治疗乳房炎疾病过程中出现滥用抗生素，有些经营者不淘汰治疗期间的患牛乳汁，造成抗生素在牛奶中残留，引起食用者发生过敏反应，尤其对老年人和婴幼儿危害会更大(胡松华，1999 ) 。2乳房炎的分类及临床症状2. 1国内对乳房炎的分类 国内对乳房炎的分类方法主要有两种方法(郭祥君，2000) 2. 1. 1根据其病程长短和发病情况分为最急性型乳房炎、急性型乳房炎、亚急性型乳房炎、慢性型乳房炎和隐性型乳房炎。 最急性型乳房炎:常为一个乳区突然发生，有明显的全身症状，产奶下降90%左右，乳汁呈水样。 急性型乳房炎:全身症状不明显，体温可能略有升高，但局部红、肿、热、痛明显，产乳量下降。 亚急性型乳房炎:乳房没有红、肿、热、痛及全身症状，乳中有凝块或絮状物。 慢性型乳房炎:奶牛产奶量降低，触诊乳房内有硬节(块)，乳头常有索状硬条，乳汁放置一段时间后，上层为水样，下层为沉淀物。由于反复发作，乳房逐渐萎缩，有的变为脓肿; 隐性型乳房炎:乳房触诊和乳汁肉眼观察均无异常，只有实验室检查才能查出乳汁的炎症变化。2.1.